賀安娜，楊 曦，梁 娟，2，周 婉，印麗娟

(1．懷化學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，湖南 懷化 418000；2.民族藥用植物資源研究與利用湖南省重點實驗室，湘西藥用植物與民族植物學(xué)湖南省高校重點實驗室，湖南 懷化 418000)

虎耳草(Saxifragastolonifera)為虎耳草科(Saxifragaceae)多年生草本植物，又名石荷葉、老虎耳等[1]，該草起源于北溫帶[2]，我國主要分布于華東、中南、西南各省區(qū)。民間以全草入藥，具有祛風(fēng)、清熱、解毒等功效[3]，較高含量的沒食子酸和巖白菜素是其發(fā)揮藥效的主要次生代謝產(chǎn)物[4]。有研究表明，虎耳草中主要活性成分沒食子酸等有機酸類，具有一定的抗雄性激素作用，可調(diào)控前列腺細(xì)胞的生長與凋亡[5]，有抑制前列腺癌的作用[6]。作為開發(fā)利用前景很好的虎耳草，人工栽培方面報道尚少，本課題組對虎耳草不同光溫處理下虎耳草的光合特性進行了研究，發(fā)現(xiàn)不同溫度處理下，沒食子酸含量與光合速率及蒸騰速率呈極顯著正相關(guān)[7]。

虎耳草分布廣泛，常生于森林邊緣、巖坡石隙[8]，其原生境的土壤類型也較豐富，常著生在薄腐殖質(zhì)層的巖石上，森林邊緣的暗棕色土壤也可見其生長，筆者收集資源實地考察時，發(fā)現(xiàn)不同土壤生境下虎耳草株葉形態(tài)有很大差異。這種差異與土壤的物理及化學(xué)性質(zhì)有關(guān)，有研究表明，土壤的養(yǎng)分不僅影響植物直接的光合作用及生長發(fā)育[9]，也影響次生代謝產(chǎn)物的形成，從而影響藥材品質(zhì)[10]。人工種植虎耳草常在單一的土壤類型上進行，選擇合適的土壤條件對虎耳草的人工栽培非常重要，本文考慮虎耳草原生境土壤條件及南方的主要種植土類型，選取了黑色腐殖土、暗棕色粘性土和棕黃色粘性土3種不同種植土壤，研究不同土壤類型種植條件下虎耳草光合特性及藥用成分的差異，旨在為虎耳草人工種植提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料虎耳草來源于懷化學(xué)院生物園，經(jīng)曾漢元教授鑒定為S.stolonifera。2014年1月選取黑色腐殖土(南方混交林下腐殖土壤)、暗棕色粘性土(南方主要種植土壤)和棕黃色粘性土(南方山地土壤)，去表層后，取土深0～15 cm左右，分別做成80 cm×100 cm的土壤樣方，采用隨機區(qū)組設(shè)計，每種土壤類型重復(fù)3次。選取生長健壯、長勢一致的虎耳草為材料，在每個樣方上各種植20株，行株距為20 cm×20 cm。虎耳草為陰生植物，根據(jù)前期研究結(jié)果[11]，用一層黑色遮蔭網(wǎng)(透光率50%)進行遮蔭處理，遮蔭網(wǎng)設(shè)在離地面1.5 m高處。2014年4月，開始測定各項數(shù)據(jù)。

1.2 測定方法

1.2.1 土壤理化性質(zhì)測定

材料種植前用5點法取5～10 cm土層土壤，pH值采用2.5 ∶1 的水土比，用pH計測定；環(huán)刀取樣稱重，測定最大持水量；有機質(zhì)測定采用重鉻酸鉀容量法；堿解氮采用堿解蒸餾法測定；有效磷采用NaHCO3浸提-鉬藍比色法測定；速效鉀采用NH4OAc浸提-火焰光度法測定。

1.2.2 虎耳草氣體交換測定

虎耳草葉片的氣體交換采用LI-6400便攜式光合儀(美國)測定，瞬時氣體交換測定選擇晴天的9:00進行，采用自然光照，每個土壤類型測10片葉。光響應(yīng)曲線的測定利用儀器自帶程序，于晴天9:00～11:00進行，溫度、CO2濃度等環(huán)境因子采用自然條件。光量子密度(PPED)設(shè)為2 000、1 800、1 500、1 200、1 000、800、600、400、200、150、100、50、20、0 μmol·m-2·s-1，由儀器配備的紅藍光源(6400-02B LED光源)產(chǎn)生，根據(jù)Pn-PPED曲線的初始斜率(PPED < 250 μmol·m-2·s-1)計算表觀量子效率(AQY)。參照Bassman和Zwier的方法[12]計算光飽和點、光補償點及最大光合速率。

1.2.3 葉綠素?zé)晒鈪?shù)測定

用錫箔紙包裹好葉片，使葉片經(jīng)30 min暗適應(yīng)，取下錫箔紙的同時迅速將葉片置于LI-COR 6400-40葉綠素?zé)晒馊~室中，測定原初熒光(F0)及暗中最大熒光(Fm)。打開葉室，將葉片置于光下活化30 min，設(shè)定儀器活化光，測穩(wěn)態(tài)熒光產(chǎn)量(Fs)、最大熒光(Fm′)及最小熒光(F0′)。通過公式計算：qP=(Fm′-Fs)/(Fm′-F0′)；qN=(Fm-Fm′)/(Fm-F0)；ΦPSⅡ=(Fm′-Fs)/Fm′；ETR=PPFD × ΦPSⅡ× 0.84 × 0.5。式中，qP為光化學(xué)猝滅系數(shù)， qN為非光化學(xué)猝滅系數(shù)，ΦPSⅡ為實際光化學(xué)反應(yīng)速率，ETR為電子傳遞速率。

1.2.4 沒食子酸和巖白菜素含量測定

采集虎耳草全草，洗凈干燥至恒重，粉碎并通過0.12 mm篩。稱取1.0 g虎耳草粉末，加入甲醇，料液比為1∶25(g∶mL)，超聲波提取35 min，重復(fù)提取1次，合并兩次提取液。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮提取液至約5 mL，再用甲醇定容至25 mL，經(jīng)0.22 μm針孔濾膜過濾。使用LC-20AT高效液相色譜儀(日本)測定巖白菜素和沒食子酸含量，色譜柱為Agilent Eclipse XDB-C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)。流動相：甲醇-0.1 % 磷酸溶液(73∶29)；流速：1.02 mL·min-1；檢測波長：272 nm；柱溫：25 ℃；進樣量：20 μL。按外標(biāo)法以峰面積積分值計算巖白菜素和沒食子酸含量。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

利用Excel 2003及SPSS 19.0統(tǒng)計軟件對所測數(shù)據(jù)進行分析與繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同土壤理化性質(zhì)比較

除黑色腐殖土外，其他兩種土壤的pH值都偏酸(表1)，棕黃色粘性土pH值顯著最低，為6.54；最大持水量也是棕黃色粘性土最低，僅39.3%。黑色腐殖土的有機質(zhì)含量最高，為17.5%，棕黃色粘性土最低，僅為0.53%，三者差異均達顯著水平。黑色腐殖土中的堿解氮含量顯著高于其他兩種土壤，為33.2%；有效磷及速效鉀則以暗棕色粘性土最高。

表1 不同土壤的理化性質(zhì)

注：表內(nèi)數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(n=3),表5同；同列小寫字母表示0.05水平差異顯著。下同。

2.2 不同土壤種植條件下虎耳草葉片氣體交換參數(shù)比較

3種土壤條件下種植的虎耳草凈光合速率差異顯著(表2)，其中黑色腐殖土種植的虎耳草凈光合速率最高，為5.03 μmol·m-2·s-1，氣孔導(dǎo)度、蒸騰速率及水分利用率也顯著高于其他兩種土壤。

表2 不同土壤種植條件下虎耳草葉片氣體交換參數(shù)

注：表內(nèi)數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(n=10)。表3、表4同。

光量子密度150 μmol·m-2·s-1以下，3種土壤種植條件下虎耳草葉片光合速率增長很快，幾乎呈直線(圖1)；光量子密度為1 200 μmol·m-2·s-1以上時，光合速率趨于平緩。黑色腐殖土種植的虎耳草光合速率一直高于暗棕色粘性土和棕黃色粘性土。

光補償點的高低可以作為判斷植物在低光照強度條件下能否生長的標(biāo)志，光飽和點反映了植物利用強光的能力。黑色腐殖土種植的虎耳草表觀量子效率顯著最高(表3)，為0.046 μmol·m-2·s-1；3種土壤上種植的虎耳草光補償點差異顯著，依次為：暗棕色粘性土﹥棕黃色粘性土﹥黑色腐殖土，說明黑色腐殖土上種植的虎耳草利用弱光能力最強。3種土壤種植的虎耳草光飽和點變化不顯著，但最大凈光合速率差異顯著，其中黑色腐殖土顯著最高，為6.79 μmol·m-2·s-1。

圖1 不同土壤種植條件下虎耳草葉片光合-光強響應(yīng)曲線的比較

2.3 不同土壤種植條件下虎耳草葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)比較

3種土壤種植條件下虎耳草葉片的Fv/Fm值無顯著差異(表4)，說明光系統(tǒng)Ⅱ反應(yīng)中心原初光能轉(zhuǎn)換效率差異不顯著。棕黃色粘性土種植條件下虎耳草葉片的Fv/F0值顯著最低，表明該條件下虎耳草葉片從捕光葉綠素a/b蛋白復(fù)合體(LHCP)到光系統(tǒng)Ⅱ的光能傳遞能力最弱。光化學(xué)猝滅系數(shù)和非光化學(xué)猝滅系數(shù)兩個參數(shù)反映葉片對激發(fā)能的利用情況，黑色腐殖土種植條件下虎耳草葉片的qP值比另兩種土壤顯著要高。

表4 不同土壤種植條件下虎耳草葉綠素?zé)晒鈪?shù)

注：Fv=Fm-F0,為可變熒光；Fv/Fm為PSⅡ光化學(xué)的最大量子產(chǎn)額；Fv/F0是PSⅡ的潛在光化學(xué)活性。

不同土壤種植條件下虎耳草葉片實際光化學(xué)反應(yīng)速率和電子傳遞效率都有顯著差異，都以黑色腐殖土種植的最高，棕黃色粘性土種植的最低。

2.4 不同土壤種植條件下虎耳草有效成分含量比較

不同土壤條件下種植的虎耳草生物產(chǎn)量有較大差異，黑色腐殖土上種植得到的干重顯著高于其他兩者。沒食子酸和巖白菜素含量也均有顯著差異，表現(xiàn)為黑色腐殖土上種植的虎耳草沒食子酸及巖白菜素含量最高，分別為0.821和2.98 mg·g-1(表5)，因此，黑色腐殖土上得到的虎耳草有效成分生物量最高，其次為暗棕色粘性土。

表5 不同土壤種植條件下虎耳草沒食子酸及巖白菜素含量

2.5 相關(guān)性分析

土壤理化性質(zhì)中，pH值、有機質(zhì)含量與虎耳草的光合參數(shù)及藥用成分含量顯著或極顯著正相關(guān)(表6)，堿解氮與瞬時凈光合速率及巖白菜素含量顯著和極顯著正相關(guān)，最大持水量、有效磷、速效鉀與光合參數(shù)及藥用成分含量呈正相關(guān)，其中，最大持水量與巖白菜素含量達顯著相關(guān)水平，其余未達顯著水平。不同類型土壤中，土壤有機質(zhì)含量的增加伴隨著pH值的升高，同樣，有機質(zhì)含量升高，堿解氮的含量也隨之升高，但與有效磷及速效鉀未呈現(xiàn)這種規(guī)律。

表6 土壤理化性質(zhì)與虎耳草葉片光合參數(shù)及藥用成分含量的相關(guān)系數(shù)

注：*表示顯著相關(guān)(P<0.05)，**表示極顯著相關(guān)(P<0.01)。

3 結(jié)論與討論

據(jù)報道，土壤有機質(zhì)含量與pH值之間的關(guān)系并不一致，甚至有許多矛盾[13]。本文中選用的3種我國南方主要種植土壤，其pH值隨有機質(zhì)含量的增加而升高，這可能與我國南方的氣候、土壤質(zhì)地及微生物種群結(jié)構(gòu)和數(shù)量有關(guān)。南方種植地主要為酸性土壤，碳礦化作用弱[14]，有機質(zhì)含量較低，在微生物對土壤有機物的分解過程中，土壤微團聚體含量升高，土壤板結(jié)和通透性得以改善[15]，表現(xiàn)為最大持水量升高；同時有機質(zhì)的增加，也改善了土壤的酸堿度，使pH值稍有上升，氮含量也受有機質(zhì)的驅(qū)動而升高[16]，有效磷、速效鉀含量則未呈現(xiàn)該規(guī)律。

植物在不同土壤類型下種植光合作用差異較大[17]。光補償點和光飽和點是植物利用光強能力的重要指標(biāo)。黑色腐殖土上種植的虎耳草最大凈光合速率最高，同時該處理上種植的虎耳草表觀量子效率最高，光補償點最低，說明該土壤上種植的虎耳草對強光及弱光的利用能力都最強。Fv/F0表示光反應(yīng)中心光系統(tǒng)Ⅱ的潛在活性，通過測定虎耳草葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)發(fā)現(xiàn)，黑色腐殖土與暗棕色粘性土的Fv/F0值要顯著高于棕黃色粘性土。光化學(xué)猝滅系數(shù)和非光化學(xué)猝滅系數(shù)兩個參數(shù)反映葉片對激發(fā)能的利用情況?；⒍萑~片的qP值在黑色腐殖土下顯著高于其它兩種處理，且虎耳草葉片光系統(tǒng)Ⅱ反應(yīng)中心的開放比例最高，虎耳草葉片實際光化學(xué)反應(yīng)速率和電子傳遞效率都顯著最高。葉綠素?zé)晒鈪?shù)值說明黑色腐殖土種植條件下虎耳草葉片光系統(tǒng)Ⅱ反映中心開放程度、光化學(xué)效率最高，電子傳遞速率也最快。

許多研究表明，氮是植物所需營養(yǎng)的中心元素和活性元素，氮營養(yǎng)是影響植物生長和次生代謝的重要環(huán)境因素之一，也是葉綠素的組成成分之一，葉片中的氮超過半數(shù)將分配到葉綠體中參與光合作用[18-19]。但土壤中的氮素含量應(yīng)適宜，高氮對植物光合作用促進減弱，甚至有抑制作用[20]。試驗所選擇的3種土壤中，黑色腐殖土的堿解氮含量顯著最高，有效磷和速效鉀的含量則略低于暗棕色粘性土，堿解氮與凈光合速率顯著正相關(guān)，在黑色腐殖土上種植的虎耳草光合作用能力表現(xiàn)最強，說明土壤中氮的含量對虎耳草光合作用的影響更大，且該氮含量在虎耳草適應(yīng)范圍之內(nèi)。不過，虎耳草的最適氮素水平仍需進一步試驗探討。

土壤pH值和土壤肥力會影響植物外觀形態(tài)、物質(zhì)代謝、生長發(fā)育以及品質(zhì)和產(chǎn)量等方面[21]。種植藥用植物不僅要考慮藥材的生物產(chǎn)量，更要考慮藥材的有效成分含量，即品質(zhì)[22-23]。本試驗選取的黑色腐殖土壤中氮素及有機質(zhì)含量顯著高于其他兩種土壤，筆者觀察發(fā)現(xiàn)，該土壤處理下的虎耳草生長最好，葉片大而飽滿，顏色翠綠，匍匐莖發(fā)達，試驗測定產(chǎn)量也顯著最高，有機質(zhì)含量、堿解氮與虎耳草葉中的藥用成分含量均顯著正相關(guān)。氮素可以促進植物地上部分的生長，獲得高產(chǎn)，但高量氮素也容易造成植株徒長，對于根莖類藥材而言還可使經(jīng)濟效益下降，甚至減產(chǎn)[24]?；⒍菔菧\根植物，具大量匍匐莖，雖用全草入藥，但地下部分產(chǎn)量很低，主要依靠地上的葉入藥。因此，地上部分的長勢可直接影響虎耳草的產(chǎn)量。前期研究結(jié)果也顯示，高光合作用有利于虎耳草的生長發(fā)育及有效成分的積累[7]，本試驗中，黑色腐殖土處理下的虎耳草巖白菜素及沒食子酸含量都顯著最高，該氮素水平及有機質(zhì)含量對虎耳草品質(zhì)形成有良好的促進作用。

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