史長鑫，何曉東，陳曉欽，王 杰，樊永紅

(新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830046)

鹽穗木在新疆是一種存活率比較高的植物，其根部存在耐鹽堿的微生物。土壤鹽堿化問題是目前全球最嚴(yán)重的環(huán)境問題之一，大面積土地沒有得到合理開發(fā)利用發(fā)展成鹽堿地，耕地不合理的灌溉和種植下逐漸生成新的次生鹽堿化，土壤鹽堿化進(jìn)程加速[1]。利用微生物改良鹽堿地的不足在于，菌株被接入土壤以后的存活問題，如何讓菌株適應(yīng)土壤的生存環(huán)境，怎樣更好的降鹽堿，這是本研究需要解決的問題。鹽堿地改良是一項(xiàng)復(fù)雜而艱巨的工作，而在當(dāng)今提倡生態(tài)效益為重的前提下，生物改良措施已成為研究的熱點(diǎn)[2-3]。我國鹽堿地面廣量大，改造治理及合理開發(fā)利用這些資源是我國農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要途徑之一，也對改善生態(tài)環(huán)境，推動(dòng)區(qū)域經(jīng)濟(jì)、社會(huì)和生態(tài)可持續(xù)發(fā)展具有重要意義[4-5]。本研究的目的在于篩選出一種高耐鹽耐堿的菌株，把菌株接入土壤中從而降低土壤的鹽堿率，有利于植株的生存[6-7]。當(dāng)前,土壤鹽堿化和次生鹽堿化的加劇與人類大規(guī)模的水土資源開發(fā)方式和生產(chǎn)技術(shù)水平有著密切的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

于新疆和田地區(qū)于田縣鹽堿地鹽穗木根系周圍采集土壤樣品，立即裝在自封口無菌的塑料袋中，并將土樣保存于冰箱內(nèi)，部分土樣送新疆農(nóng)科院微生物所進(jìn)行土壤理化特性測定。

1.2 方法

1.2.1 菌株分離純化

配置牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基300 mL，用NaOH調(diào)pH，滅菌，倒平皿；稱1 g土樣于99 mL無菌水中搖勻[8]，再用無菌水稀釋，選用10-6、10-7、10-8稀釋度土壤懸液，將0.2 mL的菌懸液放到帶有培養(yǎng)基的平皿中涂布，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d后觀察并記錄結(jié)果，將長出的單個(gè)菌落分別挑取少數(shù)菌苔接種到對應(yīng)的斜面上進(jìn)行純培養(yǎng)[9]。

1.2.2 耐鹽堿性分析

耐鹽性實(shí)驗(yàn)：配制鹽濃度分別為4%、6%、8%、10%、12%的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。將篩選出的菌進(jìn)行耐鹽性實(shí)驗(yàn)，培養(yǎng)后觀察細(xì)菌生長情況[10]。

耐堿性實(shí)驗(yàn)：配置鹽濃度為8%，pH值為9、10、11、12培養(yǎng)基，倒板，接分離的菌株，培養(yǎng)2～3 d觀察結(jié)果。篩選出3株耐性好的菌進(jìn)行耐鹽堿性實(shí)驗(yàn)。

耐鹽堿性的復(fù)合實(shí)驗(yàn)：配置鹽濃度12%，pH值為11、12的培養(yǎng)基，倒板，接上述3株菌進(jìn)行培養(yǎng)，2～3 d觀察結(jié)果。

1.2.3 菌株的生理生化實(shí)驗(yàn)

從所分離的細(xì)菌中選擇耐鹽堿性能高的D8做生理生化的鑒定。所采用的方法參照《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》[11]和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[12]上有關(guān)細(xì)菌的生理生化測定部分。具體有革蘭氏染色、電鏡觀察、石蕊牛奶實(shí)驗(yàn)和油脂水解實(shí)驗(yàn)、葡萄糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)、乳糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)、蔗糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)、過氧化氫酶實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 Biolog實(shí)驗(yàn)

1.2.4.1 原理 利用微生物對不同碳源代謝率的差異，針對每一類微生物篩選95種不同碳源，配合四唑類顯色物質(zhì)(如TTC、TV)，固定于96的孔板上(A1孔為陰性對照用GN2板)，接種菌懸液后培養(yǎng)一定時(shí)間，通過檢測微生物細(xì)胞利用不同碳源進(jìn)行新陳代謝過程中產(chǎn)生的氧化還原酶與顯色物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)而導(dǎo)致的顏色變化(吸光度)以及由于微生物生長造成的濁度差異(濁度)，與標(biāo)準(zhǔn)菌株數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，即可得出最終鑒定結(jié)果。

1.2.4.2 步驟 用Biolog專用培養(yǎng)基將純種擴(kuò)大培養(yǎng)。按要求配制一定濁度(細(xì)胞濃度)的菌懸液。將菌懸液接種至微孔鑒定板(Microplate)，培養(yǎng)一定時(shí)間。將培養(yǎng)后的鑒定板放入讀數(shù)儀中讀數(shù)，與數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)比較給出鑒定結(jié)果[13]。

1.2.5 16S rRNA測序分析和系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

a.將分離純化得到的菌株送測序公司測序。

b.將鑒定菌的16S rRNA序列遞交GenBank，用Blast軟件搜索相似的16S rRNA,然后一起構(gòu)樹[14]。

c.采用能反應(yīng)分支長度的軟件(如NJ法)，并用Boostrap值分析分支聚類的穩(wěn)定性[15]。

d.用國際較為通用的一些構(gòu)樹方法，如Neighbour-Joining等，結(jié)果更可靠，更直觀[16-17]。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤樣品理化測試結(jié)果

表1為土樣理化測試結(jié)果，由表1可以看到，兩種土壤的堿性都比較高，鹽性是第二種土壤中含量比較高，所以兩種土壤都屬于鹽堿土。

表1 土樣理化測試結(jié)果

2.2 分離純化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)篩選培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)差異，分別得到20株菌。

圖1 部分分離純化菌落形態(tài)

2.3 耐鹽堿分析結(jié)果

對分離純化出的耐鹽性能比較好的3株菌進(jìn)行不同鹽度、不同堿度的耐受性實(shí)驗(yàn)，新疆嗜(耐)鹽堿細(xì)菌生長鹽度及pH較寬泛，最適生長鹽度為10%左右，pH值多為8～10。結(jié)果有3株菌較為耐鹽堿性，再進(jìn)行高耐鹽、耐堿的復(fù)合實(shí)驗(yàn)，并選出最耐鹽堿菌株D8。

表2部分菌株在不同鹽濃度平板上的生長情況

菌株鹽濃度(%)4681012D7+++++++++++D8+++++++++++++++D9+++++++++++++

注：“+++”表示菌落在此鹽堿度培養(yǎng)基上生長旺盛，“++”表示菌落在此鹽堿度培養(yǎng)基上生長較多，“+”表示菌落在此鹽堿度培養(yǎng)基上生長較少，下同。

表3部分菌株在高鹽高堿下平板生長情況

pHD7鹽濃度(%)D8鹽濃度(%)D9鹽濃度(%)梯度81281281211+++++++++++++12--++--

注：“-”表示菌落在此鹽堿度培養(yǎng)基上不生長。

2.4 生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

革蘭氏染色結(jié)果為陰性，通過掃描電鏡觀察菌體的形態(tài)，D8菌的表面粗糙呈短桿狀；石蕊牛奶實(shí)驗(yàn)和油脂水解實(shí)驗(yàn)中反應(yīng)都為陰性，在葡萄糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中反應(yīng)為陽性不產(chǎn)氣，在乳糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中反應(yīng)為陰性，在蔗糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中反應(yīng)為陽性不產(chǎn)氣；在過氧化氫酶實(shí)驗(yàn)中反應(yīng)為陰性不產(chǎn)氣。

表4 D8耐鹽菌株的部分生理生化特征

圖2 D8菌的革蘭氏染色

圖3 D8的電鏡照片

2.5 Biolog實(shí)驗(yàn)結(jié)果

結(jié)果鑒定為Cosenzaeamyxofaciens(腸桿菌科，變形菌屬)的DIST值為9.353,可信度較高。

圖4 D8菌Biolog結(jié)果鑒定

2.6 16S rRNA基因測序分析和系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建結(jié)果

核酸序列(BlastN)的結(jié)果與鹽單胞菌屬序列高度相似，初步判斷D8為鹽單胞菌屬,系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果與序列號為JN903249的菌株相似性較高，D8鑒定為太平洋鹽單胞菌[13，15]。

表5 核酸序列(blastN)的比對分析

圖5 系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建結(jié)果

3 結(jié)論與討論

本實(shí)驗(yàn)對鹽穗木根際土壤中的耐鹽堿細(xì)菌進(jìn)行了分離純化及篩選，篩選得到20株菌株；通過分別或同時(shí)調(diào)整鹽濃度和pH，最終篩選到耐鹽堿菌株D8。通過對D8菌株進(jìn)行革蘭氏染色、顯微鏡照相以及通過電鏡掃描、生理生化實(shí)驗(yàn)對菌株進(jìn)行了初步的鑒定；接著做了Biolog測定以及通過測定菌株的DNA，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)行了菌種的鑒定，生理生化實(shí)驗(yàn)做的種類較少，只能初步鑒定其種屬關(guān)系為產(chǎn)堿桿菌屬，而Biolog結(jié)果為Cosenzeaemyxofaciens(腸桿菌科，變形菌屬)，16S rRNA測序分析和系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建結(jié)果D8為Halomonaspacifica(太平洋鹽單胞菌)。經(jīng)查詢，16S rRNA測序的太平洋鹽單胞菌和Biology結(jié)果鑒定不一樣，原因可能是：一是Biolog鑒定中存在操作不當(dāng)，導(dǎo)致Biolog結(jié)果鑒定不準(zhǔn)確。二是細(xì)菌未完全進(jìn)入指數(shù)期，可能導(dǎo)致Biolog數(shù)據(jù)庫調(diào)出的結(jié)果不正確。本文中沒有設(shè)置K+、Ca2+濃度對細(xì)菌鹽度耐受性實(shí)驗(yàn)，關(guān)于K+、Ca2+濃度對細(xì)菌生長的影響有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。

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