吳 郁 姚 穎 李文靜 金一枚 楊 沫 郭紅燕

(北京大學(xué)第三醫(yī)院婦產(chǎn)科，北京 100191)

宮頸癌是常見的婦科惡性腫瘤，高居婦科惡性腫瘤第2位[1]。隨著宮頸癌篩查的普及和手術(shù)、放療技術(shù)的發(fā)展，尤其腹腔鏡手術(shù)的發(fā)展[2]，宮頸癌預(yù)后得到改善，但是臨床上一部分患者診斷時已經(jīng)晚期，治療棘手，因此，精確的早期診斷仍然是臨床面臨的難點。目前，生物標記物相關(guān)研究成為疾病早期診斷及預(yù)后的熱點。DNA損傷修復(fù)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，可能會造成DNA錯誤，誘發(fā)腫瘤的發(fā)生。磷酸化組蛋白H2AX(γH2AX)與磷酸化毛細血管擴張性共濟失調(diào)突變因子(phospho-ataxia telangiectasia mutation，pATM)共同參與非同源末端鏈接(nonhomologous end joining, NHEJ)DNA損傷修復(fù)過程，是細胞內(nèi)對于DNA雙鏈斷裂的一種快速敏感的反應(yīng)，因此，γH2AX可以作為DNA損傷的標記物分子。另外，γH2AX與宮頸癌新輔助化療后完全緩解率顯著相關(guān)[3，4]。本研究探討H2AX與ATM 2個目標分子在宮頸癌中的表達，旨在為宮頸癌早期精確診斷提供新的手段。

1 臨床資料與方法

1.1 一般資料

選取2016年1月～2017年7月我科就診的30例宮頸癌(宮頸癌組)，年齡30～62歲，平均45.7歲。FIGO分期：ⅠB1期4 例，ⅠB2期8例，Ⅱ A期6例，Ⅲ期10例，Ⅳ期2例。HPV16陽性20例，HPV18陽性7例，HPV56陽性2例，HPV陰性1例。病理：鱗癌22例，腺癌8例。對照組選取我科就診的18例非宮頸癌(年齡44～57歲)，包括子宮肌瘤(13例)、子宮內(nèi)膜息肉(5例)。

1.2 方法

1.2.1 實驗試劑與耗材 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(thermo, K1622)，TRIZOL，無水乙醇，氯仿，異丙醇，熒光定量PCR試劑盒(takara RR420A)，免疫組化試劑盒PV900，蘇木素-伊紅染色液，γH2AX一抗(CST 2755S，1∶100，兔來源，pATM一抗(NOVUS NB100-306，1∶200，鼠單抗)。qRT-PCR儀[QuantStudio 3 Real-Time PCR(96-well 0.2 ml Block)]，組化濕盒及相關(guān)器材，顯微鏡(日本Nikon ECLIPSE 80i，Nikon corporation)等。

1.2.2 實驗方法

1.2.2.1 實時定量PCR 取宮頸癌組和對照組的宮頸組織，Trizol法提取總RNA。Nanodrop2000檢測RNA濃度。采用thermo K1622逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，按照試劑說明書添加逆轉(zhuǎn)錄體系，獲得cDNA文庫。設(shè)計H2AX和ATM，β-actin引物。H2AX 上游引物 5’-GTTCCCAGTGGGCCGTGTA-3’，下游引物5’- CTGGTCTTCTTGGGCAGCA-3’；ATM 上游引物 5’-TCGGCATTCAGATTCCAAACA-3’, 下游引物5’-TGAGAAATCTCCAAGGATCTGGT-3’；β-actin上游引物 5’-CTCTCCCTCACGCCATC-3’， 下游引物5’-ACGCACGATTTCCCTCTC3’。 引物由華大基因合成。按照實時定量PCR試劑盒添加體系反應(yīng)。PCR反應(yīng)條件：90 ℃，30 s；95 ℃,5 s，60 ℃,30 s(45個循環(huán))；95 ℃,60 s；55 ℃,30 s。

1.2.2.2 免疫組化 ①4%多聚甲醛室溫組織固定過夜,修整組織。組織常規(guī)石蠟包埋、切片，切片厚度為0.5 μm。②檸檬酸抗原修復(fù)緩沖液高溫修復(fù)。③阻斷內(nèi)源性過氧化物酶。④孵育一抗：滴加γH2AX和pATM一抗，γH2AX和pATM的抗體分別按照1∶100和1∶200稀釋。4 ℃孵育過夜。⑤孵育二抗： PBS(pH 7.4)洗滌3次，每次5 min，二抗(HRP標記)按照1∶200稀釋覆蓋組織，室溫孵育50 min。⑥D(zhuǎn)AB顯色，自來水沖洗終止。⑦復(fù)染細胞核。⑧脫水封片。結(jié)果評估：

宮頸癌組和對照組γH2AX和pATM免疫組化染色結(jié)果陽性呈黃色或棕黃色。免疫組化染色的強度和分布采用國際Remmele 評分(international remmele score，IRS)半定量評分系統(tǒng)[5]。染色強度：0分=無，1分=弱，2分=中等，3分=強；陽性細胞百分比：0分=無，1分=<1%，2分=1%～10%， 3分=11%～33%，4分=34%～66%，5分=67%～100%，綜合評分最高分8分。綜合評分0分記(-)，1～2分記(+)，3～5分記(++)，6～8分記(+++)。-和+代表陰性，++和+++代表陽性。免疫組化染色的評分由2位病理科醫(yī)生遵循互盲原則進行，二者評分不一致時取均值。

1.2.2.3 HE染色 按照常規(guī)方法，石蠟切片脫蠟，常規(guī)蘇木精-伊紅染色，中性樹膠封片。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 H2AX和ATM 在mRNA水平的表達情況

實時定量PCR分析宮頸癌組和對照組H2AX和ATM的表達，通過相對定量計算方法2-ΔCT，β-actin為內(nèi)參基因。宮頸癌組ATM mRNA和H2AX mRNA相對表達量較對照組顯著高表達，見表1。

表1 宮頸癌組和對照組H2AX和ATM mRNA表達情況

2.2 HE染色和免疫組化

宮頸癌組γH2AX綜合評分中位數(shù)4分(0～8分)，顯著高于對照組中位數(shù)0分(0～5分)(Mann-WhitneyU檢驗，Z=-4.027，P=0.000)；宮頸癌組pATM綜合評分中位數(shù)5分(0～8分)，顯著高于對照組中位數(shù)0分(0～5分)(Mann-WhitneyU檢驗，Z=-4.468，P=0.000)。宮頸癌組γH2AX陽性24例(80.0%)，對照組陽性2例(11.1%)，宮頸癌組顯著高于對照組；宮頸癌組pATM陽性 25 例(83.3%)，對照組陽性3例(16.7%)，宮頸癌組顯著高于對照組,見表2。HE染色見圖1，免疫組化染色見圖2。

表2 宮頸癌組和對照組pATM和γH2AX免疫組化綜合評分比較

注：-和+代表陰性，++和+++代表陽性

圖1 宮頸癌組和對照組HE染色 a.對照組宮頸上皮細胞排列整齊，細胞核形態(tài)正常(黑色箭頭：正常宮頸上皮)；b.宮頸癌組可見明顯癌灶，細胞排列紊亂，細胞核形態(tài)消失(黑色箭頭：癌細胞) (HE染色 ×200) 圖2 宮頸癌組和對照組γH2AX和pATM免疫組化表達情況 a,b.對照組γH2AX和pATM免疫組化(黑色箭頭：細胞呈弱陽性)；c,d.宮頸癌組γH2AX和pATM免疫組化均有明顯表達，棕黃色或黃色為陽性顯色，兩者均定位于細胞核( ×200)

3 討論

在我國,宮頸癌患者每年新發(fā)病例約在11萬以上，每年有2萬～3萬女性死于宮頸癌。與其他腫瘤相比，宮頸癌具有明確的致病因素及癌前病變病程進展，通過早期預(yù)防和篩查，可以降低發(fā)病率和死亡率[6]。性交年齡早、多個性伴侶、早婚、早產(chǎn)、多次流產(chǎn)、肥胖、家族史、高危型HPV16和18感染均可導(dǎo)致宮頸癌的發(fā)生。宮頸癌預(yù)后與多因素相關(guān)，年齡是宮頸癌患者獨立預(yù)后因素之一[7]。目前，宮頸癌的研究重心已轉(zhuǎn)向?qū)Π┣安∽兊脑缙诎l(fā)現(xiàn)和治療[8]。本研究探討參與DNA雙鏈損傷修復(fù)相關(guān)因子γH2AX和pATM在宮頸癌中的表達情況，并分析其是否可以作為診斷預(yù)測的標記分子。本研究中免疫組化判讀結(jié)果將“+”判定為陰性，是根據(jù)黃曉園等[9]的評分判斷方法，以除外非特異性染色的干擾。本研究結(jié)果顯示二者在mRNA和蛋白質(zhì)水平宮頸癌組織中表達明顯高于對照組(P均=0.000)。因此，γH2AX和pATM因子在宮頸癌的早期診斷有一定臨床意義。

DNA損傷是腫瘤發(fā)生的明確病因，尤其是DNA雙鏈斷裂伴隨細胞周期檢查點的激活。宮頸癌可能由于DNA損傷導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生，并伴隨DNA損傷修復(fù)相關(guān)因子的激活[10]。pATM 和γH2AX是參與DNA雙鏈斷裂損傷修復(fù)的重要因子，ATM活化會進一步激活γH2AX，磷酸化修飾會啟動DNA修復(fù)和激活檢查點的相關(guān)途徑，從而阻止細胞周期的進展[11,12]。Roossink 等[13]研究DNA損傷修復(fù)(DNA damage repair,DDR)組成成分包括pATM在內(nèi)作為潛在的治療靶點以及DDR活化在放化療的宮頸癌患者的預(yù)測和預(yù)后價值，最終認為宮頸癌患者中pATM對放化療的保護性意義，并指出pATM抑制可能是促進放化療的可能途徑。γH2AX是磷酸化的H2AX,可以作為宮頸癌患者新輔助化療的預(yù)測因子，但仍需進一步探索[14]。對宮頸癌的特征性信號通路和基因的探索研究顯示，ATM 信號通路的激活、細胞周期調(diào)控異常、內(nèi)切酶活性增強和3q 區(qū)域的擴增等都有希望成為評價宮頸癌發(fā)病風(fēng)險的指標，提供更好的宮頸癌防治策略[15]。

宮頸癌可通過定期婦科體檢達到一定的預(yù)防、早期診斷目的，但患者早期癥狀無特異性，臨床誤診、漏診率較高[16]，診斷缺乏準確性，無論是病毒還是腫瘤相關(guān)標記物檢測均沒有完全準確的手段，感染程度和癌癥病程進展關(guān)系難以提前預(yù)知[17]。早期檢出并給予積極的治療是防治宮頸癌的關(guān)鍵，目前，宮頸癌的診斷多通過TCT、高危型HPV感染、腫瘤相關(guān)標記物以及影像學(xué)檢查等聯(lián)合診斷[18～21]。本文提出DNA損傷修復(fù)因子γH2AX和pATM參與宮頸癌的發(fā)生，期望通過對宮頸組織早期檢測達到診斷目的。近年來，不斷出現(xiàn)新的宮頸癌相關(guān)的生物標記，比如ATB(轉(zhuǎn)化生長因子-β誘導(dǎo)激活的一種lnc RNA)的高表達是宮頸癌預(yù)后的獨立危險因素[22]，PBX3(Pre-B-cell leukemia homeobox 3)[23]和 microRNA-466也同樣發(fā)現(xiàn)有宮頸癌早期預(yù)測，疾病進展以及預(yù)后的標記作用[24]。本研究顯示宮頸癌細胞中存在顯著的γH2AX與pATM激活，即大量的DNA損傷，表明DNA損傷很可能是驅(qū)動癌癥發(fā)生的主要原因之一。除γH2AX與pATM外，細胞內(nèi)還含有數(shù)十種其他DNA損傷響應(yīng)因子，如MDC1、NBS1、PNKP等。這些因子的功能異?；蚧蛲蛔兌加锌赡芤餌NA損傷修復(fù)的失敗、基因組紊亂以及最終的癌癥發(fā)生。因此，檢測DNA損傷修復(fù)因子的基因表達或相關(guān)生化特性，很可能對宮頸癌的早期診斷及分級治療提供新策略。

1 應(yīng) 倩,夏慶民,鄭榮壽,等.中國2009年宮頸癌發(fā)病與死亡分析.中國腫瘤，2013，22(8)：612-616.

2 張昕蕾,張 軍,蔡有芹,等.腹腔鏡手術(shù)治療108例宮頸癌的臨床分析.中國微創(chuàng)外科雜志,2016,16(11):980-982.

3 Larsen DH,Stucki M.Nucleolar responses to DNA double-strand breaks.Nucleic Acids Res,2016,44(2):538-544.

4 Vici P, Buglioni S, Sergi D, et al.DNA damage and repair biomarkers in cervical cancer patients treated with neoadjuvant chemotherapy: an exploratory analysis.PloS One,2016,11(3):e0149872.

5 Cuppens T, Annibali D, Coosemans A, et al. Potential targets’ analysis reveals dual PI3K/mTOR pathway inhibition as a promising therapeutic strategy for uterine leiomyosarcomas-an ENITEC Group initiative. Clin Cancer Res,2017,23(5):1274-1285.

6 李英偉,劉海枝.宮頸癌高危因素及檢測的研究進展.中外醫(yī)療,2010,29(5)：98-99.

7 鄭曉霞,李瓊珍,李 玲,等.宮頸癌預(yù)后狀況及其影響因素分析.實用癌癥雜志，2014，29(3)：314-316.

8 Wright TC Jr, Massad LS, Dunton CJ, et al.2006 consensus guidelines for the management of women with cervical intraepithelial neoplasia or adenocarcinoma in situ. Am J Obstet Gynecol,2007,197(4):340-345.

9 黃曉園,李瓊珍,馬 丁,等. Chkl /2和Pl kl 蛋白在宮頸良惡性病變組織中的表達及其意義.中國癌癥雜志,2007,17(6):429-432.

10 Jin Y,Xu X,Li M,et al.Increasing sensitivity to DNA damage is a potential driver for human ovarian cancer. Oncotarget,2016,7(31):49710-49721.

11 Turinetto V, Giachino C. Multiple facets of histone variant H2AX: a DNA double-strand-break marker with several biological functions. Nucleic Acids Res,2015,43(5):2489-2498.

12 Larsen DH, Stucki M. Nucleolar responses to DNA double-strand breaks. Nucleic Acids Res,2016,44(2):538-544.

13 Roossink F, Wieringa HW, Noordhuis MG, et al.The role of ATM and 53BP1 as predictive markers in cervical cancer.Int J Cancer,2012,131(9):2056-2066.

14 Zhao J, Wang Q, Li J, et al.Comparative study of phosphorylated histone H2AX expressions in the cervical cancer patients of pre- and post-neoadjuvant chemotherapy.Eur J Gynaecol Oncol,2015,36(3):318-322.

15 程 靜,潘光鑫,周 素,等.宮頸癌發(fā)病機制的探討.中國婦幼保健,2014,29(28)：4545-4547.

16 姚春慧,李 波,譚 娟,等.子宮頸癌患者腫瘤標志物聯(lián)合MRI影像診斷的臨床價值.中國CT和MRI雜志,2017,15(6):103-106.

17 王 楠,馬 蓉,吳建中,等.宮頸癌的發(fā)病機制、診斷及治療進展.中國腫瘤外科雜志,2013,5(2):121-124.

18 楊 輝,鄭 君.聯(lián)合檢測血清SCCA、CA19-9及CA125對宮頸癌診斷及預(yù)后判斷的臨床意義.中國婦幼保健,2013,28(5):772-774.

19 顏 萍,龔旭華.多種血清腫瘤標志物檢測在早期宮頸癌診斷中的意義.實用癌癥雜志,2014,29(7):741-743.

20 左擁軍,史麗靜,謝 雁.MRI掃描技術(shù)對診斷宮頸癌的臨床研究.中國臨床醫(yī)生雜志,2017,45(2):83-86.

21 張志娟,薛 燕.TCT與高危型HPV-DNA檢測在宮頸癌篩查中的應(yīng)用價值探討.中國婦幼保健,2016,31(24):5339-5341.

22 Cao W, Peng T, Zhou Y.Long noncoding RNA activated by transforming growth factor-β promotes cancer development and is a prognostic marker in cervical cancer.J Cancer Res Ther,2017,13(5):801.

23 Li H, Sun G, Liu C,et al. PBX3 is associated with proliferation and poor prognosis in patients with cervical cancer. Onco Targets Ther,2017,10：5685-5694.

24 Zhou LL, Shen Y, Gong JM, et al.MicroRNA-466 with tumor markers for cervical cancer screening.Oncotarget,2017,8(41):70821-70827.