王 碩，孫曉艷，陳金龍*

(1中國藥科大學(xué)藥學(xué)院藥物分析系，南京 210009；2中國藥科大學(xué)藥物質(zhì)量與安全預(yù)警教育部 重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210009；3江蘇省中醫(yī)藥研究院分子與細(xì)胞生物實(shí)驗(yàn)室,南京 210028)

近年來，研究人員基于代表性有機(jī)染料，如羅丹明、香豆素、熒光素，設(shè)計(jì)出許多熒光傳感器[1-3]，其中羅丹明是一類性能優(yōu)良的分子熒光染料，具有高熒光量子效率[4-6]。醫(yī)學(xué)工作者將這些傳感器用于檢測細(xì)胞內(nèi)、外生物分子[7-9]，通過檢測這些標(biāo)志物的含量來診斷某些疾病，其中維生素B1缺乏癥可通過檢測血液丙酮酸(pyruvic acid，PA)來診斷。硫胺素焦磷酸是維生素B1的主要輔酶形式，在細(xì)胞內(nèi)參與PA進(jìn)一步氧化分解為乙酰輔酶A。維生素B1缺乏時(shí)，體內(nèi)PA的氧化過程受阻，使PA的含量增加，其主要臨床表現(xiàn)為自主神經(jīng)功能紊亂、心力衰竭、共濟(jì)失調(diào)、雙下肢周圍性癱瘓等[10]。因此，建立一種對(duì)該類疾病的檢測方法尤為重要。

丙酮酸是連接糖酵解和三羧酸循環(huán)的一種重要的有機(jī)α-酮酸，維持體內(nèi)糖、脂肪、氨基酸之間的平衡。α-酮酸與氨基酸之間的轉(zhuǎn)氨作用可在溫和生理?xiàng)l件下進(jìn)行，其中關(guān)鍵步驟氨基酸的氨基與輔酶磷酸吡哆醛(pyridoxal phosphate，PLP)發(fā)生席夫堿反應(yīng)，生成亞胺結(jié)構(gòu)[11](圖1)，說明活性羰基易與氨基基團(tuán)發(fā)生高效反應(yīng)和轉(zhuǎn)化。目前檢測PA的方法主要有熒光法[12]、比色法[13]、化學(xué)發(fā)光法[14]、高效液相色譜法[15]、氣相色譜法[16]等?；瘜W(xué)發(fā)光法、色譜法需要復(fù)雜的樣品處理過程，且檢測成本昂貴使其無法得到廣泛應(yīng)用。而PA由于自身化學(xué)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，吸收波長短，且消光系數(shù)小，羰基顯色試劑——二硝基苯肼對(duì)PA比色法檢測存在專屬性差和靈敏度低的不足[17-18]。與這些方法相比，熒光法具有操作簡單、檢測快速、專屬性高等優(yōu)點(diǎn)。

Figure1 Schiff base reaction occurred between the amino acid and pyridoxal phosphate (PLP)

針對(duì)傳統(tǒng)檢測方法的不足，本文設(shè)計(jì)3種羅丹明類酰肼探針：RhB-NH2、R6G-NH2、R-101-NH2、(圖2)。探針本身無熒光，分子結(jié)構(gòu)中酰肼基團(tuán)的N原子有孤對(duì)電子，易與PA結(jié)構(gòu)中的羰基發(fā)生縮合反應(yīng)，生成席夫堿，所生成的席夫堿共軛體系擴(kuò)大，誘導(dǎo)吡咯環(huán)開環(huán)，實(shí)現(xiàn)探針熒光信號(hào)增強(qiáng)，從而建立一種水相檢測PA的新方法(圖3)。體內(nèi)常見生物分子、陰陽離子以及活性氧化物等幾乎無干擾，探針分子對(duì)PA具有高專屬性，成功應(yīng)用于A549、293T活細(xì)胞中丙酮酸的熒光成像。

Figure2 Molecular structures of R6G-NH2,R-101-NH2and RhB-NH2

Figure3 Proposed mechanism for the reaction of probe model with pyruvic acid (PA)

1 材 料

1.1 試 劑

丙酮酸、羅丹明B、水合肼(阿拉丁試劑有限公司)；羅丹明6G(美國Acros Organics公司)；羅丹明101(美國Sigma-Aldrich試劑有限公司)；胎牛血清(FBS，美國Gibco公司)、青霉素、鏈霉素(美國Invitrogen公司)。其他試劑均為市售分析純；實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

1.2 儀 器

F-4600熒光光譜儀(日本日立公司)；UV-1700紫外分光光度計(jì)(日本島津公司)；三重四極桿質(zhì)譜儀(美國Thermo Finnigan公司)；Axio Observer A1蔡司倒置熒光顯微鏡(德國卡爾蔡司公司)。

1.3 細(xì)胞系

人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞細(xì)胞系A(chǔ)549、腎上皮細(xì)胞系293T(中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心)。

2 方 法

2.1 羅丹明基熒光探針的合成

依據(jù)文獻(xiàn)[19-20]，分別稱取一定量羅丹明B、羅丹明6G、羅丹明101溶解于甲醇中配制成100 mmol/L溶液，加入過量水合肼，氮?dú)獗Ｗo(hù)下水浴加熱至75 ℃回流攪拌反應(yīng)4 h至顏色褪去。將反應(yīng)混合物倒入去離子水中，用乙酸乙酯萃取(25 mL×3)至水層無色，無水硫酸鈉干燥，減壓蒸餾，得到羅丹明6G酰肼(R6G-NH2，淡黃色固體，產(chǎn)率74.2%)、羅丹明101酰肼(R-101-NH2，粉紅色粉末，產(chǎn)率75.8%)和羅丹明B酰肼(RhB-NH2，淺粉色粉末，70.8%)。

2.2 探針儲(chǔ)備液的配制

分別準(zhǔn)確稱取一定量的R6G-NH2、R-101-NH2、RhB-NH2，用乙醇完全溶解，配制成1 mmol/L探針儲(chǔ)備液。

2.3 丙酮酸儲(chǔ)備液的配制

用二次蒸餾水稀釋PA原液，配成不同濃度的PA溶液。

2.4 熒光探針對(duì)各種分析物的光學(xué)響應(yīng)

在10 mL具塞刻度試管中，移液管移取乙醇1.00 mL,HEPES-NaOH緩沖液(200 mmol/L，pH 5.40)1.00 mL，適量探針儲(chǔ)備液，搖勻，加入一定濃度各分析物，用二次蒸餾水稀釋，定容至刻度，搖勻，37 ℃靜置，避光反應(yīng)10 min后進(jìn)行熒光、紫外吸收測試。

2.5 組織液中丙酮酸檢測

稱取植物樣品5.0 g于研缽中加入少許石英砂，研磨成勻漿，用無水乙醇(5 mL)浸洗4次，轉(zhuǎn)入25 mL量瓶，定容至刻度，室溫避光靜置30 min，取勻漿液10 mL離心(4 000 r/min)10 min，取上清液備用。在10 mL具塞刻度試管中，移液管移取上清液1.00 mL,HEPES-NaOH緩沖液(200 mmol/L，pH 5.40)1.00 mL，探針儲(chǔ)備液(1 mmol/L)70 μL，搖勻，二次蒸餾水定容至刻度，搖勻，37 ℃靜置，避光反應(yīng)10 min后進(jìn)行熒光測試。

2.6 細(xì)胞外源性丙酮酸熒光成像

細(xì)胞系A(chǔ)549、293T是用F12K培養(yǎng)基(DMEM)進(jìn)行培養(yǎng)，其中添加10%胎牛血清、青霉素(100 U/mL)和鏈霉素(100 μg/mL)。取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，以每毫升1.5×105個(gè)細(xì)胞的密度接種在直徑為35 mm的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)過夜后，把培養(yǎng)液換成含有10 μmol/L R6G-NH2的培養(yǎng)基，細(xì)胞在37 ℃下繼續(xù)孵育30 min。然后把部分培養(yǎng)液換成添加有50、100 μmol/L PA的培養(yǎng)基，繼續(xù)孵育30 min。用PBS(0.01 mol/L，pH 7.4)洗滌3次后，細(xì)胞放在熒光顯微鏡(200倍物鏡，激發(fā)波長488 nm)，進(jìn)行觀察、拍攝。

2.7 細(xì)胞內(nèi)源丙酮酸熒光成像

取細(xì)胞系293T對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，以每毫升1.5×105個(gè)細(xì)胞的密度接種在直徑為35 mm的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)過夜后，把部分培養(yǎng)液換成含有1 nmol/L雙酚A(BPA)的培養(yǎng)基，細(xì)胞在37 ℃下繼續(xù)孵育24 h。然后把部分培養(yǎng)液換成添加有10 μmol/L R6G-NH2的培養(yǎng)基，繼續(xù)孵育30 min。用PBS(0.01 mmol/L，pH 7.4)洗滌3次后，細(xì)胞置熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察及拍攝。

3 結(jié)果與討論

3.1 探針篩選與檢測機(jī)制

為研究探針分子結(jié)構(gòu)對(duì)PA識(shí)別能力的影響，通過比較5 μmol/L 3種探針在各自最大發(fā)射處的相對(duì)熒光強(qiáng)度(F/F0-1)對(duì)PA濃度(50，120 μmol/L)響應(yīng)結(jié)果，評(píng)價(jià)各探針分析性能(圖4)，探針R6G-NH2對(duì)PA各濃度響應(yīng)最好，因此，選擇R6G-NH2為目的探針深入研究。為驗(yàn)證上述推測，采用熒光分光光度法、紫外分光光度法和質(zhì)譜法對(duì)反應(yīng)機(jī)制進(jìn)行初步探究。

Figure4 Fluorescence responses of the three probes (5 μmol/L) to the different concentration of PA

如圖5所示，激發(fā)波長為510 nm，探針本身在565 nm處熒光強(qiáng)度較低，且在450～650 nm之間幾乎沒有紫外吸收，這是因?yàn)樘结樚幱诼莪h(huán)狀態(tài)，芳香環(huán)之間沒有形成有效共軛結(jié)構(gòu)[21]，與PA發(fā)生反應(yīng)后，探針在565 nm處熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)，在533 nm處出現(xiàn)特征吸收峰，溶液由無色變?yōu)榉奂t色，說明探針與PA作用后，吡咯環(huán)開環(huán)導(dǎo)致熒光和顏色的變化。質(zhì)譜結(jié)果表明，探針本身分子離子峰[M+H]+出現(xiàn)在429.24(理論值429.22)，加入PA后，探針峰消失，在499.25處出現(xiàn)新的離子峰，這與探針和PA反應(yīng)生成產(chǎn)物的理論值499.23吻合。

Figure5 Effect of R6G-NH2on PA

A:Fluorescence spectra of R6G-NH2before and after reaction with PA,Inset:photographs under UV light (365 nm);B:UV-Vis spectra of R6G-NH2before and after reaction with PA,Inset:photographs under sunlight;C:ESI-MS results of free R6G-NH2;D:ESI-MS results of the corresponding product of R6G-NH2and PA

3.2 檢測條件的優(yōu)化

從有機(jī)助溶劑的種類及比例、探針濃度、pH以及反應(yīng)溫度等方面優(yōu)化檢測條件。由于探針R6G-NH2難溶于水而易溶于有機(jī)溶劑，為了實(shí)現(xiàn)均相分析的目的，需要加入適量與水互溶有機(jī)溶劑。分別以體積比為10%的4種常見溶劑甲醇、乙醇、乙腈、二甲基亞砜(DMSO)為基底，測試加入PA(20、100 μmol/L)前后溶液的熒光強(qiáng)度，比較不同有機(jī)相存在條件下，熒光強(qiáng)度增強(qiáng)變化量F/F0-1(圖6-A)。結(jié)果表明，在體系中加入乙醇檢測靈敏度最高，且PA在乙醇-水(1∶9)的體系中對(duì)R6G-NH2探針熒光恢復(fù)最強(qiáng)(圖6-B)，因此，選擇乙醇作為檢測體系的助溶劑。對(duì)R6G-NH2探針濃度優(yōu)化(圖6-C)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)7 μmol/L探針熒光恢復(fù)效果最好，因此最終選擇7 μmol/L探針濃度作為分析濃度。

酮類化合物與肼反應(yīng)一般是在酸催化下進(jìn)行，羰基氧與質(zhì)子結(jié)合，可以提高羰基的活性，但若酸性過強(qiáng)，肼與質(zhì)子結(jié)合形成鹽，會(huì)喪失它們的親和性[22]，因此，探針以及產(chǎn)物分子中吡咯環(huán)結(jié)構(gòu)的開閉與pH緊密相關(guān)。為了優(yōu)化檢測pH，本研究考察了不同pH體系下探針熒光強(qiáng)度恢復(fù)能力。如圖7-A所示，向探針溶液中分別加入20、100 μmol/L PA，在酸性較強(qiáng)的條件(pH<5.3)下，由于強(qiáng)質(zhì)子化環(huán)境使探針自發(fā)開環(huán)，出現(xiàn)較強(qiáng)的熒光背景，pH>5.3時(shí)，探針在相對(duì)較弱的質(zhì)子化環(huán)境中無顯著的熒光信號(hào)，且當(dāng)pH=5.4時(shí)，體系的熒光增強(qiáng)倍數(shù)達(dá)到最大。

反應(yīng)溫度也是影響反應(yīng)速率的重要因素之一，本研究進(jìn)行一系列平行實(shí)驗(yàn)以探究溫度對(duì)反應(yīng)結(jié)果的影響。通過測試5～70 ℃范圍內(nèi)探針與PA反應(yīng)前后熒光變化趨勢，如圖7-B所示，結(jié)果表明R6G-NH2與PA反應(yīng)產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度隨溫度變化并不明顯，因此選擇一般正常人的體溫37 ℃作為檢測條件，有利于實(shí)現(xiàn)探針的實(shí)際應(yīng)用。

Figure6 Effects of reaction conditions on response of R6G-NH2to PA

A:Organic phase (R6G-NH2:5 μmol/L);B:Ethanol content (R6G-NH2:5 μmol/L);C:R6G-NH2concentration

Figure7 Effects of reaction conditions on response of R6G-NH2to PA

A:pH;B:Temperature (R6G-NH2:5 μmol/L)

3.3 探針R6G-NH2分析性能

經(jīng)優(yōu)化得到最佳檢測條件：7 μmol/L探針R6G-NH2加入到20 mmol/L pH 5.40 HEPES-NaOH緩沖液中，體系中乙醇-水(1∶9)，反應(yīng)溫度37 ℃，然后分別加入不同濃度PA溶液。在此條件下，探針R6G-NH2與不同濃度PA反應(yīng)后熒光光譜曲線如圖8-A所示。隨PA濃度增大(0～160 μmol/L)，探針在565 nm處熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，當(dāng)PA濃度達(dá)120 μmol/L時(shí)，探針熒光強(qiáng)度基本保持穩(wěn)定，呈現(xiàn)出較強(qiáng)的黃色熒光。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，如圖8-B所示，探針R6G-NH2在565 nm處熒光強(qiáng)度變化量(F/F0-1)與PA濃度(0.2～120 μmol/L)呈良好線性相關(guān)，線性方程為：F/F0-1=0.013 4c(PA)+0.012 5(R2=0.998 7)，式中F和F0分別是探針R6G-NH2與PA作用后、以及探針自身的熒光強(qiáng)度，檢測下限低至0.1 μmol/L。熒光探針R6G-NH2與不同濃度PA紫外吸收光譜如圖8-C所示，探針溶液在450～650 nm之間幾乎無紫外吸收，加入PA后，533 nm處出現(xiàn)新的明顯吸收峰，溶液顏色逐漸由無色變?yōu)榧t色，這是因?yàn)樯晌颯chiff堿引起吡咯環(huán)開環(huán)，共軛結(jié)構(gòu)增大。因此，探針R6G-NH2是一種潛在具有比色/熒光雙通道識(shí)別PA分子的傳感器。

3.4 探針選擇性考察

Figure8 Analysis performance of R6G-NH2

A:Fluorescence spectra of R6G-NH2with different concentrations of PA (0-160 μmol/L),Inset:images under UV light (365 nm);B:Linear calibration plot of the various concentrations of PA between the enhancement of fluorescence intensity;C:UV-Vis spectra of R6G-NH2with different concentrations of PA (0-1.5 mmol/L),Inset:images under sunlight;D:Linear calibration plot of the various concentrations of PA between the enhancement of absorbance intensity

Figure9 Selective response of R6G-NH2to pyruvic acid affected by conventional biomolecules and ionic species

A:Fluorescence response of R6G-NH2(7 μmol/L) to different amino acids (500 μmol/L) and PA (100 μmol/L);B:Fluorescence response of R6G-NH2(7 μmol/L) to protein,various anions,ROS and dicarbonyl derivatives (Cu2+,Fe3+:30 μmol/L;BSA,HGB,DNA:50 μg/mL;and other interfering substances concentrations of 500 μmol/L).Inset:images of R6G-NH2and with different amino acids,anions and PA solutions in sunlight (a) and UV light (365 nm,b)

3.5 組織液中丙酮酸的檢測

為了驗(yàn)證R6G-NH2納米探針的可行性，本研究選取洋蔥、大蒜、大蔥3種植物樣品。樣品研磨成勻漿溶于乙醇,去除蛋白，經(jīng)4 000 r/min轉(zhuǎn)速離心，取上清液，用探針與2,4-二硝基苯肼檢測各組織液中丙酮酸含量。如圖10所示，3種組織液樣品中PA含量的兩種方法檢測結(jié)果均高度吻合。說明基于分子熒光探針的分析方法，快速靈敏，準(zhǔn)確且不需要繁瑣復(fù)雜的樣品處理過程，操作簡單易行。

3.6 細(xì)胞成像

PA是糖酵解的主要產(chǎn)物，而糖酵解主要在細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)行，因此細(xì)胞中含有豐富的PA[23]。為了探討R6G-NH2在活細(xì)胞中對(duì)PA的熒光成像能力，采用倒置熒光顯微鏡對(duì)A549、293T活細(xì)胞中外源性PA進(jìn)行熒光成像。在生物體系內(nèi)，10%的乙醇濃度并不適合與細(xì)胞共培養(yǎng)，為了檢測活細(xì)胞內(nèi)丙酮酸，本實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基中并未加入乙醇，且由圖6-B實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，在無乙醇體系中，探針對(duì)丙酮酸響應(yīng)度高，并不影響檢測定性結(jié)果。此外，體外條件優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，探針濃度5～10 μmol/L 之間對(duì)丙酮酸響應(yīng)較靈敏，考慮到細(xì)胞內(nèi)環(huán)境復(fù)雜，適當(dāng)增大探針濃度可使檢測結(jié)果更顯著。結(jié)果如圖11、12所示，探針R6G-NH2可以穿過細(xì)胞膜并進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)?？瞻讓?duì)照組幾乎沒有熒光信號(hào)，向培養(yǎng)基中加入10 μmol/L R6G-NH2孵育30 min，顯示較弱的熒光信號(hào)。向該培養(yǎng)基中分別加入50、100 μmol/L外源性PA繼續(xù)孵育30 min，可觀察到PA濃度依賴的熒光增強(qiáng)現(xiàn)象。

Figure10 Detection of PA in plant tissue

A:Standard curve of pyruvate detected by 2,4-dinitrophenylhydrazine;B:Comparison of the analytical results of onion,scallion and garlic samples determined with the proposed method and 2,4-dinitrophenylhydrazine colorimetry (n=3)

為了考察R6G-NH2對(duì)細(xì)胞內(nèi)源PA監(jiān)測能力，本研究采用低濃度BPA誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生PA[24]并進(jìn)行熒光成像。結(jié)果如圖13所示，經(jīng)過BPA誘導(dǎo)的293T細(xì)胞熒光顯著增強(qiáng)，探針R6G-NH2對(duì)細(xì)胞內(nèi)源PA響應(yīng)靈敏。因此，R6G-NH2有望發(fā)展成一種活細(xì)胞中PA實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)熒光成像的分子探針。

4 結(jié) 論

啟發(fā)于細(xì)胞內(nèi)生理環(huán)境下α-酮酸與氨基酸之間的轉(zhuǎn)氨作用，以羅丹明為熒光團(tuán)，肼為識(shí)別基團(tuán)，本研究構(gòu)建了一類分子開關(guān)的“Turn-on”型丙酮酸熒光探針。通過探針分子中酰肼與丙酮酸活潑羰基發(fā)生席夫堿反應(yīng)，誘導(dǎo)吡咯環(huán)打開，產(chǎn)生顏色和熒光雙重響應(yīng)。羅丹明6G-酰肼代表探針具有分析靈敏度高、檢測快速、選擇性好等特點(diǎn)，可消除常見生物分子和陰陽離子、活性氧化物等物質(zhì)的干擾。體外成功檢測了3種生物組織中的丙酮酸。Figure11 A549 Cell fluorescence images of exogenous PA incubated with R6G-NH2

A:Untreated control;B:Cells incubated with R6G-NH2(10 μmol/L);C:Cells incubated with R6G-NH2(10 μmol/L) in the presence of PA (50 μmol/L);D:Cells incubated with R6G-NH2(10 μmol/L) and in the presence of PA (100 μmol/L)

Figure12 293T Cell fluorescence images of exogenous PA incubated with R6G-NH2

A:Untreated control;B:Cells incubated with R6G-NH2(10 μmol/L);C:Cells incubated with R6G-NH2(10 μmol/L) in the presence of PA (50 μmol/L);D:Cells incubated with R6G-NH2(10 μmol/L) and in the presence of PA (100 μmol/L)

Figure13 293T Cell fluorescence images of endogenous PA incubated with R6G-NH2

A:Untreated control;B:Cells incubated with BPA (1 nmol/L);C:Cells incubated with R6G-NH2(10 μmol/L);D:Low-concentrations of BPA (1 nmol/L) induced PA and incubated with R6G-NH2

一定疏水特性的探針分子具有良好的細(xì)胞膜穿透性，成功實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞外源性和內(nèi)源性丙酮酸熒光成像分析。

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