張 敏,李晶晶

(1長江職業(yè)學(xué)院，武漢 430074;2湖北中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，武漢 430065)

甘草來源于豆科植物烏拉爾甘草、脹果甘草或光果甘草的干燥根和根莖，具有清熱解毒、補(bǔ)脾益氣、潤肺、祛痰止咳、調(diào)和諸藥等功效，是臨床上應(yīng)用最廣泛的傳統(tǒng)中草藥，其主要成分為三萜類和黃酮類化合物[1]。長期以來，對(duì)于甘草的有效成分和藥理作用研究主要集中在三萜類化合物甘草酸和甘草次酸[2-3]。近年來，現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)甘草中黃酮類化合物也是一類非常有效的活性成分，具有多種藥理活性，如抗菌、抗炎、抗?jié)儭⒖寡趸?、抗糖尿病、抗腫瘤、抗抑郁等作用[4-5]，且毒性低、不良反應(yīng)少，具有良好的臨床開發(fā)潛力。最近研究表明，甘草黃酮類化合物對(duì)肝癌Bel-7402細(xì)胞展現(xiàn)出了較強(qiáng)的抑制活性[6]。因此，本研究繼續(xù)探討甘草黃酮單體化合物甘草查耳酮A-F、刺甘草查耳酮、異甘草素、異甘草苷、光甘草定、甘草素、甘草苷的抗肝癌活性，以期得到高效、低毒的抗肝癌先導(dǎo)化合物。

盡管目前對(duì)甘草黃酮的抗腫瘤作用靶點(diǎn)研究較少，但是參考黃酮類化合物抗腫瘤作用靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn)，黃酮類化合物對(duì)細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶(CDK)有較強(qiáng)的親和力[7]，而CDK是控制細(xì)胞周期與增殖過程的重要激酶，已成為新型抗腫瘤藥物設(shè)計(jì)的重要靶點(diǎn)，尤其是CDK1/cyclin B在多種腫瘤中過表達(dá)[8]。因此，本研究首先測試了12個(gè)甘草黃酮(圖1)對(duì)CDK1/cyclin B的抑制活性，以判斷甘草黃酮類化合物的靶向性。

Figure1 Structures of licorice flavonoids

1 材 料

1.1 試 劑

甘草查耳酮A-F、刺甘草查耳酮、異甘草苷購自北京伊諾凱科技有限公司(質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥95%)；甘草素、異甘草素、甘草苷購自百靈威科技有限公司(質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥95%)；光甘草定、夫拉平度(flavopiridol)購自阿拉丁試劑有限公司(質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥95%)；Kinase-Glo?Luminescent Kinase Assay試劑盒購自上海浩然生物技術(shù)有限公司；CCK-8試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司；CDK1/cyclin B購自英國SignalChem公司；其他試劑購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司(質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥95%)；DMEM、MEM培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Hyclone公司。

1.2 儀 器

ELx808吸收光酶標(biāo)儀(美國BioTek公司)；C6流式細(xì)胞儀(美國BD公司)；FA1004B分析天平(上海越平科學(xué)儀器有限公司)；數(shù)顯游標(biāo)卡尺(美國耐美特公司公司)。

1.3 動(dòng)物與細(xì)胞

BALB/c裸小鼠，體重14～17 g，雌雄各半，由武漢大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物使用許可證：SCXK(鄂)2008-0004；動(dòng)物級(jí)別：SPF級(jí)。細(xì)胞株：人正常肝細(xì)胞HHL-5、人肝癌細(xì)胞Bel-7402細(xì)胞購自武漢大學(xué)細(xì)胞典藏中心；人正常肝細(xì)胞LO2購自中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)細(xì)胞中心；非洲綠猴腎細(xì)胞Vero購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫。

2 方法與結(jié)果

2.1 CDK1活性測試

使用Kinase-Glo?Luminescent Kinase Assay試劑盒測試甘草黃酮類化合物對(duì)CDK的抑制活性，以夫拉平度為陽性對(duì)照，按照操作說明書在測試板中每孔加入激酶CDK1/cyclinB、ATP-熒光底物和不同濃度的待測物，將測試板在30 ℃下反應(yīng)1 h后，每孔再加入Kinasw Glo Plus并繼續(xù)在30 ℃下放置20 min。使用酶標(biāo)儀讀取發(fā)光強(qiáng)度，分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，并計(jì)算出IC50，以此判斷甘草黃酮類化合物對(duì)細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶的抑制活性，結(jié)果見表1。

Compd．IC50/(μmol/L)LicochalconeA057±0015LicochalconeB006±0002LicochalconeC008±0101LicochalconeD034±0006LicochalconeE048±0005LicochalconeF069±0165Echinatin010±0005Isoliquiritigenin005±0005Isoliquiritin119±0355Glabridin013±0005Liquiritigenin011±0005Liquiritin280±153Flavopiridol029±0230

總的來說，這些甘草黃酮化合物對(duì)CDK1/cyclin B均有較強(qiáng)的抑制活性。但是，兩個(gè)黃酮苷化合物(異甘草苷和甘草苷)的活性低于其他黃酮類化合物。事實(shí)上，異甘草苷和甘草苷抑制CDK1/cyclin B的IC50均在微摩爾水平，而其他甘草黃酮抑制CDK1/cyclin B的IC50均在納摩爾水平。尤其是異甘草素(IC50=0.05±0.005 μmol/L)對(duì)CDK1/cyclin B的抑制活性是陽性藥物夫拉平度(IC50=0.29±0.230 μmol/L)的近6倍。

2.2 分子對(duì)接

CDK1的晶體結(jié)構(gòu)目前還未解析出來，按照參考文獻(xiàn)以CDK2晶體結(jié)構(gòu)(PDB code:1YKR)為模板對(duì)CDK1進(jìn)行同源建模[9-11]。通過ChemBio 3D ultra 14.0和Autodock 4.2D中的Ligand模塊進(jìn)行小分子結(jié)構(gòu)的預(yù)處理。對(duì)接軟件使用Autodock4.2D，利用晶體結(jié)構(gòu)中的配體定義口袋盒子，對(duì)接盒子邊長設(shè)置為30 ?,使用半經(jīng)驗(yàn)自由能進(jìn)行評(píng)價(jià)，拉馬克遺傳算法循環(huán)100次，其余參數(shù)保持默認(rèn)，結(jié)果見圖2。

在CDK1的活性口袋中，陽性藥物夫拉平度能夠與氨基酸殘基E81、L82、S84、Q132和D149相互作用形成5個(gè)氫鍵(圖2-A)，其中夫拉平度與E81、L82和D149的氫鍵作用是抑制CDK1的關(guān)鍵作用力[10]；而異甘草素在CDK1的活性口袋中也能夠與氨基酸殘基E81、L82和D149形成氫鍵(圖2-B)，因此異甘草素對(duì)CDK1也有較強(qiáng)的抑制活性。此外，異甘草素還能與K33、S84和D86相互作用形成氫鍵，總共與CDK1的活性口袋氨基酸殘基形成了6個(gè)氫鍵。顯然，異甘草素在CDK1的活性口袋較夫拉平度與更多的氨基酸相互作用，因此異甘草素對(duì)CDK1的抑制活性強(qiáng)于陽性藥物夫拉平度。

Figure2 Predicted binding modes of flavopiridol-CDK1 and isoliquiritigenin-CDK1

A:Docking poses of flavopiridol-CDK1,which can form hydrogen bonds with residues E81,L83,S84,Q132,D149;B:Docking poses of isoliquiritigenin-CDK1,which can form hydrogen bonds with residues K33,E81,L83,S84,D86,D149

2.3 體外抗增殖活性

選取人肝癌細(xì)胞Bel-7402為測試細(xì)胞株，正常的肝細(xì)胞LO2、HHL-5以及非洲綠猴腎細(xì)胞Vero為對(duì)照細(xì)胞。以CDK1抑制劑夫拉平度為陽性對(duì)照藥，采用CCK-8試劑盒對(duì)甘草黃酮進(jìn)行抗腫瘤活性評(píng)價(jià)。取對(duì)數(shù)生長期的測試細(xì)胞株懸浮于含10%胎牛血清的培養(yǎng)基中，鋪至96孔培養(yǎng)板中。待細(xì)胞完全貼壁后，棄去原培養(yǎng)液，加入含有測試藥物的培養(yǎng)液100 μL培養(yǎng)48 h，棄去原培養(yǎng)液，每孔加入CCK-8溶液10 μL，在培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h，用酶標(biāo)儀在490 nm測定每孔的吸收度，分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，并計(jì)算出IC50，結(jié)果見表2。

Compd．IC50(μmol/L)Bel?7402LO2IVTIaLicochalconeA41±012>100>243LicochalconeB11±007>100>909LicochalconeC23±065>100>434LicochalconeD36±041>100>277LicochalconeE61±098>100>163LicochalconeF59±049>100>129Echinatin25±072>100>1886Isoliquiritigenin07±011>100>1388Isoliquiritin77±054>100>370Glabridin16±024>100>526Liquiritigenin22±015>100>161Liquiritin85±067>100>117Flavopiridol24±034>100>416

aIVTI:invitrotherapeutic index，ratio of IC50(LO2) to IC50(Bel-7402)

結(jié)果(表2)表明，12個(gè)甘草黃酮化合物對(duì)肝癌Bel-7402細(xì)胞均有較強(qiáng)的抑制作用，其IC50均小于10.0 mol/L，其中甘草查耳酮B、異甘草素和光甘草定對(duì)Bel-7402的抑制活性強(qiáng)于陽性藥物夫拉平度，特別是異甘草素抑制Bel-7402的IC50達(dá)到了納摩爾水平，是陽性藥物夫拉平度的3倍以上。

為了進(jìn)一步評(píng)價(jià)甘草黃酮化合物的毒性，用正常的肝細(xì)胞LO2作為測試細(xì)胞株來檢測其毒性，并計(jì)算出選擇性指數(shù)(invitrotherapeutic index,IVTI)，化合物的IVTI越高，安全性越高[12]。從表2中可以發(fā)現(xiàn)，這類甘草黃酮基本沒有毒性(IC50>100 mol/L)，并有較高的IVTI，其中異甘草素的治療指數(shù)(IVTI>138)顯著高于其他甘草黃酮化合物和陽性藥物夫拉平度。但是，異甘草素對(duì)另外一種正常的肝細(xì)胞HHL-5(IC50=6.0±0.18 μmol/L)和非洲綠猴腎細(xì)胞Vero(IC50=3.6±0.58 μmol/L)均有較強(qiáng)的毒性作用(圖3)。

2.4 異甘草素對(duì)Bel-7402細(xì)胞凋亡的影響

取對(duì)數(shù)生長期的Bel-7402細(xì)胞株懸浮于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，鋪至12孔培養(yǎng)板中，置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分為測試組、陽性藥物對(duì)照組和空白對(duì)照組。待細(xì)胞完全貼壁后，棄去原培養(yǎng)液，測試組和陽性藥物分別加入含0.7 μmol/L異甘草素和夫拉平度的培養(yǎng)液1 mL，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。按照FITC Annexin V/7-AAD試劑盒的說明書收集細(xì)胞，冰的PBS洗滌3次，離心棄去上清液，加入1×結(jié)合緩沖液100 μL，分別加入FITC Annexin V 5 μL和7-AAD 5 μL，混勻后室溫避光15 min，上流式細(xì)胞檢測儀進(jìn)行檢測，分析Bel-7402細(xì)胞凋亡率，結(jié)果見圖4。

Figure4 Isoliquiritigenin induce Bel-7402 cell apoptosisinvitro

圖4-A中右下象限和右上象限分別代表早期凋亡和晚期凋亡，而將兩象限的百分率相加即為發(fā)生凋亡的細(xì)胞比率。結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，異甘草素和夫拉平度均能顯著地誘導(dǎo)Bel-7402細(xì)胞凋亡，但異甘草素誘導(dǎo)Bel-7402細(xì)胞的凋亡作用強(qiáng)于夫拉平度，其凋亡率分別為44.1%和19.2%(圖4-B)。

2.5 急性毒性實(shí)驗(yàn)

在表2中，異甘草素對(duì)正常的肝細(xì)胞HHL-5和非洲綠猴腎細(xì)胞Vero有毒性。因此，為了進(jìn)一步探討異甘草素在動(dòng)物體內(nèi)是否有毒性，按照參考文獻(xiàn)的方法[13]，選取4～5周齡的裸鼠48只，隨機(jī)將其分為6組不同的給藥劑量組，給藥劑量分別為2.17,2.80,3.61,4.65,5.99,7.72 mg/kg，每組8只，雌雄各半，在灌胃給藥后1 h、5 h、3 d、4～18 d觀察記錄實(shí)驗(yàn)小鼠的存活狀態(tài)，并用寇氏法計(jì)算出異甘草素的LD50及LD50的95%可信限，結(jié)果如表3所示。

Table3 Acute toxicity of isoliquiritigenin in mice

Dose/(mg/kg)nMousemortality1h5h3d4?18dTotalmortalitySurvival/%onday18LD50a/(mg/kg)217800000100280800101883618003036346580040450599800606257728125080438

a95% Confidence limits:3.78-5.07 mg/kg

當(dāng)給予小鼠2.17 mg/kg劑量時(shí)，小鼠在18 d內(nèi)存活率為100%；而給予大劑量7.72 mg/kg劑量時(shí)，3 d內(nèi)全部死亡。根據(jù)不同劑量組的小鼠死亡率，計(jì)算出了異甘草素的LD50為4.38 mg/kg，其95%的可信限為3.78～5.07 mg/kg。

2.6 體內(nèi)抗腫瘤活性

從表2和圖3的體外抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，異甘草素對(duì)肝癌Bel-7402細(xì)胞展現(xiàn)出了較強(qiáng)的抑制活性。因此，本研究建立了肝癌Bel-7402裸鼠皮下瘤模型，來進(jìn)一步考察異甘草素的動(dòng)物體內(nèi)抗肝癌活性。選取4～5周齡的裸鼠在其右側(cè)肩部皮下接種Bel-7402的細(xì)胞混懸液，每只100 μL(4×106～5×106個(gè)細(xì)胞)，接種1周后，隨機(jī)對(duì)小鼠分為治療組、陽性藥物組和空白對(duì)照組，每組4只，雌雄各半，灌胃給藥。通過急性毒性實(shí)驗(yàn)本研究發(fā)現(xiàn)異甘草素經(jīng)口給藥劑量為2.80 mg/kg在第3天將引起實(shí)驗(yàn)裸鼠死亡，而在劑量為2.17 mg/kg不會(huì)造成實(shí)驗(yàn)裸鼠死亡。因此，為了保證在給藥治療期間實(shí)驗(yàn)裸鼠的存活率，治療組異甘草素和陽性藥物組夫拉平度的給藥劑量均為2.17 mg/(kg·d)，其中空白對(duì)照組給予等體積的PBS，連續(xù)給藥18 d。每隔1天稱量裸鼠的體重，并測試腫瘤長寬，計(jì)算腫瘤體積。治療結(jié)束后將裸鼠處死，取下腫瘤并稱重，結(jié)果見圖5。

A：body weight;B：tumor volume;C：tumor weight；D：tumor size

*P<0.01vscontrol group

異甘草素和陽性藥物夫拉平度[2.17 mg/(kg·d)]經(jīng)灌胃連續(xù)給藥18 d，給藥期間實(shí)驗(yàn)裸鼠的體重在逐漸地增加(圖5-A)。從腫瘤體積隨時(shí)間變化曲線(圖5-B)可以發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，異甘草素和陽性藥物夫拉平度在裸鼠體內(nèi)均能夠有效地減慢腫瘤的增長，其中異甘草素的效果更佳。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，取下的實(shí)驗(yàn)小鼠腫瘤也是異甘草素給藥組小鼠的腫瘤重量(圖5-C)和腫瘤體積均小于陽性藥物夫拉平度組(圖5-D)。

3 討 論

本研究結(jié)果顯示，這些甘草黃酮對(duì)CDK1具有靶向性。但是，甘草黃酮化合物之間對(duì)酶的抑制活性卻有較大的差異。從結(jié)構(gòu)上看，兩個(gè)甘草黃酮苷(異甘草苷和甘草苷)對(duì)CDK1的抑制活性低于其相應(yīng)的甘草黃酮，這說明甘草黃酮上與糖基相連的羥基是藥效團(tuán)。從分子對(duì)接的結(jié)果看，與糖基相連的羥基能夠與酶形成氫鍵作用，而形成糖苷后不能形成氫鍵，因此甘草黃酮苷的CDK1酶抑制活性低于甘草黃酮。在甘草查耳酮A-F、刺甘草查耳酮、異甘草素、光甘草定、甘草素中，甘草查耳酮A-F、刺甘草查耳酮、異甘草素屬于黃酮的另一個(gè)分支——查耳酮，這類8個(gè)化合物具有α,β-不飽和酮結(jié)構(gòu)，有較好的柔性，能夠與多種受體結(jié)合，也是一個(gè)抗腫瘤的藥效團(tuán)，因此甘草查耳酮A-F、刺甘草查耳酮、異甘草素的酶抑制活性要強(qiáng)于光甘草定和甘草素。但是，其α,β-不飽和酮的位置有變化，其中異甘草素的α,β-不飽和酮的羰基與間苯二酚相連，而該羰基能夠同間苯二酚的羥基一起與酶的氨基酸殘基形成氫鍵，因此異甘草素的酶抑制活性強(qiáng)于其他類型甘草黃酮。

在體外抗腫瘤活性中，這類甘草黃酮對(duì)肝癌Bel-7402有較強(qiáng)的抑制活性，其抑制Bel-7402的趨勢與酶抑制活性一致，也是甘草黃酮(甘草查耳酮A-F、刺甘草查耳酮、異甘草素、光甘草定、甘草素)強(qiáng)于黃酮苷(異甘草苷和甘草苷)，具有α,β-不飽和酮的化合物甘草查耳酮A-F、刺甘草查耳酮、異甘草素強(qiáng)于化合物光甘草定、甘草素。其中異甘草素(IC50=0.7±0.11 mol/L)對(duì)Bel-7402展現(xiàn)出了最強(qiáng)的抑制活性，是陽性藥物夫拉平度(IC50=2.4±0.34 mol/L)的3倍。

盡管這類甘草黃酮對(duì)正常的肝LO2細(xì)胞沒有毒性，但是異甘草素對(duì)另一種正常的肝細(xì)胞HHL-5(IC50=6±0.18 μmol/L)和非洲綠猴腎細(xì)胞Vero(IC50=3.6±0.58 μmol/L)均有較強(qiáng)的毒性作用(圖3)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)異甘草素對(duì)小鼠的LD50為4.38 mg/kg。異甘草素對(duì)LO2細(xì)胞沒有毒性，可能是由于LO2細(xì)胞系是在人正常肝細(xì)胞原代培養(yǎng)的基礎(chǔ)上經(jīng)過特殊處理而獲得的細(xì)胞，該細(xì)胞株已經(jīng)永生化，并不是正常的肝細(xì)胞，也不是原代細(xì)胞，只是其生長和死亡的規(guī)律和正常肝細(xì)胞較為接近，但已不具備很多正常細(xì)胞的特性，因此異甘草素對(duì)LO2沒有毒性，而采用正常肝細(xì)胞HHL-5更能反映出異甘草素內(nèi)在毒性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果(表3)表明異甘草素對(duì)HHL-5細(xì)胞有較強(qiáng)的毒性，在動(dòng)物體內(nèi)也顯示毒性較大。在動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，異甘草素也能夠有效地抑制腫瘤的增長，其抑瘤率為51.0%，是陽性藥物夫拉平度(31.0%)的1.6倍。

總之，甘草黃酮是一類細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶(CDKs)抑制劑，其中異甘草素可以作為先導(dǎo)物進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾和改造，以獲得抗肝癌活性高、毒性較小的化合物，值得進(jìn)一步深入研究。

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