林 錦，王 旭，王 艱，許秀枝，陳垚昊，李柱來*

(1福建醫(yī)科大學藥學院藥物化學系，福州 350122；2福州外國語學校，福州 350007)

惡性腫瘤是威脅人類健康的主要疾病之一，因此研發(fā)高效的抗腫瘤藥物是許多醫(yī)藥工作者不斷追求的目標。傳統(tǒng)的抗腫瘤藥物主要是直接作用于DNA的合成及修復、細胞有絲分裂等生理過程，存在實體腫瘤療效差、不良反應大、易產(chǎn)生耐藥性等問題。隨著分子生物學和基因工程的快速發(fā)展，腫瘤細胞內(nèi)的信號傳導也得到了深入的研究并逐步被人們所了解。其中蛋白酪氨酸激酶(protein tyrosine kinases，PTKs)是細胞內(nèi)信號傳導通路的重要調(diào)節(jié)因子[1-2]。PTKs通過特異性地催化三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)末端磷?；D(zhuǎn)移，使底物酪氨酸殘基上的羥基磷酸化，調(diào)節(jié)下游信號級聯(lián)反應從而調(diào)控細胞增殖、遷移、分化等生理過程。PTKs的活性在正常細胞中受到嚴格的控制，但是由于突變或結(jié)構(gòu)變化導致PTKs的異常表達則會導致包括腫瘤等多種疾病。因此在抗腫瘤藥物的設(shè)計中，PTKs被視為理想的藥物作用靶標。

另一方面，蝶啶類化合物是生物體內(nèi)一類重要的雜環(huán)化合物，因其最初從蝴蝶翼翅中發(fā)現(xiàn)而得名。蝶啶類化合物已被廣泛應用作為受體拮抗劑、殺菌劑、抗心律不齊藥、抗腫瘤試劑、利尿劑等，其中最具代表性的甲氨蝶呤是臨床上常用的抗腫瘤藥物。值得一提的是，研究人員已開始從事將蝶啶類化合物作為PTKs抑制劑用于腫瘤治療的相關(guān)工作，包括治療非小細胞肺癌的靶點EGFR[3]及治療急性髓細胞樣白血病的靶點FLT3[4]等。因此，前人對于蝶啶結(jié)構(gòu)藥物開發(fā)方面的工作基礎(chǔ)，對本研究工作極具參考價值。

本研究在前人工作基礎(chǔ)上利用生物電子等排原理，將長鏈的烷氧基引入蝶啶的6位C原子，以期提高目標化合物的脂溶性，利用多種取代苯胺對蝶啶的4位C原子氨基化，提高目標化合物與PTKs疏水區(qū)域的結(jié)合能力。如圖1和表1所示，通過6步反應合成一系列4-(N-芳基)胺基-6-長鏈烷氧基取代蝶啶類化合物，采用核磁共振波譜、質(zhì)譜等手段進行結(jié)構(gòu)表征，并利用MTT法進行體外抗腫瘤活性實驗。通過生物活性實驗對目標分子的構(gòu)效關(guān)系進行研究，為后續(xù)的研究以及未來該類型藥物的實際應用提供有力的支撐。

Figure1 Synthetic route of substituted pteridines

1 實驗部分

1.1 試劑和細胞株

3-氨基吡嗪-2-羧酸甲酯(廣拓化學科技有限公司)青霉素、鏈霉素、DMEM培養(yǎng)基(美國Thermo Fisher公司)；胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)；胰蛋白酶(美國Amresco公司)；MTT試劑(北京莊盟國際生物基因科技有限公司)；F-12K培養(yǎng)基(美國Sigma公司)；其余均為市售分析純試劑。

人胃癌細胞HGC-27、人非小細胞肺癌A549、人急性髓性白血病細胞KG1a(福建醫(yī)科大學藥理實驗室)。

1.2 儀 器

Multiskan Mk3酶標儀model 550(美國Thermol Labsystems公司)；立式(超)低溫冰箱(美國Forma Scientific公司)；96孔培養(yǎng)板(美國Corning Incorporated公司)；倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；WRS-1B數(shù)字熔點儀(上海精密科學儀器有限公司)；Avance III核磁共振儀(瑞士Bruker Biospin)；質(zhì)譜儀(美國Thermo Finnigan公司)；Sybyl-X1.3藥物輔助設(shè)計程序。

Table1 Chemical structures of target compounds

ProductR1Ar7aCH3OCH2CH22?chloro?4?bromo?phenyl7bCH3OCH2CH22?chloro?5?nitro?phenyl7cCH3OCH2CH22?nitro?4?chloro?phenyl7dCH3OCH2CH22?fluoro?4?chloro?phenyl7eCH3OCH2CH22?fluoro?4?nitro?phenyl7fCH3OCH2CH22?chloro?5?bromo?phenyl7gCH3OCH2CH22，4?dichloro?phenyl7hCH3OCH2CH22?bromo?4?chloro?phenyl7iCH3OCH2CH23?nitro?4?chloro?phenyl7jCH3CH2OCH2CH22?chloro?4?bromo?phenyl7kCH3CH2OCH2CH22?chloro?5?nitro?phenyl7lCH3CH2OCH2CH22?chloro?5?bromo?phenyl

2 化學合成

3-氨基吡嗪-2-甲酰胺(2) 在250 mL三頸圓底燒瓶中，加入3-氨基吡嗪-2-羧酸甲酯23.02 g(0.15 mol)和濃氨水200 mL，常溫攪拌10 h，反應完畢后，抽濾，將濾餅用少量水淋洗，后用少量無水乙醇淋洗，干燥，得化合物2為淡黃色粉末17.91 g。收率：86.5%；mp：236.7～237.6 ℃(文獻值：238～239 ℃[5])。

3-氨基-6-溴吡嗪-2-甲酰胺(3) 在裝有磁力攪拌子、回流冷凝管和恒壓滴液漏斗的500 mL的三頸圓底燒瓶中，加入化合物2(13.82 g，0.10 mol)和冰醋酸150 mL。通過恒壓滴液漏斗緩慢滴加2 mol/L 溴/冰醋酸溶液5 mL(16 g，0.1 mol，溶于冰醋酸50 mL)，1 h內(nèi)滴加完畢，每15 min手動劇烈振搖二頸瓶，控制水浴鍋溫度在20 ℃以下，待滴加完畢后，室溫繼續(xù)攪拌3 h。將上述反應混合物倒入冰水600 mL中，析出大量淡黃色固體，置入冰箱冷卻30 min，抽濾。將濾餅用少量冰水洗滌，后用少量無水乙醇淋洗，干燥，得化合物3為黃色固體19.10 g。產(chǎn)率：88.4%；mp：214.2～216.3 ℃(文獻值：212～213℃[6])。

6-溴-4(3H)-蝶啶酮(4) 將化合物3(21.63 g，0.1 mol)加入干燥的250 mL二頸圓底燒瓶中，加入新蒸醋酸酐100 mL和干燥除水后的原甲酸三乙酯100 mL，加熱回流3 h，回流開始溫度135 ℃，每20 min降低反應溫度5 ℃，125 ℃時反應 1 h，后繼續(xù)每20 min降低反應溫度5 ℃，直至降低至95 ℃繼續(xù)反應20 min，停止加熱，將反應液冷卻至室溫，抽濾，得到棕灰色粗品粉末。將粗品用異丙醇-水(1∶1)混合液500 mL加熱溶解后，加入活性炭約4 g脫色30 min，熱過濾，將濾液冷卻至室溫后慢慢析出絮狀物，再置于冰箱冷卻2 h，析出大量白色絮狀物。抽濾，將濾餅用少量水淋洗，后用少量無水乙醇淋醇洗，干燥，得化合物4為淡黃白色固體17.56 g。產(chǎn)率：77.7%；mp：256.3～257.5 ℃(文獻值：237～238 ℃[7])。

6-甲氧乙氧基-4(3H)-蝶啶酮(5a) 在100 mL二頸圓底燒瓶中，加入干燥乙二醇單甲醚30 mL，金屬鈉1 g(約43.4 mmol)，室溫攪拌至金屬鈉完全溶解，制備乙二醇單甲醚的鈉鹽溶液。加入化合物4(4.54 g，20 mmol)，攪拌3 h，反應完畢后，將上述反應液倒入水10 mL中，用4 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH至3～4，析出大量白色固體，冷卻，抽濾，真空干燥，得化合物5a為白色絮狀固體3.67 g。產(chǎn)率：82.7%；mp：236.6～237.8 ℃(文獻值：236.5～237 ℃[8])。

6-乙氧乙氧基-4(3H)-蝶啶酮(5b) 制備方法同化合物5a合成，用無水乙二醇乙醚代替無水乙二醇甲醚進行反應，得化合物5b為白色固體，產(chǎn)率81.1%；mp：263.1～264.8 ℃。ESI-MSm/z:235.10[M-H]-;1H NMR(DMSO-d6,400 MHz)δ:8.71(1H,s,pteridine H-2),8.24(1H,s,pteridine H-7),4.52～4.50(2H,m,CH2),3.77～3.75(2H,m,CH2),3.51(2H,q,J=7.0 Hz,CH2),1.12(3H,t,J=7.0 Hz,CH3).13C NMR(DMSO-d6,100 MHz)δ:160.33,157.51,150.86,146.31,143.10,129.83,67.71,66.29,65.65,15.07。

4-(芳香氨基)-6-烷氧基蝶啶(7) 在50 mL二頸圓底燒瓶中，加化合物5a(2.22 g，10 mmol)，二氯亞砜10 mL，滴加無水DMF 3滴，攪拌下加熱回流3 h，使原料完全反應為止。減壓蒸餾除去二氯亞砜，油泵真空干燥30 min，冷卻后得棕黃色固體。將其緩慢加入到冰水10 mL中，加入NaHCO3調(diào)節(jié)pH至7，繼續(xù)攪拌10 min，抽濾，真空干燥，得6-甲氧乙氧基-4氯蝶啶(化合物6a)為淡黃色固體1.87 g。由于化合物6a在空氣中極易吸水并水解生成4,6-二羥基蝶啶，因此直接將干燥所得固體投入下一步反應。將前一步所獲得淡黃色固體與芳香胺(10 mmol)和異丙醇150 mL共同加入250 mL單口圓底燒瓶中，均勻攪拌數(shù)min，置于微波反應器中反應，單口圓底燒瓶瓶口接球形冷凝管，球形冷凝管上端接裝有無水氯化鈣干燥管，調(diào)節(jié)反應功率和反應時間，優(yōu)選出最佳的反應條件。薄層色譜(TLC)跟蹤反應完畢后，冷卻至25 ℃，加入水約250 mL，用乙酸乙酯萃取(150 mL)3次，濃縮有機相，得淡黃色粗品，將粗品用少量二氯甲烷溶解，硅膠柱色譜分離(乙酸乙酯-石油醚，1∶4～1∶2梯度洗脫)，獲得最終產(chǎn)物7a～7i?；衔?j～7l的合成制備方法同化合物6a，用化合物5b代替化合物5a反應，得到6-乙氧乙氧基-4-氯蝶啶(6b)。之后亦直接將反應固體投入下一步反應，得最終產(chǎn)物7j～7l。

化合物7a～7l的結(jié)構(gòu)表征如下所示。

4-(2-氯-4-溴苯基氨基)-6-甲氧乙氧基蝶啶(7a) 淡黃色固體，產(chǎn)率：42.2%;mp：210.3～216.4 ℃;ESI-MSm/z:407.99[M-H]-;1H NMR(DMSO-d6,400 MHz)δ:9.74(1H,s,NH),8.92(1H,s,pteridine H-2),8.68(1H,s,pteridine H-7),8.20(1H,d,J=8.7 Hz,Ar-H),7.91(1H,d,J=2.3 Hz,Ar-H),7.67(1H,dd,J=8.7 Hz,2.3Hz,Ar-H),4.69～4.71(2H,m,CH2),3.80～3.78(2H,m,CH2),3.34(3H,s,CH3);13C NMR(DMSO-d6,100 MHz)δ:157.54,156.95,155.06,149.71,146.30,134.69,131.78,130.98,126.58,121.34,117.21,116.01,69.73,66.60,58.24。

俄羅斯將人工智能和機器人技術(shù)的管理級分為國際、聯(lián)邦、地區(qū)、市縣4級。民用人工智能系統(tǒng)和機器人技術(shù)的防御能力按俄聯(lián)邦民法129頁執(zhí)行，禁止涉足武器/軍事技術(shù)、隱私問題。

4-(2-氯-5-硝基苯基氨基)-6-甲氧乙氧基蝶啶(7b) 淡黃色固體，產(chǎn)率：43.5%;mp：165.0～167.6 ℃;ESI-MSm/z:375.10[M-H]-;1H NMR(DMSO-d6,400 MHz)δ:9.78(1H,s,NH),9.30(1H,d,J=2.8 Hz,Ar-H),8.95(1H,s,pteridine H-2),8.80(1H,s,pteridine H-7),8.06(1H,dd,J=8.8 Hz,2.6 Hz,Ar-H),7.92(1H,d,J=8.8 Hz,Ar-H),4.68～4.70(2H,m,CH2),3.80～3.82(2H,m,CH2),3.35(3H,s,CH3);13C NMR(DMSO-d6,100 MHz)δ:157.10,154.92,149.76,146.77,136.08,132.60,132.32,130.79,121.43,120.17,118.32,118.00,69.68,66.74,58.26。

4-(2-硝基-4-氯苯基氨基)-6-甲氧乙氧基蝶啶(7c) 黃色粉末，產(chǎn)率：49.5%;mp：170.2～174.1 ℃;ESI-MSm/z:375.10[M-H]-;1H NMR(CDCl3,400 MHz)δ:9.57(1H,d,J=9.2 Hz,Ar-H),8.99(1H,s,NH),8.89(1H,s,pteridine H-2),8.37(1H,s,pteridine H-7),7.79(1H,dd,J=9.2 Hz,2.5 Hz,Ar-H),7.74(1H,d,J=8.1 Hz,Ar-H),4.81～4.83(2H,m,CH2),3.93～3.95(2H,m,CH2),3.50(3H,s,CH3);13C NMR(CDCl3,100 MHz)δ:157.69,157.13,155.39,146.84,136.48,130.09,128.15,127.69,126.00,123.42,122.57,116.20,70.32,67.60,59.40。

4-(2-氟-4-氯苯基氨基)-6-甲氧乙氧基蝶啶(7d) 黃色粉末，產(chǎn)率：47.8%;mp：174.5～177.8 ℃;ESI-MSm/z:348.10[M-H]-;1H NMR(CDCl3,400 MHz)δ:8.89(1H,s,NH),8.85～8.81(2H,m,pteridine H-2,Ar-H),8.76(1H,s,pteridine H-7),7.26～7.22(2H,m,Ar-H),4.67～4.69(2H,m,CH2),3.88～3.90(2H,m,CH2),3.50(3H,s,CH3);13C NMR(CDCl3,100 MHz)δ:157.35,157.00,155.89,154.05,150.22,146.30,128.64,125.83,125.09,122.57,121.88,116.07,70.31,67.00,59.47。

4-(2-氟-4-硝基苯基氨基)-6-甲氧乙氧基蝶啶(7e) 淡黃色固體，產(chǎn)率：50.2%;mp：156.1～159.4 ℃;ESI-MSm/z:359.15[M-H]-;1H NMR(CDCl3,400 MHz)δ:9.81(1H,s,NH),8.88(1H,s,pteridine H-2),8.59(1H,s,pteridine H-7),7.82(1H,t,J=8.5 Hz,Ar-H),7.61(1H,dd,J=10.4 Hz,2.4 Hz,Ar-H),7.39(1H,d,J=8.6 Hz,Ar-H),4.72～4.74(2H,m,CH2),3.76～3.78(2H,m,CH2),3.34(3H,s,CH3);13C NMR(CDCl3,100 MHz)δ:157.61,156.57,155.55,150.46,147.08,134.07,133.38,132.69,121.95,121.28,120.32,111.05,70.25,67.24,59.50。

4-(2-氯-5-溴苯基氨基)-6-甲氧乙氧基蝶啶(7f) 黃色粉末，產(chǎn)率：46.6%;mp：176.5～178.1 ℃;ESI-MSm/z:408.00[M-H]-;1H NMR(CDCl3,400 MHz)δ:9.33(1H,s,NH),9.27(1H,d,J=2.3 Hz,Ar-H),8.96(1H,s,pteridine H-2),8.84(1H,s,pteridine H-7),7.33(1H,d,J=8.5 Hz,Ar-H),7.22(1H,dd,J=8.5 Hz,2.3 Hz,Ar-H),4.68～4.70(2H,m,CH2),3.88～3.90(2H,m,CH2),3.50(3H,s,CH3);13C NMR(CDCl3,100 MHz)δ:157.31,156.67,155.76,150.05,146.32,136.01,130.23,126.91,123.64,121.91,121.80,121.51,70.22,67.03,59.44。

4-(2,4-二氯苯基氨基)-6-甲氧乙氧基蝶啶(7g) 黃色粉末，產(chǎn)率：61.7%;mp：84.2～185.5 ℃;ESI-MSm/z:364.05[M-H]-;1H NMR(CDCl3,400 MHz)δ:9.32(1H,s,NH),9.12(1H,d,J=2.5 Hz,Ar-H),8.94(1H,s,pteridine H-2),8.83(1H,s,pteridine H-7),7.38(1H,d,J=8.6 Hz,Ar-H),7.06(1H,dd,J=8.6 Hz,2.5 Hz,Ar-H),4.68～4.70(2H,m,CH2),3.88～3.91(2H,m,CH2),3.50(3H,s,CH3);13C NMR(CDCl3,100 MHz)δ:157.12,156.53,155.59,149.95,146.15,135.66,133.62,129.77,123.77,121.75,120.92,120.66,70.06,66.85,59.28。

4-(2-溴-4-氯苯基氨基)-6-甲氧乙氧基蝶啶(7h) 黃色粉末，產(chǎn)率：76.5%;mp：175.0～178.4 ℃;ESI-MSm/z:401.15[M+H]+;1H NMR(DMSO-d6,400 MHz)δ:9.71(1H,s,NH),8.91(1H,s,pteridine H-2),8.69(1H,s,pteridine H-7),8.33(1H,d,J=8.8 Hz,Ar-H),7.91(1H,d,J=2.4 Hz,Ar-H),7.58(1H,dd,J=8.8 Hz,2.4 Hz,Ar-H),4.67～4.70(2H,m,CH2),3.78～3.81(2H,m,CH2),3.34(3H,s,CH3);13C NMR(CDCl3,100 MHz)δ:157.34,156.95,155.79,150.05,146.27,134.93,132.12,129.03,128.83,122.02,113.98,100.18,70.25,67.07,59.48。

4-(4-氯-3-硝基苯基氨基)-6-甲氧乙氧基蝶啶(7i) 黃色粉末，產(chǎn)率：50.4%;mp：172.8～175.3 ℃;ESI-MSm/z:401.15[M+H]+;1H NMR(CDCl3,400 MHz)δ:8.91(1H,s,NH),8.84(1H,s,pteridine H-2),8.65～8.60(2H,m,pteridine H-7,Ar-H),8.12(1H,dd,J=9.0 Hz,2.6 Hz,Ar-H),7.58(1H,d,J=8.9 Hz,Ar-H),4.69～4.71(2H,m,CH2),3.88～3.90(2H,m,CH2),3.50(3H,s,CH3);13C NMR(CDCl3,100 MHz)δ:157.50,156.95,155.73,150.42,148.24,146.75,197.91,132.48,124.54,121.49,121.32,117.03,76.95,67.22,59.60。

4-(2-氯-5-硝基苯基氨基)-6-乙氧乙氧基蝶啶(7k) 淡黃色固體，產(chǎn)率：68.5%;mp：160.2～164.4 ℃;ESI-MSm/z:389.15[M-H]-;1H NMR(DMSO-d6,400 MHz)δ:9.83(1H,s,NH),9.30(1H,d,J=2.7 Hz,Ar-H),8.97(1H,s,pteridine H-2),8.81(1H,s,pteridine H-7),8.09(1H,dd,J=8.8 Hz,2.7 Hz,Ar-H),7.94(1H,d,J=8.8 Hz,Ar-H),4.68～4.71(2H,m,CH2),3.83～3.86(2H,m,CH2),3.55(2H,q,J=7.0 Hz,CH2),1.28(3H,t,J=7.0 Hz,CH3);13C NMR(CDCl3,100 MHz)δ:157.36,156.50,155.49,150.04,147.30,146.67,135.81,129.67,128.76,121.70,118.20,115.59,67.96,67.20,67.04,15.14。

4-(2-氯-5-溴苯基氨基)-6-乙氧乙氧基蝶啶(7l) 淡黃色固體，產(chǎn)率：54.9%;mp：161.2～167.5 ℃;ESI-MSm/z:424.30[M+H]+,1H NMR(DMSO-d6,400 MHz)δ:9.83(1H,s,NH),9.29(1H,d,J=2.7 Hz,Ar-H),8.97(1H,s,pteridine H-2),8.81(1H,s,pteridine H-7),8.09(1H,dd,J=8.8 Hz,2.7 Hz,Ar-H),7.94(1H,d,J=8.9 Hz,Ar-H),4.68～4.71(2H,m,CH2),3.83～3.86(2H,m,CH2),3.55(2H,q,J=7.0 Hz,CH2),1.14(3H,t,J=7.0 Hz,CH3).13C NMR(DMSO-d6,100 MHz)δ:157.41,156.73,155.65,150.13,146.24,136.25,130.17,126.87,123.53,121.79,121.92,121.63,70.11,67.01,59.39,15.30。

3 抗腫瘤活性評價

3.1 細胞的培養(yǎng)

A549細胞、HGC-27細胞、KG1a細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清F-12K的培養(yǎng)液中，加入100 U/mL鏈霉素和10 μg/mL青霉素。當細胞處于分裂生長狀態(tài)時，將細胞接種于25 mL的培養(yǎng)瓶中，在37 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔2～3天換一次培養(yǎng)液。待瓶中細胞長滿后，再進行傳代，凍存。

3.2 藥物濃度梯度的配制

精密稱取樣品4 mg，用DMSO稀釋成0.5 mL，過0.22 μm微孔濾膜除菌后，精密移取20 μL，用DMEM培養(yǎng)基1 980 μL稀釋100倍，得80 μg/mL藥品供試液。再經(jīng)DMEM培養(yǎng)基稀釋后得到濃度梯度分別為80，40，20，10，5，2.5，1.25 μg/mL的藥品供試液。

3.3 藥物對腫瘤細胞生長的抑制作用

收集對數(shù)期的A549細胞、KG1a細胞和HGC-27細胞，調(diào)整細胞懸液濃度，在每個孔中加入100 μL，鋪板使A549細胞、KG1a細胞和HGC-27細胞密度達到每孔1×104個。細胞貼壁24 h后再給藥，吸棄培養(yǎng)基，每孔加入“3.2”項各濃度的藥物供試液100 μL，同時設(shè)3個復孔。5% CO2、37 ℃孵育48 h后，在倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。在每個孔中加入MTT溶液10 μL，37 ℃孵育2 h后終止培養(yǎng)。同時設(shè)置陰性對照孔(與最高濃度藥物溶液相同濃度的DMSO溶解介質(zhì)、培養(yǎng)液、細胞、MTT)、空白對照孔(培養(yǎng)液、細胞、MTT)和調(diào)零孔(MTT、培養(yǎng)液)。用酶標儀測量每一個孔的吸收度A450，計算生長抑制率。用相同藥物的不同濃度對腫瘤細胞生長抑制率作圖，得到劑量-抑制率反應曲線，根據(jù)Prism 5軟件計算出該藥物的半數(shù)抑制濃度IC50。

4 結(jié)果與討論

4.1 目標化合物的設(shè)計

在設(shè)計目標化合物時，本研究以文獻中表皮生長因子受體(epidemal growth factor receptor，EGFR)與厄洛替尼的結(jié)合模型為參考模板。首先，通過分析臨床應用的抑制劑厄洛替尼(erlotinib)和吉非替尼(gefitinib)(圖2)，可以發(fā)現(xiàn)它們的母核都是喹唑啉環(huán)。兩者的主要的結(jié)構(gòu)區(qū)別是在喹唑啉環(huán)的4號位為(N-芳基)胺基，6、7號位的為不同結(jié)構(gòu)的基團取代，結(jié)構(gòu)的差異能夠改變小分子抑制劑的電荷分布以及親疏水性能。

Figure2 Chemical structures of erlotinib,gefitinib and pharmacophore of quinazolines inhibitors

結(jié)合喹唑啉類抑制劑的藥效團結(jié)構(gòu)(圖2)以及查閱的文獻資料[9-11]發(fā)現(xiàn)，厄洛替尼的喹唑啉環(huán)占據(jù)了疏水腔Ⅰ(由Leu694、Val702、Val718、Thr766～Cys773、Leu820等氨基酸殘基構(gòu)成)。喹唑啉母環(huán)上的1-N原子與Met769成氫鍵；而3-N原子以一個水分子為橋梁，和受體的Thr766氨基酸殘基相互作用形成氫鍵。喹唑啉母環(huán)上的4位取代芳香胺占據(jù)了疏水腔Ⅱ(由Ile720、Lys721、Glu738、Met742、Leu764、Thr766、Thr830～Gly833等氨基酸殘基構(gòu)成)。取代芳香胺上的3位乙炔基指向受體內(nèi)部；喹唑啉母環(huán)上的6，7-位烷氧基取代位于ATP結(jié)合腔開口處，指向水相，并不與受體表面結(jié)合。開口處附近有EGFR蛋白所特有的氨基酸殘基Cys773，但它并未參與受體與厄洛替尼的相互作用。

基于以上結(jié)果，推測喹唑啉類酪氨酸激酶抑制劑各片段在結(jié)合受體時的作用，歸結(jié)如下：(1)喹唑啉的母核芳香環(huán)B、C駢合后占據(jù)疏水腔Ⅰ，對應于ATP的嘌呤環(huán)；(2)為使候選藥物具有生物活性，環(huán)B上的1-N原子和X片段須與相應氨基酸殘基形成氫鍵，從而使藥物進入受體后可穩(wěn)固結(jié)合并具備與ATP競爭結(jié)合受體的能力；(3)芳香環(huán)C的作用是固定環(huán)B在疏水腔Ⅰ中的取向，其為五元環(huán)或六元環(huán)，并且具有結(jié)構(gòu)優(yōu)化的修飾位點；(4)當抑制劑與受體結(jié)合時，取代苯環(huán)A進入疏水腔Ⅱ，而ATP結(jié)合時并未利用此空腔。取代苯環(huán)A上的基團R1為親脂性基團，以鹵素原子較為適合，因為其體積適中疏水腔Ⅱ形成疏水-疏水相互作用；(5)當環(huán)C上的取代基R2基團為6，7位取代的烷氧基或烷胺基側(cè)鏈時，抑制劑對ErbB2亞型選擇性較好。這些基團不進入受體結(jié)合區(qū)域，而是處于水相介質(zhì)中，是調(diào)節(jié)化合物理化性質(zhì)進而改善其結(jié)合常數(shù)的重要改造位點，如化合物的水溶性等。

以吉非替尼和厄洛替尼為先導化合物，根據(jù)生物電子等排原理，將先導化合物中的母核喹唑啉環(huán)用蝶啶環(huán)替代。為了改善母核環(huán)上的電荷密度和新設(shè)計的化合物親疏水性能，使其更能被靶標分子(受體酪氨酸激酶)識別，對蝶啶母核進行結(jié)構(gòu)修飾，將兩種長鏈烷氧基(甲氧乙氧基和乙氧乙氧基)引入蝶啶環(huán)6位上，通過烷氧基的供電子效應增加蝶啶環(huán)上的1-N與3-N的電荷密度，從而促進氫鍵的生成；同時由于用N原子取代喹唑啉5,8位的C原子形成蝶啶環(huán)后，增加了生成氫鍵的概率。與先導化合物的結(jié)構(gòu)類似，在6-烷氧基取代蝶啶的4位引入含有疏水基團的芳香胺，芳香環(huán)上的鹵原子取代基增加了目標化合物的疏水性，以期提高目標化合物的疏水性能，從而增加所設(shè)計的目標化合物與靶標分子的結(jié)合能力并提高其生物活性。

利用計算機輔助藥物設(shè)計程序(Sybyl-X1.3)對目標化合物與PTKs進行分子對接(Surflex-Dock)。以化合物7b與EGFR(PDB code 1M17)為例，其結(jié)果如圖3所示?；衔?b的蝶啶4位苯胺基處于由氨基酸殘基Val702、Ala719、Lys721、Glu738、Met742、Leu764、Thr766、Asp831組成的疏水腔內(nèi)(圖3-A)，這為苯胺上的親脂性取代基(-Cl、-NO2)與該區(qū)域內(nèi)的疏水性氨基酸殘基形成疏水作用創(chuàng)造了條件。此外，還發(fā)現(xiàn)化合物7b蝶啶環(huán)的3位N與Lys721殘基上的氨基氫形成氫鍵(圖3-B)。

4.2 抗腫瘤活性研究

本實驗選用人非小細胞肺癌細胞A549、人急性髓性白血病細胞KG1a和人胃癌細胞HGC-273種腫瘤細胞株作為受試對象，利用MTT法來測定所合成的12個目標化合物以及1個對照物(吉非替尼)的體外抑制活性，結(jié)果如表2所示。

5 結(jié) 論

本實驗研究結(jié)果表明，蝶啶4位為2-氯-5-硝基苯胺基取代時，其活性均高于其他取代苯胺基取代的產(chǎn)物。對于人非小細胞肺癌細胞A549，化合物7b活性最高，IC50為11.55 μmol/L，活性接近陽性對照物吉非替尼的IC50(5.95 μmol/L)，與其他化合物相比均有顯著性差異(P<0.05)。此外化合

Figure3 Docking pose of compound7bbound to EGFR(A) and the binding mode of compound7bbound to EGFR(B)

Table2 IC50of compounds7a-7l

CompdIC50/(μmol/L)A549KG1aHGC?277a5102±40719279±1590>194817b1155±57116576±563>212347cNoinhibition17571±385Noinhibition7d>2287323068±1604>228737e8473±133210228±133513419±34447f14716±48757542±20948920±25847gNoinhibition21682±2075Noinhibition7hNoinhibition19262±138114302±41157iNoinhibition>21234Noinhibition7j>1883813003±5588>188387k2490±9496991±8144023±8067l10855±587317886±1837NoinhibitionGefitinib595±0544222±6312211±1313

物7k對人非小細胞肺癌細胞A549、人急性髓性白血病細胞KG1a和人胃癌細胞HGC-27均有良好的藥物活性，對3組細胞的IC50均接近吉非替尼的IC50，與其他化合物相比均有顯著性差異(P<0.05)。究其原因，可以從兩個方面進行討論：(1)根據(jù)以往文獻中的報道[12-13]，硝基存在與受體中的氨基酸殘基形成氫鍵的潛在可能；(2)由于硝基具有較強親脂性(疏水性)[14]，可與激酶疏水結(jié)合區(qū)域之間形成強疏水作用。通過生物活性試驗篩選出的化合物均有2-氯-5-硝基苯胺基片段，以此結(jié)構(gòu)為參考進行優(yōu)化，為開發(fā)一類新型酪氨酸激酶抑制劑奠定基礎(chǔ)。

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