金雙龍，王 芳，鄒 毅，王 燕，胡 月，郭文潔，徐 強*，賴宜生**

(1中國藥科大學(xué)新藥研究中心，江蘇省代謝性疾病藥物重點實驗室，南京 210009；2南京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，醫(yī)藥生物技術(shù)國家重點實驗室，南京 210093)

吲哚胺2,3-雙加氧酶1(IDO1)是人體肝臟外催化色氨酸沿犬尿氨酸途徑代謝的起始和限速酶。研究表明，IDO1通過催化色氨酸代謝從而對機體的固有免疫和適應(yīng)性免疫起重要的調(diào)節(jié)作用[1]。在腫瘤微環(huán)境中，腫瘤細胞可以通過誘導(dǎo)IDO1的過度表達，造成局部色氨酸耗竭和犬尿氨酸等代謝物的聚積，從而通過激活GCN2和AHR信號通路抑制T細胞的增殖及誘導(dǎo)其凋亡，并且刺激初始T細胞分化成調(diào)節(jié)性T細胞，進而介導(dǎo)腫瘤免疫逃逸[2]。因此，IDO1已成為目前腫瘤免疫治療小分子藥物研發(fā)的熱門靶點。

近年來，科研人員通過天然產(chǎn)物、高通量篩選和虛擬篩選等途徑陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了醌類、吲哚類、咪唑類、呋咱羥脒類等結(jié)構(gòu)類型的IDO1抑制劑。其中，Ueng課題組[3]于2014年報道了一系列苯磺酰肼類IDO1抑制劑，化合物U-3i對IDO1的抑制活性最強，在基于HeLa細胞的酶活測試中其EC50為172 nmol/L。分子對接結(jié)果表明，除了疏水和氫鍵相互作用以外，化合物U-3i結(jié)構(gòu)中磺?；囊粋€氧原子還與血紅素鐵離子形成絡(luò)合作用。

為了尋找新型IDO1抑制劑，本研究在化合物U-3i的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上，考慮到肼類化合物潛在的毒性[4]，通過生物電子等排原理，結(jié)合計算機模擬分子對接技術(shù)，設(shè)計并合成了一系列苯磺酰胺類目標(biāo)化合物(圖1)，在考察中間連接鏈的基礎(chǔ)上，側(cè)重探索了伸向IDO1活性口袋A和B的兩個苯環(huán)上取代基對活性的影響。體外活性測試結(jié)果表明，化合物3b和3e對基于HeLa細胞的IDO1活性顯示出了較好的抑制作用。進一步實驗表明，化合物3b和3e能夠促進T細胞的增殖，誘導(dǎo)γ干擾素(IFN-γ)的生成，并且能夠抑制調(diào)節(jié)性T細胞的分化，因此具有進一步研究的價值。

Figure1 Design of target compounds

1 合成路線

各種取代的苯磺酰氯與取代苯胺或芐胺進行縮合反應(yīng)生成相應(yīng)的苯磺酰胺3a～3h。其中，4-乙酰胺基苯磺酰胺衍生物(3b～3d)在濃鹽酸的存在下經(jīng)脫乙?；玫?-胺基苯磺酰胺鹽酸鹽，最后經(jīng)碳酸鉀中和即制得4-胺基苯磺酰胺衍生物4a～4c(路線1)。所有目標(biāo)化合物的結(jié)構(gòu)均經(jīng)MS和1H NMR確證。

Scheme1 Reagents and conditions:(i) TEA,DCM,r.t.,5 h;(ii) HCl,ethanol,reflux,12 h;(iii) K2CO3

2 實驗部分

2.1 儀器和試劑

熔點采用RY-1型熔點儀測定，溫度計未經(jīng)校正；1H NMR使用ACF-300 MHz型核磁共振儀測定，TMS為內(nèi)標(biāo)；MS使用Agilent 1100 Series LC/MSD Trap(SL)質(zhì)譜儀測定。所有試劑未經(jīng)特別說明均為市售化學(xué)純或分析純產(chǎn)品。

2.2 化學(xué)合成

N-(4-(N-(4-氰芐基)氨磺酰)苯基)乙酰胺(3a)的合成 將4-氰基苯乙胺(1.00 g,7.57 mmol)溶于無水二氯甲烷(15 mL)中，加入三乙胺(1.26 mL,8.75 mmol)，冰浴下滴入含4-乙酰氨基苯磺酰氯(1.93 g,8.32 mmol)的無水二氯甲烷溶液5 mL，滴畢于冰浴中攪拌30 min，撤去冰浴，室溫反應(yīng)4 h，加水25 mL，二氯甲烷萃取，無水硫酸鎂干燥，柱色譜(EA-PE，1∶5)純化得到白色固體2.18 g，收率87%，mp 212～213 ℃。1H NMR(300 MHz,DMSO-d6)δ：10.31(1H,s,CONH),8.18(1H,s,NH),7.71(6H,q,J=9.8,8.8 Hz,Ar-H),7.44(2H,dd,J=8.3,4.3 Hz,Ar-H),4.05(2H,d,J=7.0 Hz,CH2),2.25～1.99(3H,m,CH3);ESI-MS:m/z328.0[M-H]-。

用類似的方法制備得到目標(biāo)化合物3b～3h。

N-(4-(N-(4-甲氧基芐基)氨磺酰)苯基)乙酰胺(3b) 白色固體，收率80%，mp 188～190 ℃。1H NMR(300 MHz,DMSO-d6)δ:10.38(1H,s,CONH),7.96(1H,s,NH),7.76～7.68(4H,m,Ar-H),7.13(2H,d,J=8.3 Hz,Ar-H),6.83(2H,d,J=8.3 Hz,Ar-H),3.86(2H,s,CH2),3.71(3H,s,OCH3),2.09(3H,s,CH3);ESI-MS:m/z333.0[M-H]-。

N-(4-(N-(4-甲氧基苯基)氨磺酰)苯基)乙酰胺(3c) 白色固體，收率88%，mp 206～208 ℃。1H NMR(300 MHz,DMSO-d6)δ:10.29(1H,s,CONH),9.77(1H,s,NH),7.78～7.49(4H,m,Ar-H),6.95(2H,dq,J=8.2,3.2 Hz,Ar-H),6.86～6.70(2H,m,Ar-H),3.66(3H,q,J=2.2 Hz,OCH3),2.06(3H,q,J=3.5 Hz,CH3);ESI-MS:m/z319.0[M-H]-。

N-(4-(N-(4-氟苯基)氨磺酰)苯基)乙酰胺(3d) 白色固體，收率91%，mp 190～192 ℃。1H NMR(300 MHz,DMSO-d6)δ:10.32(1H,d,J=5.5 Hz,CONH),10.13(1H,s,NH),7.78～7.56(4H,m,Ar-H),7.20～6.97(4H,m,Ar-H),2.06(3H,d,J=5.2 Hz,CH3);ESI-MS:m/z307.0[M-H]-。

N-(4-氰芐基)-3-硝基苯磺酰胺(3e) 紅色固體，收率90%，mp 153～155 ℃。1H NMR(300 MHz,DMSO-d6)δ:8.85～8.32(3H,m,Ar-H),8.14(1H,s,NH),7.99～7.61(3H,m,Ar-H),7.39(2H,s,Ar-H),4.16(2H,s,CH2);ESI-MS:m/z316.0[M-H]-。

N-(4-甲氧基芐基)-3-硝基苯磺酰胺(3f) 紅色固體，收率80%，mp 103～105 ℃。1H NMR(300 MHz,DMSO-d6)δ:8.45(1H,s,NH),8.37(1H,ddd,J=8.3,2.3,1.0 Hz,Ar-H),8.30(1H,t,J=2.0 Hz,Ar-H),8.10(1H,ddd,J=7.9,1.8,1.0 Hz,Ar-H),7.79(1H,t,J=8.0 Hz,Ar-H),7.09～7.00(2H,m,Ar-H),6.76～6.65(2H,m,Ar-H),3.98(2H,s,CH2),3.64(3H,s,CH3);ESI-MS:m/z321.0[M-H]-。

N-(4-甲氧基苯基)-3-硝基苯磺酰胺(3g) 紅色固體，收率86%，mp 130～132 ℃。1H NMR(300 MHz,CHCl3-d)δ:8.61(1H,t,J=2.0 Hz,Ar-H),8.43(1H,ddd,J=8.3,2.2,1.1 Hz,Ar-H),7.99(1H,ddd,J=7.8,1.8,1.1 Hz,Ar-H),7.68(1H,t,J=8.0 Hz,Ar-H),7.06～6.98(2H,m,Ar-H),6.87～6.71(2H,m,Ar-H),6.52(1H,s,NH),3.80(3H,s,CH3);ESI-MS:m/z307.0[M-H]-。

4-氰基-N-(4-甲氧基芐基)苯磺酰胺(3h) 白色固體，收率75%，mp 137～139 ℃。1H NMR(300 MHz,CHCl3-d)δ:7.99～7.90(2H,m,Ar-H),7.85～7.75(2H,m,Ar-H),7.15～7.04(2H,m,Ar-H),6.86～6.75(2H,m,Ar-H),4.94(1H,t,J=5.9 Hz,NH),4.16(2H,d,J=5.9 Hz,CH2),3.80(3H,s,CH3);ESI-MS:m/z301.0[M-H]-。

4-氨基-N-(4-甲氧基苯基)苯磺酰胺(4a) 將3c(0.50 g,1.56 mmol)溶于乙醇(10 mL)中，加入濃鹽酸(3 mL)，回流12 h，冷卻至室溫，加入飽和碳酸鉀溶液將反應(yīng)液pH調(diào)到9。減壓除去乙醇，乙酸乙酯萃取，無水硫酸鎂干燥，減壓蒸除溶劑，得到白色固體0.42 g，收率97%，mp 131～133 ℃。1H NMR(300 MHz,DMSO-d6)δ:9.48(1H,s,NH),7.40～7.19(2H,m,Ar-H),7.06～6.86(2H,m,Ar-H),6.84～6.70(2H,m,Ar-H),6.59～6.42(2H,m,Ar-H),5.95(2H,s,NH2),3.66(3H,d,J=2.3 Hz,CH3);ESI-MS:m/z277.0[M-H]-。

用類似的方法制備得到目標(biāo)化合物4b～4c。

4-氨基-N-(4-氟苯基)苯磺酰胺(4b) 白色固體，收率78%，mp 151～153 ℃。1H NMR(300 MHz,DMSO-d6)δ:9.81(1H,s,NH),7.38～7.29(2H,m,Ar-H),7.06(4H,dd,J=7.0,3.2 Hz,Ar-H),6.52(2H,dd,J=8.9,3.1 Hz,Ar-H),5.99(2H,s,NH2);ESI-MS:m/z265.0[M-H]-。

4-氨基-N-(4-甲氧基芐基)苯磺酰胺(4c) 白色固體，收率75%，mp 94～96 ℃。1H NMR(300 MHz,DMSO-d6)δ:7.54(1H,s,NH),7.43(2H,d,J=8.3 Hz,Ar-H),7.19～7.09(2H,m,Ar-H),6.91-6.79(2H,m,Ar-H),6.65～6.54(2H,m,Ar-H),5.94(2H,s,NH2),3.79(2H,s,CH2),3.72(3H,s,CH3);ESI-MS:m/z291.0[M-H]-。

2.3 生物活性評價

2.3.1 基于HeLa細胞的酶活性評價 按每孔5×103個細胞的密度將HeLa細胞接種在96孔培養(yǎng)板中，貼壁后加入IFN-γ(100 ng/mL)處理24 h，吸去上清液，加入L-色氨酸(15 μg/mL)、IFN-γ(100 ng/mL)、受試物至200 μL體系，設(shè)置空白對照、模型組和藥物處理組(以GDC-0919[5]為陽性對照)，培養(yǎng)24 h，收集上清液140 μL，加入6.1 mol/L三氯乙酸10 μL，50 ℃溫育30 min，離心去除沉淀物。將各孔上清液100 μL移至另一96孔板中，與等體積20 mg/mL對-二甲氨基苯甲醛的乙酸溶液混合。使用酶標(biāo)儀在480 nm處檢測吸收度，計算化合物的IC50。

2.3.2 T細胞轉(zhuǎn)化實驗 將處理過的B16F1細胞(每孔8×104個細胞)、小鼠脾臟淋巴細胞(每孔1×106個細胞，使用5 μg/mL ConA刺激)加入24孔板中，加入對應(yīng)濃度的化合物后置于37 ℃、濕度95%、5% CO2的培養(yǎng)箱中孵育48 h。一方面，加入MTT(終濃度4 mg/mL)20 μL培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h，酶標(biāo)儀測定570 nm波長處吸收度，計算T細胞增殖率；另一方面，收集上清液使用ELISA檢測細胞因子IFN-γ含量，同時使用抗CD4、抗CD25、抗FOCP3抗體染色，在流式細胞儀中檢測T細胞的分化。

2.4 分子模擬

利用Schr?dinger軟件包(2009)中的Protein and Ligand Preparation模塊在基于OPLS-2005的力場條件下對蛋白加氫、加電荷和質(zhì)子化處理，并進行能量優(yōu)化；小分子使用Ligprep模塊進行配體準(zhǔn)備。利用Gold進行分子對接，采用含血紅素參數(shù)的GoldScore打分函數(shù)，此參數(shù)是由PDB數(shù)據(jù)庫經(jīng)統(tǒng)計分析得到[6]。以血紅素亞鐵離子為中心，其10 ?半徑內(nèi)氨基酸殘基作為對接的活性位點。在對接中使用遺傳算法，運行10次。范德華和氫鍵參數(shù)的截斷值分別設(shè)為4.0和2.5 ?。保留打分最高的結(jié)合模式作為最終對接結(jié)果用于分析。

3 結(jié)果與討論

體外基于HeLa細胞的酶活性檢測結(jié)果如表1所示，大部分化合物對IDO1都顯示出一定的抑制活性，其中化合物3b和3e的活性較強，其IC50分別為5.88和10.25 μmol/L。

Table1 Inhibitory activity of the target compounds against IDO1

CompdR1R2nIC50/(μmol/L)3ap?CH3CONHp?CN154083bp?CH3CONHp?OCH315883cp?CH3CONHp?OCH3057283dp?CH3CONHp?F0>1003em?NO2p?CN110253fm?NO2p?OCH3133753gm?NO2p?OCH3042613hp?CNp?OCH3137934ap?NH2p?OCH3038624bp?NH2p?F0>1004cp?NH2p?OCH31>100GDC?0919035

為了了解化合物3b和3e對T細胞增殖和調(diào)節(jié)性T細胞分化的影響情況，本研究利用高表達IDO1的B16F1細胞與小鼠脾臟淋巴細胞共培養(yǎng)體系開展了T細胞轉(zhuǎn)化實驗，結(jié)果如圖2所示。一方面，在混合細胞體系中，B16F1細胞會對T細胞的增殖產(chǎn)生抑制作用，而化合物3b和3e能在一定程度上增加T細胞的增殖，其中，化合物3e能使T細胞的增殖率提高35%(圖2-A)，而且化合物3b和3e能夠促進IFN-γ的生成(圖2-B)。另一方面，從圖2-C和圖2-D可以看出，當(dāng)初始T細胞與B16F1細胞共培養(yǎng)時，調(diào)節(jié)性T細胞的數(shù)量與對照組相比增加了4倍多，而化合物3b和3e與陽性藥GDC-0919一樣都能明顯抑制調(diào)節(jié)性T細胞的分化。這些實驗結(jié)果提示，化合物3b和3e能夠通過抑制IDO1來逆轉(zhuǎn)其介導(dǎo)的免疫抑制。

初步構(gòu)效關(guān)系分析表明，從中間連接鏈來看，與苯胺衍生物(3c,3d,3f)相比，芐胺衍生物(3a,3b,3g)展現(xiàn)出更強的活性，尤其是化合物3b(IC50:5.88 μmol/L)的活性比化合物3c(IC50:57.28 μmol/L)提高近10倍，說明芐胺相對于苯胺更有利于活性的提高(4a和4c除外)。從伸向B口袋的苯環(huán)上的取代基來看，含有供電子基的化合物活性普遍強于相應(yīng)的吸電子基(3b優(yōu)于3a，3c優(yōu)于3d，4a優(yōu)于4b，但3f不如3e)。有趣的是，從A口袋的苯環(huán)上的取代基來看，如果將4-乙酰胺基水解成胺基時活性明顯下降(4a除外)，而且從含有硝基和氰基的3e～3h來看，它們都具有較好的活性，提示A口袋苯環(huán)上的吸電子基比強供電子基(胺基)可能更有利于活性的提高。

*P< 0.05vsT+B16F1 group

為了進一步說明化合物的構(gòu)效關(guān)系，本研究使用分子對接方法研究了化合物3b在IDO1活性位點中的結(jié)合模式。從圖3可以看出，苯磺酰胺片段能很好地深入口袋A內(nèi)部，并與Phe163產(chǎn)生π-π相互作用，而芐胺片段則伸向由Phe163,Phe226,Arg231,Leu234和Ile354形成的B口袋。此外，磺酰基中的一個氧原子與血紅素亞鐵產(chǎn)生絡(luò)合作用，而另一個氧原子則與loop區(qū)Ala264 NH形成氫鍵作用。這些信息為本研究后續(xù)開展結(jié)構(gòu)優(yōu)化提供了理論指導(dǎo)。

Figure3 Proposed binding mode of compound3bdocked into the crystal structure of human IDO1(PDB ID:4PK5)

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