陳躍華， 范鈺， 郎亞昆

胃癌在常見(jiàn)惡性腫瘤中排第四位，在全球惡性腫瘤死亡中居第二位[1-2]。由于缺乏早期檢測(cè)的理想生物標(biāo)志物，超過(guò)80%的胃癌被診斷時(shí)已為晚期[2]。胃癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制尚不明確，限制了其治療[3]。因此，探尋胃癌分子靶點(diǎn)和新的生物標(biāo)志物是胃癌研究的熱點(diǎn)[3-4]。

長(zhǎng)鏈非編碼RNA(Long non-coding RNA，LncRNA)定義為>200 nt的轉(zhuǎn)錄物，參與許多重要的細(xì)胞過(guò)程及發(fā)病機(jī)制。據(jù)報(bào)道，LncRNA在許多類(lèi)型的腫瘤中差異表達(dá)[5-6]。幾項(xiàng)研究表明，LncRNA在血液樣品中非常穩(wěn)定，因此可以對(duì)血液中的LncRNA進(jìn)行定量檢測(cè)[7-8]。循環(huán)LncRNA作為許多癌癥類(lèi)型的診斷和預(yù)后分子標(biāo)志物已被廣泛研究，包括肺癌、結(jié)直腸癌、肝癌、乳腺癌等[9-19]。 然而，與胃癌相關(guān)的特異性RNA仍然知之甚少[9，20-21]。有研究表明，HULC可以在體外促進(jìn)不同的促致癌表型[22]、體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)[23]和血管發(fā)生[24]。這些研究共同表明，HULC失調(diào)在腫瘤發(fā)生中起關(guān)鍵作用。HULC在許多癌癥包括肝細(xì)胞癌[25]，胃癌[22]，胰腺癌[26]，骨肉瘤[27]和結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移中異常上調(diào)[28]。Zhao等[24]在58例胃癌和配對(duì)相鄰組織中定量HULC表達(dá)的研究中發(fā)現(xiàn)，HULC水平在胃癌組織中明顯上調(diào)。本研究旨在通過(guò)觀察LncRNA HULC在胃癌患者血清中的表達(dá)與臨床病理之間的關(guān)系，提高胃癌早期診斷率，有效遏制腫瘤轉(zhuǎn)移和擴(kuò)散。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 2012年1月至2014年12月，以江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤中心未接受過(guò)手術(shù)及放化療的90例胃癌患者(胃癌組)及90名健康志愿者(對(duì)照組)作為研究對(duì)象。本研究通過(guò)江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者及健康志愿者均已簽署知情同意書(shū)。

1.2 研究方法 RNA提取 試劑TriIzol購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。反轉(zhuǎn)錄PCR及定量PCR試劑購(gòu)自日本TaKaRa公司，LncRNA HULC：正向引物5’-ATCTGCAAGCCAGGAAGAGTC-3’，反向引物5’-CTTGCTTGATGCTTTGGTCTGT-3’；GAPDH：正向引物5’-TGTGTTGGCGTACAGGTCTTTG-3’，反向引物5’-GGGAAATCGTGCGTGACATT AAG-3’。

取胃癌患者靜脈血5 ml，移入離心管，常溫靜置60 min，2 h內(nèi)于4 ℃，2 000 r/min離心，吸取上層血清后，加入到無(wú)RNA酶的1.5 ml微量離心管中，置于-80 ℃冰箱。同時(shí)獲取患者臨床及隨訪資料用于分析。

用本實(shí)驗(yàn)已獲得的RNA，反轉(zhuǎn)錄生成cDNA。按試劑盒說(shuō)明步驟進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。反應(yīng)條件37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，反應(yīng)產(chǎn)物保存于4 ℃冰箱。參照定量PCR反應(yīng)試劑盒說(shuō)明書(shū)對(duì)LncRNA HULC進(jìn)行檢測(cè)，實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸15 s，共40個(gè)循環(huán)。以GAPDH作為內(nèi)參照，每組樣本重復(fù)3次取均值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。分別采用Mann-Whitney檢驗(yàn)和t檢驗(yàn)分析比較LncRNA HULC在胃癌組和對(duì)照組血清中的表達(dá)，及LncRNA HULC在胃癌患者血清中的表達(dá)與臨床病理特征之間的關(guān)系，用受試者工作特征曲線(ROC)計(jì)算并評(píng)估血清LncRNA HULC在胃癌診斷中的敏感度和特異度。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胃癌組與對(duì)照組一般情況比較 胃癌組男62例，女28例，年齡<60歲患者47例，≥60歲43例；對(duì)照組男60例，女30例，年齡<60歲45例，≥60歲45例，兩組一般情況對(duì)比性別(χ2=0.102，P=0.750)、年齡(χ2=0.089，P=0.766)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具有一定可比性。

2.2 胃癌組與對(duì)照組血清LncRNA HULC表達(dá)比較 胃癌組血清LncRNA HULC表達(dá)水平與對(duì)照組相比較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，圖1)。

圖1 血清LncRNA HULC在對(duì)照組與胃癌組中的表達(dá)

2.3 胃癌患者血清LncRNA HULC表達(dá)與臨床病理之間的關(guān)系 在TNM Ⅲ、Ⅳ期以及惡性腫瘤已經(jīng)有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者中，LncRNA HULC的表達(dá)水平較高，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05 )。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，LncRNA HULC和胃癌患者性別、腫瘤直徑大小、年齡高低、組織分化程度、有無(wú)淋巴轉(zhuǎn)移及血清CEA表達(dá)不相關(guān)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，表1)。

表1 胃癌臨床病理與HULC表達(dá)水平之間的關(guān)系

2.4 血清LncRNA HULC診斷胃癌的可靠性 ROC曲線分析顯示：血清LncRNA HULC診斷胃癌曲線下面積(AUC )為0.81。診斷胃癌的LncRNA HULC最優(yōu)截?cái)嘀禐?.795，結(jié)果顯示其靈敏度和特異度各為81.11%，75.56% (圖2)。

圖2 LncRNA HULC診斷胃癌的ROC曲線

3 討論

胃癌由多因素引起，包括患者體內(nèi)癌基因激活、基因突變、DNA修復(fù)基因丟失等。在發(fā)展中國(guó)家，進(jìn)展期胃癌的預(yù)后欠佳。因此，尋找能夠影響和發(fā)現(xiàn)早期胃癌的良好新標(biāo)志物需加快步伐。近來(lái)，研究提示LncRNA有可能作為理想的協(xié)助診斷及預(yù)后評(píng)估的生物標(biāo)志物。HULC是位于染色體6p24.3上長(zhǎng)鏈非編碼RNA，在靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物中高度保守[29]。HULC的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物長(zhǎng)500個(gè)核苷酸，是拼接和聚腺苷酸化的非編碼RNA，其定位于細(xì)胞質(zhì)[30]。有研究表明，HULC在胃癌組織中顯著上調(diào)，敲除可增加化療藥物誘導(dǎo)的凋亡[31]。

本研究顯示，胃癌組LncRNA HULC表達(dá)量比對(duì)照組高，通過(guò)對(duì)比我們發(fā)現(xiàn)在TNM分期Ⅲ、Ⅳ期以及有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的胃癌患者中血LncRNA HULC表達(dá)較高，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05 )。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，LncRNA HULC與胃癌患者性別、腫瘤直徑大小、年齡高低、組織分化程度、有無(wú)淋巴轉(zhuǎn)移及CEA表達(dá)不相關(guān)(P>0.05)。ROC曲線分析顯示，LncRNA HULC在胃癌診斷中的最優(yōu)截?cái)嘀禐?.795，其靈敏度和特異度分別是81.11%，75.56%，AUC為0.81，說(shuō)明LncRNA HULC在血清中的表達(dá)水平對(duì)胃癌診斷具有較好的敏感性和特異性。

本實(shí)驗(yàn)中觀察到LncRNA HULC在胃癌血清中高表達(dá)，且取材方便，使得LncRNA HULC的血液檢測(cè)成為可能，但實(shí)際應(yīng)用于臨床尚存在很多問(wèn)題，如血清LncRNA HULC的檢測(cè)是否能成為胃癌診斷的有效指標(biāo)，需建立一個(gè)系統(tǒng)化、標(biāo)準(zhǔn)化檢測(cè)體系，以及與其他腫瘤標(biāo)志物能否協(xié)同作用以提高胃癌診斷率，這些有待進(jìn)一步研究。

總之，對(duì)腫瘤相關(guān)LncRNAs研究仍處于初始階段，隨著研究的繼續(xù)深入，血中LncRNA HULC檢測(cè)有望成為胃癌診斷以及評(píng)估預(yù)后的重要指標(biāo)之一。

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