陳兵兵，賈洪響，畢星宇，武學(xué)清

(山西省兒童醫(yī)院婦幼保健院生殖醫(yī)學(xué)中心，太原 030013)

輔助生殖技術(shù)(ART)中約有30%的卵母細胞發(fā)生受精失敗[1]。卵母細胞的激活是受精的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，卵母細胞的激活方法及激活機制的研究日益受到人們的關(guān)注。盡管應(yīng)用ICSI可以取得較高的受精率和卵裂率，但是ICSI受精低下或失敗在臨床中仍反復(fù)發(fā)生，給患者帶來了巨大的經(jīng)濟負擔和身心傷害。而卵母細胞輔助激活技術(shù)聯(lián)合ICSI應(yīng)用于反復(fù)ICSI受精低下或失敗的患者，已經(jīng)有獲得臨床妊娠及健康新生兒的報道[2-3]。本研究回顧性分析了山西省婦幼保健院生殖醫(yī)學(xué)中心12例既往ICSI受精低下或失敗的患者的臨床資料，評估卵母細胞激活技術(shù)的臨床應(yīng)用效果。

資料與方法

一、研究對象

選擇2014年10月至2016年10月在山西省婦幼保健院生殖醫(yī)學(xué)中心行ICSI助孕，至少有1次ICSI受精失敗或受精低下(受精率<30%)，再次行ICSI助孕時采用了卵母細胞激活處理的患者。排除因卵母細胞質(zhì)量差或獲得成熟的卵母細胞<3枚而導(dǎo)致的ICSI受精失敗或低下患者。

獲得的105枚成熟卵母細胞均行ICSI后鈣離子載體A23187聯(lián)合6-甲基氨基嘌呤(6-DMAP)激活。本研究經(jīng)本院倫理學(xué)委員會批準，納入本研究的患者均簽署知情同意書。

二、助孕診療回顧

1.卵母細胞收集：采用長方案或短方案行控制性促排卵，當主導(dǎo)卵泡直徑達18 mm時，肌注HCG(珠海麗珠醫(yī)藥)5 000～10 000 U，36 h后在陰道B超引導(dǎo)下穿刺取卵。在體外培養(yǎng)3～4 h后，將卵母細胞置于透明質(zhì)酸酶溶液中，進行去卵丘處理，將成熟的卵母細胞移入含Hepes的胚胎培養(yǎng)液中等待ICSI。

2.卵母細胞激活：在ICSI 30 min后將卵母細胞置于含5 μmol/L的Ca2+載體A23187(Sigma，美國)的人類輸卵管液(G-IVF，Vitrolife，瑞典)中避光處理5 min，經(jīng)卵裂培養(yǎng)液(G1，Vitrolife，瑞典)洗滌5～6次，然后在含2 mmol/L 6-DMAP(Sigma，美國)的卵裂培養(yǎng)液中處理3 h，經(jīng)卵裂培養(yǎng)液洗滌5～6次，移入卵裂培養(yǎng)液滴中培養(yǎng)。

激活結(jié)果判定：卵母細胞激活處理后18～20 h，倒置顯微鏡下觀察，將出現(xiàn)原核(PN)或發(fā)生卵裂的卵母細胞判定為激活，包括：單原核(1PN)、雙原核(2PN)、多PN(≥3PN)、卵裂。

3.激活后胚胎培養(yǎng)：將激活的胚胎分別置于培養(yǎng)液G1和G2(Vitrolife，瑞典)中，進行序貫培養(yǎng)，每24 h觀察胚胎的發(fā)育情況。

4.卵裂期胚胎評級：卵裂期胚胎評級綜合卵裂球數(shù)目、卵裂球大小是否均勻、細胞碎片多少、胞漿是否均質(zhì)、有無空泡現(xiàn)象、有無胞質(zhì)收縮等，分為4級[4]。I級：卵裂球大小均勻，形狀規(guī)則，透明帶完整；胞質(zhì)均勻清晰，沒有顆?，F(xiàn)象；碎片含量在0～5%；Ⅱ級：卵裂球大小稍不均勻，形狀稍不規(guī)則；胞質(zhì)有顆?，F(xiàn)象；碎片在6%～20%；Ⅲ級：卵裂球大小明顯不均勻，形狀明顯不規(guī)則；胞質(zhì)有粗大的顆粒；碎片在21%～50%；Ⅳ級：卵裂球大小嚴重不均勻；胞質(zhì)有嚴重顆粒現(xiàn)象；碎片在>50%以上。

第3天卵裂期胚胎評級為I級、Ⅱ級、Ⅲ級的胚胎為可利用胚胎；第4天卵裂期胚胎評級為I級、Ⅱ級的胚胎為優(yōu)質(zhì)胚胎。

三、主要觀察指標

受精率、卵裂率、可利用胚胎數(shù)和優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)。

四、統(tǒng)計學(xué)方法

結(jié) 果

一、卵母細胞激活情況

既往ICSI受精低下或失敗患者本次激活周期中共獲得成熟卵母細胞105個，全部用鈣離子載體A23187聯(lián)合6-DMAP激活，激活率為63.81%(67/105)(表1)。

二、既往ICSI受精低下或失敗周期與本次激活周期受精率、卵裂率和優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)比較

本次激活周期中優(yōu)質(zhì)胚胎及可利用胚胎數(shù)量較既往周期顯著增加(P<0.05)，卵裂率和受精率也顯著高于既往周期(P<0.05)(表2)。

既往ICSI受精低下或失敗的12例患者中，本次激活周期中有5例(41.67%)獲得臨床妊娠。

表1 既往ICSI受精低下或失敗患者的本次卵母細胞激活情況

表2 既往周期與本次激活周期的受精率、胚胎發(fā)育情況比較[(-±s)，%]

注：與既往周期比較，*P<0.05

討 論

卵母細胞輔助激活主要是通過外界刺激使外源性Ca2+內(nèi)流或內(nèi)源性Ca2+釋放，提高卵母細胞內(nèi)Ca2+濃度，引發(fā)后續(xù)的一系列反應(yīng)，使卵母細胞啟動受精過程并脫離MⅡ期。在正常受精過程中是由精子釋放磷脂酶Cζ(PLCζ)來啟動該過程[5]，但在卵母細胞受精失敗的患者中，精子對卵母細胞的激活能力弱于常人[6]，因此需要通過人為施加干預(yù)來激活卵母細胞，完成受精過程。卵母細胞輔助激活技術(shù)最早應(yīng)用于體細胞核移植和卵母細胞孤雌激活[7-8]，包括物理方法和化學(xué)方法，其中物理方法主要是電激活[9]，化學(xué)方法主要有鈣離子載體[10]、6-DMAP[11]和氯化鍶(SrCl2)[12-13]等，其中有些方法如SrCl2在動物上的應(yīng)用較為廣泛，而在人卵母細胞的輔助激活中僅有個例報道。

本研究采用鈣離子載體A23187聯(lián)合6-DMAP進行卵母細胞激活，用于治療既往ICSI受精低下或失敗的患者，激活周期與既往周期相比，激活周期組的卵母細胞在受精率、卵裂率、可利用胚胎數(shù)及優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)方面均顯著高于既往周期組(P<0.05)，這與已有文獻報道[14]相符，提示既往ICSI受精低下或失敗的患者確實存在精子激活能力弱的問題，另一方面也證實鈣離子載體A23187聯(lián)合6-DMAP可以有效激活I(lǐng)CSI后的卵母細胞，而且能夠在一定程度上改善卵母細胞的后續(xù)發(fā)育能力，增加可利用胚胎數(shù)和優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)，這也與Sfontouris等[15]的研究結(jié)果一致。

另外，對激活周期中卵母細胞的受精情況進行分析，發(fā)現(xiàn)已受精的卵母細胞中異常受精所占的比例很高，特別是1PN的比例高達29.85%，這與劉英等[16]的研究結(jié)果一致，這種情況的出現(xiàn)可能是精子染色體解聚異常導(dǎo)致雄性原核不能形成，造成孤雌激活的發(fā)生，也有可能是異常的鈣離子濃度升高不能正常引發(fā)卵母細胞的激活所致。

總體來看，鈣離子載體A23187聯(lián)合6-DMAP激活雖然會導(dǎo)致異常受精的增多，但是可利用胚胎數(shù)和優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)也得到明顯提高，這就大大增加了患者移植成功的希望。本研究納入的12例患者既往周期均未成功，而激活周期中有5例最終獲得臨床妊娠，改善了妊娠結(jié)局。在目前尚未有更理想的治療方法出現(xiàn)之前，卵母細胞輔助激活仍將是治療既往ICSI受精低下或失敗患者的有效措施之一。

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