高飛，尹紀(jì)來，李浩，王大平

(海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，?？?70102)

慢加急性肝衰竭(Acute-on-chronic liver failure，ACLF)是一種急性肝臟損傷，臨床上主要表現(xiàn)為凝血機(jī)制障礙、高膽紅素血癥以及多臟器功能衰竭等。我國(guó)90%的ACLF由HBV引發(fā)，稱為HBV相關(guān)慢加急性肝衰竭(HBV-ACLF)。HBV-ACLF患者發(fā)病90天內(nèi)病死率高達(dá)43.1%，比其他慢性肝病高15倍，準(zhǔn)確評(píng)估患者的預(yù)后有利于降低病死率[1～4]。終末期肝病模型(Model for end-stage liver disease，MELD)可對(duì)終末期肝病短期、中期病死率進(jìn)行有效的預(yù)測(cè)，其評(píng)分越高，HBV-ACLF患者病情越重、預(yù)后越差。微小RNA(miRNA)是調(diào)節(jié)基因表達(dá)的重要因子[5]。研究[6～8]表明，miRNA-130a在機(jī)體抗感染過程中，具有抗病毒、抗細(xì)菌和加強(qiáng)細(xì)胞吞噬的作用。由于血清miRNA-130a檢測(cè)具有靈敏、準(zhǔn)確、快速、簡(jiǎn)便、重復(fù)性好等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于多種疾病的診斷、判斷療效及預(yù)后[9]。本研究觀察了HBV-ACLF患者血清miRNA-130a水平變化及其與病情嚴(yán)重程度和預(yù)后的關(guān)系?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2011年7月～2014年9月海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院收治的HBV-ACLF患者110例為病例組，男55例、女55例，年齡(45.30±9.70)歲，其中早期35例(早期組)、中期60例(中期組)、晚期15例(晚期組)，生存81例(生存組)、死亡29例(死亡組,截至2018年1月1日)。病例組MELD評(píng)分為(27.09±8.65)分。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合亞太肝臟研究學(xué)會(huì)制定的HBV-ACLF診斷標(biāo)準(zhǔn)(2009年第3版)[10]。排除標(biāo)準(zhǔn)：患者有非酒精性脂肪肝、原發(fā)性硬化性膽管炎、自身免疫性肝炎、酒精性肝病、Wilson病或惡性腫瘤等疾病。選擇同期健康體檢者54例為對(duì)照組，其中男29例、女25例，年齡(45.5±9.80)歲。病例組、對(duì)照組性別、年齡具有可比性(P均>0.05)。所有受檢者清晨空腹抽取肘靜脈血10 mL，室溫靜置30 min，3 000 r/min離心10 min，分離血清備檢。

1.2 血清miRNA-130a檢測(cè) 采用mirVana miRNA分離試劑盒(Ambion公司)提取病例組及對(duì)照組血清總RNA，Nanodrop 2000分光光度計(jì)(Thermo Scientific公司)測(cè)量RNA的純度,參照GenBank數(shù)據(jù)獲取待測(cè)基因序列，采用Primer 5.0軟件，根據(jù)實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)引物。miR-130a正向引物為5′-AGTCTATACAAGGGCAAGCTCTC-3′，反向引物為5′-CCCAATACGACCAAATCCGTT-3′;內(nèi)參基因β-actin正向引物為5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，反向引物為5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。PCR反應(yīng)體系：正向引物0.4μL、反向引物0.4μL、RNA模版0.6 μL、超級(jí)酶混合物0.2 μL、RT-qPCR緩沖液5 μL、去RNA水3.4 μL。93 ℃預(yù)變性5 min，40個(gè)循環(huán)(93 ℃ 40 s、58 ℃ 30 s、72 ℃ 60 s)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。用2-ΔΔCt表示血清miR-130a的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 血清miRNA-130a的表達(dá)量與HBV-ACLF患者預(yù)后關(guān)系分析 對(duì)所有HBV-ACLF患者進(jìn)行隨訪，隨訪截止日期為 2018年1月1日或患者死亡，隨訪內(nèi)容為治療效果、恢復(fù)情況、病情變化、不良預(yù)后結(jié)局(肝硬化、腹水、肝腎綜合癥、上消化道出血、糖尿病、肝性腦病、電解質(zhì)紊亂、死亡)發(fā)生情況等。以HBV-ACLF患者血清miRNA-130a相對(duì)表達(dá)量中位數(shù)為界，將110例HBV-ACLF患者分為miRNA-130a高表達(dá)組和低表達(dá)組，分析血清miRNA-130a的表達(dá)量與HBV-ACLF患者預(yù)后的關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 各組血清miRNA-130a相對(duì)表達(dá)量比較 病例組、對(duì)照組血清miRNA-130a相對(duì)表達(dá)量分別為9.54±4.76、1.65±0.56，兩者相比，P<0.05。HBV-ACLF早期組、中期組、晚期組血清miRNA-130a相對(duì)表達(dá)量分別為13.01±1.62、9.12±2.04、7.99±2.88，兩兩相比，P均<0.05。HBV-ACLF死亡組、生存組血清miRNA-130a相對(duì)表達(dá)量分別為7.87±2.76、10.43±4.20，兩者相比，P<0.05。

2.2 病例組患者血清miRNA-130a表達(dá)量與MELD評(píng)分的相關(guān)性 病例組患者血清miRNA-130a表達(dá)量與MELD評(píng)分呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.654，P<0.01)。

2.3 病例組血清miRNA-130a表達(dá)量與HBV-ACLF患者預(yù)后的關(guān)系 病例組患者中miRNA-130a低表達(dá)組68例、高表達(dá)組42例。出現(xiàn)肝硬化、腹水、肝腎綜合征、上消化道出血、糖尿病、肝性腦病、電解質(zhì)紊亂和死亡者miRNA-130a低表達(dá)組分別為24、22、17、19、21、16、32、21例，高表達(dá)組分別為3、5、4、3、5、3、3、8例，兩組相比，P均<0.01。

3 討論

動(dòng)物及細(xì)胞學(xué)試驗(yàn)[11]證明，miR-130a參與了由多種病因引起的肝損傷或肝衰竭的發(fā)病過程。miR-130a可能是大鼠肝臟熱缺血和再灌注損傷的潛在生物學(xué)標(biāo)志物，在肝臟再灌注損傷后，升高的miR-130a與丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶和乳酸脫氫酶呈正相關(guān)[12]。在對(duì)乙酰氨基酚誘導(dǎo)豬急性肝衰竭的試驗(yàn)[13]中，miR-130a表達(dá)水平上升顯著，且與肌酐升高呈正相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，病例組miRNA-130a表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組，這與上述結(jié)果一致。

研究[14]表明，miRNA-130a可調(diào)控淋巴細(xì)胞的定向轉(zhuǎn)移和趨化性，并可激活淋巴細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、上皮細(xì)胞的趨化因子受體。在大鼠肝衰竭試驗(yàn)[15]中，miRNA-130a抑制淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞凋亡，并誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞從脾臟向肝臟的轉(zhuǎn)移，參與炎癥反應(yīng)。miRNA-130a還參與調(diào)節(jié)中性粒細(xì)胞的有絲分裂，降低有絲分裂停滯蛋白的表達(dá)，并可加強(qiáng)抗炎藥物定向攻擊病變細(xì)胞；miRNA-130a還能促進(jìn)淋巴細(xì)胞與肝臟病變組織黏附結(jié)合，建立反應(yīng)灶。這些研究結(jié)果提示，在肝衰竭的發(fā)病過程中，miRNA-130a高表達(dá)提示機(jī)體的免疫反應(yīng)增強(qiáng)，可能會(huì)為肝衰竭患者帶來良好的預(yù)后。結(jié)合本研究結(jié)果，HBV-ACLF中期組、晚期組miRNA-130a相對(duì)表達(dá)量低于早期組，晚期組miRNA-130a相對(duì)表達(dá)量低于中期組，HBV-ACLF死亡組miRNA-130a相對(duì)表達(dá)量低于生存組，顯示隨著HBV-ACLF患者病情嚴(yán)重程度的增加，miRNA-130a相對(duì)表達(dá)量逐漸降低。

研究[16～18]表明，miRNA-130a提高肝衰竭患者預(yù)后與一系列調(diào)控機(jī)制有關(guān)：miRNA-130a能通過堿基互補(bǔ)配對(duì)與目標(biāo)RNA的編碼區(qū)特異性結(jié)合，促進(jìn)RNA的翻譯，促進(jìn)淋巴細(xì)胞錨定融合血管內(nèi)壁，促進(jìn)免疫細(xì)胞束縛病變靶細(xì)胞，而一些細(xì)胞免疫活性因子如MCP-1、TNF-a、IL-1、IL-8等與miRNA-130a表達(dá)正相關(guān)。相關(guān)性分析結(jié)果顯示，miRNA-130a與MELD呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，這提示miRNA-130a表達(dá)量與HBV-ACLF患者病情嚴(yán)重程度和預(yù)后負(fù)相關(guān)。為驗(yàn)證上述結(jié)論，我們以HBV-ACLF患者血清miRNA-130a相對(duì)表達(dá)量中位數(shù)為界，將HBV-ACLF患者分為miRNA-130a高表達(dá)組和低表達(dá)組，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miRNA-130a低表達(dá)組HBV-ACLF患者肝硬化、腹水、肝腎綜合癥、上消化道出血、糖尿病、肝性腦病、電解質(zhì)紊亂、死亡發(fā)生率高于miRNA-130a高表達(dá)組HBV-ACLF患者，這證實(shí)了上述結(jié)論，同時(shí)也說明高表達(dá)的miRNA-130a能提高HBV-ACLF患者預(yù)后。

綜上所述，HBV-ACLF患者miRNA-130a相對(duì)表達(dá)量顯著升高，且隨著HBV-ACLF患者病情嚴(yán)重程度的增加，miRNA-130a表達(dá)量逐漸降低。高表達(dá)的miRNA-130a能提高HBV-ACLF患者預(yù)后。