楊舒慧 ，周光明 ，王小強 ，張麟 ，李芬 ，吳永建

（1.四川省畜牧總站，四川 成都 610041；2.成都市西嶺雪農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司，四川 大邑 611338；3.成都匯豐動物育種有限公司，四川 成都 610066；4.四川省大邑縣安仁都市現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)園管委會，四川 大邑 611331）

成都麻羊，亦稱四川銅羊，是一種肉皮兼用型優(yōu)良地方品種，2014年入選《國家級畜禽遺傳資源保護名錄》。近年來，成都麻羊能繁母羊的存欄量逐漸下降，故亟需對成都麻羊遺傳資源進行保護。而開展冷凍精液的研制工作，將使成都麻羊的遺傳物質(zhì)得到長期而低成本的保存。本文按照國家標(biāo)準“GB 20557-2006山羊冷凍精液”規(guī)定程序，對成都麻羊冷凍精液的制作程序進行了實際探索。

1 精液來源

1.1 種公羊選擇 在成都市西嶺雪開發(fā)有限公司挑選體型外貌和生產(chǎn)性能符合品種要求的特級、一級種公羊12只。對每只公羊進行檢疫，確認無傳染病，體質(zhì)健壯。

1.2 種公羊飼養(yǎng) 為了提高采精量、精子活力，保證精子質(zhì)量，應(yīng)提前30d加強種公羊的飼養(yǎng)管理。要求飼料營養(yǎng)價值高，容易消化，適口性好。

1.3 種公羊管理 種公羊需保持中上等膘情，健壯、活潑、精力充沛、性欲旺盛，過肥過瘦都不利采精。公羊必須單獨組群、飼喂，每日應(yīng)有足夠的運動，運動時間以4～6h為宜。

2 采精準備

2.1 實驗室衛(wèi)生要求 保持實驗室清潔衛(wèi)生、無灰塵，無直射陽光，無蚊蠅，無刺激性氣味，室溫維持在25℃左右。進入實驗室的工作人員需換上干凈的工作服、鞋、帽，并佩戴一次性無菌手套。

2.2 實驗器材 采精：臺羊保定架、羊用假陰道、集精管、凡士林（或石蠟油等）、水浴鍋、溫度計、燒杯。

檢驗：恒溫載物臺、顯微鏡、蓋玻片、載玻片、擦鏡紙、微量移液槍、衛(wèi)生紙等。

稀釋：稀釋液原料（果糖、檸檬酸鈉、甘油、雞蛋、青霉素、鏈霉素），電子天平、三角燒杯、量筒、注射器、磁力攪拌器、濾紙、稱量紙等。

冷凍：泡沫箱、液氮、超低溫冷凍儀、細管、封口粉、脫脂棉、鑷子、細管支架、紗布袋等。

2.3 器械消毒 錐形瓶、燒杯、集精管等采用高溫干燥箱消毒；量筒、溫度計等洗凈晾干后，用紫外線照射30min消毒。

3 采精操作

參照《山羊人工授精技術(shù)操作規(guī)程》中的采精方法，采用手握法采精，取濃稠部分，顯微鏡下檢查精子活力。鮮精活力要求不低于0.65，精子畸形率不能超過15%。檢查活力時應(yīng)先于37℃預(yù)熱載玻片和蓋玻片。

4 精液稀釋

4.1 冷凍稀釋液配制 基礎(chǔ)液：檸檬酸鈉2g、果糖4.8g、雙蒸水85mL。要求藥品純凈、稱量標(biāo)準、瓶裝密封，消毒后保存。

I液：基礎(chǔ)液85 mL，卵黃15 mL。稀釋液每100mL中加入青霉素、鏈霉素各10萬單位。

Ⅱ液：I液中加入8%的甘油（抗凍劑）即得，用作精液第二次稀釋。

基礎(chǔ)液可多次使用，稀釋液需現(xiàn)配現(xiàn)用。

4.2 精液稀釋方法

4.2.1 鮮精鏡檢合格后盡快在5min內(nèi)用I液作第一次稀釋，要把稀釋液加溫到28～32℃，和精液溫度保持一致，稀釋比例應(yīng)根據(jù)精液的品質(zhì)作1～3倍稀釋。

4.2.2 稀釋后的精液經(jīng)20～30 min緩慢降溫，至2℃左右平衡2～3h，再加入等溫Ⅱ液，加入量為第一次稀釋比例的一半。第二次稀釋前應(yīng)對精液進行鏡檢，活力過低者廢棄，如活力下降需根據(jù)情況降低稀釋倍數(shù)。

5 精液平衡

將稀釋后的精液放在4℃陳列柜中平衡，等溫度降到4℃以下再分裝。

6 分裝

分裝前將精液上下輕輕顛倒幾次，以保證精液密度、活力均勻。分裝時使用0.25mL細管，通過人工吸取或使用注射器將稀釋后的精液注入細管，并用聚乙烯醇粉快速密封管口，然后將細管均勻置于冷凍支架上。精液裝管時需保證細管內(nèi)有1.5cm的空氣，以防冷凍后爆管。

7 精液冷凍

將液氮倒入有蓋的平底器皿中（本實驗使用泡沫盒），再放入冷凍支架，距離液氮面3 cm，并保證支架的水平溫度在-155～-165℃之間，熏蒸8～10min，冷凍后裝入液氮罐。

8 總結(jié)

本次成都麻羊凍精制作總耗時5個月，制作周期為每周兩次。采集12只種公羊的精液，共包含八個血緣。公羊采精量平均為0.91mL，鮮精活力平均值為0.63，總共制作了3104支細管凍精。每支細管凍精精液量均在0.2mL以上，解凍活力均在0.3以上，前進運動精子數(shù)均在3000萬以上，符合國家標(biāo)準，效果良好。

通過本次凍精制作，我們發(fā)現(xiàn)凍精質(zhì)量與操作過程中的各個環(huán)節(jié)緊密相連，對溫度和時間的掌控尤為重要。在精液檢測環(huán)節(jié)，一定要注意加強對恒溫載物臺的使用，使用的載玻片、蓋玻片等需要提前放置在恒溫載物臺上預(yù)熱。平衡環(huán)節(jié)一定要緩慢降溫，切忌降溫過快對精液造成冷打擊，影響精液質(zhì)量。