任明亮，李輝，劉冬斌，陳國(guó)雄，譚鎮(zhèn)南，劉鵠(南方醫(yī)科大學(xué)附屬南海醫(yī)院，廣東佛山528200)

骨肉瘤是起源于間葉組織的常見原發(fā)骨組織惡性腫瘤，大約占骨組織原發(fā)腫瘤的20%，好發(fā)于青少年，惡性程度高，易早期發(fā)生肺轉(zhuǎn)移[1，2]。由于骨肉瘤的高侵襲性和轉(zhuǎn)移性，患者預(yù)后較差。因此探索骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，尋找骨肉瘤基因治療的有效靶點(diǎn)意義重大。叉頭框(FOX)蛋白O是FOX蛋白家族中的一個(gè)重要的亞家族，包括FOXO1、FOXO3a、FOXO4和FOXO6，在人體各種正常組織細(xì)胞中廣泛表達(dá)，參與細(xì)胞分化、增殖、代謝、凋亡、信號(hào)傳導(dǎo)、免疫等重要功能[3]。FOXO1基因定位于13號(hào)染色體13q13～14.1。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXO1在前列腺癌[4]、胃癌[5]、乳腺癌[6]、肝癌[7]等多種惡性腫瘤組織中表達(dá)下調(diào)，作為一種腫瘤抑制因子參與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展。但目前有關(guān)FOXO1在骨肉瘤細(xì)胞中的表達(dá)變化及作用機(jī)制的研究較少。2017年6月～2017年9月，本研究探討FOXO1表達(dá)上調(diào)對(duì)骨肉瘤細(xì)胞增殖及凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及試劑 人骨肉瘤細(xì)胞系MG-63及人成骨細(xì)胞系hFOB1.19均購(gòu)自美國(guó)ATCC公司。TRIzol Reagent和LipofectamineTM2000均購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及qRT-PCR試劑盒購(gòu)自日本Takara公司；FOXO1和GAPDH引物、包含F(xiàn)OXO1編碼區(qū)的pcDNA3.1-FOXO1重組質(zhì)粒和空載質(zhì)粒由上海生工生物公司設(shè)計(jì)合成；一抗FOXO1和GAPDH抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司，二抗購(gòu)自武漢博士德生物公司；CCK-8試劑盒購(gòu)自江蘇碧云天生物技術(shù)研究所；Anexin-FITC/PI凋亡試劑盒購(gòu)自南京凱基生物公司。

1.2 FOXO1基因轉(zhuǎn)染 人骨肉瘤細(xì)胞系MG-63、人成骨細(xì)胞系hFOB1.19均用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，置于5% CO2、37℃飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MG-63細(xì)胞，并隨機(jī)分為FOXO1重組質(zhì)粒組與NC組，采用LipofectamineTM2000按照說(shuō)明書操作分別轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-FOXO1重組質(zhì)粒和空載質(zhì)粒。

1.3 MG-63細(xì)胞中FOXO1 mRNA表達(dá)檢測(cè) 采用qRT-PCR法。轉(zhuǎn)染后24 h，用TRIzol試劑提取兩組細(xì)胞總RNA。取總RNA，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書操作逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，低溫保存?zhèn)溆谩Ｒ詂DNA為模板，參照qRT-PCR試劑盒說(shuō)明書，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀進(jìn)行定量PCR檢測(cè)。FOXO1 正向引物： 5′-AACCTGGCATTACAGTTGGCC-3′、反向引物：5′-AAATGCAGGAGGCATGACTACGT-3′，GAPDH 正向引物：5′-GGTGATGCTGGTGCTGAGTA-3′、反向引物：5′-ACTGTGGTCATGAGCCCTTC-3′。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火34 s，共40個(gè)循環(huán)。用2-ΔΔCt法計(jì)算FOXO1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.4 MG-63細(xì)胞中FOXO1蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用Western blotting法。轉(zhuǎn)染后24 h收集兩組細(xì)胞，蛋白裂解液提取細(xì)胞總蛋白，Bradford法行蛋白定量。各組取蛋白樣品上樣30 μg，行SDS-PAGE電泳分離，電轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF膜，5%脫脂奶粉的封閉液室溫封閉1 h，加入FOXO1(1∶500)一抗和GAPDH一抗(1∶1 000)，4 ℃過(guò)夜，洗膜后再加入二抗,室溫孵育1 h，ECL顯影液顯影后凝膠成像儀曝光拍照，灰度掃描儀分析條帶灰度值。FOXO1蛋白的相對(duì)表達(dá)量=FOXO1蛋白條帶灰度值/GAPDH蛋白條帶灰度值。

1.5 MG-63細(xì)胞增殖能力檢測(cè) 采用CCK-8法。轉(zhuǎn)染后24 h取各組細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞板，隔24 h向每孔加入CCK-8液10 μL，每孔設(shè)置4個(gè)復(fù)孔，并設(shè)置空白對(duì)照，于37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育2 h，終止孵育后用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定各孔450 nm 波長(zhǎng)處吸光度值。用吸光度值表示細(xì)胞的增殖能力。

1.6 MG-63細(xì)胞凋亡率測(cè)算 采用流式細(xì)胞術(shù)。轉(zhuǎn)染后48 h取各組細(xì)胞，制備1×106/mL的細(xì)胞懸液。每組取細(xì)胞懸液5 mL置于流式管中，依次加入Annexin V-FITC 5 μL、PI 10 μL，混勻后室溫下避光染色15 min，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算細(xì)胞凋亡率。

2 結(jié)果

2.1 人骨肉瘤細(xì)胞中FOXO1 mRNA的表達(dá) 人骨肉瘤細(xì)胞MG-63和人成骨細(xì)胞hFOB1.19中FOXO1 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為0.21±0.10、1.02±0.04。FOXO1 mRNA在人骨肉瘤細(xì)胞MG-63中的相對(duì)表達(dá)量低于人成骨細(xì)胞hFOB1.19(P<0.05)。

2.2 轉(zhuǎn)染后MG-63細(xì)胞內(nèi)FOXO1 mRNA、蛋白表達(dá)變化 轉(zhuǎn)染后24 h，F(xiàn)OXO1重組質(zhì)粒組與NC組FOXO1 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為10.50±0.48、1.04±0.06，二者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；FOXO1重組質(zhì)粒組與NC組FOXO1蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為1.98±0.22、0.19±0.09，二者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.3 FOXO1過(guò)表達(dá)對(duì)MG-63細(xì)胞增殖能力的影響 轉(zhuǎn)染后48、72、96 h，F(xiàn)OXO1重組質(zhì)粒組吸光度值分別為0.52±0.06、1.08±0.14、1.36±0.13，NC組分別為1.06±0.14、1.99±0.22、2.72±0.20，兩組不同時(shí)間點(diǎn)吸光度值比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。

2.4 FOXO1過(guò)表達(dá)對(duì)MG-63細(xì)胞凋亡率的影響 FOXO1重組質(zhì)粒組、NC組細(xì)胞凋亡率分別為17.34%±1.04%、5.48%±0.38%，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義﹙P<0.05﹚。

3 討論

FOXO1亦稱FKH1或FKHR，是FOXO家族的重要成員之一，其轉(zhuǎn)錄活性受泛素化、磷酸化、乙?；韧緩秸{(diào)節(jié)，是PI3K、MAPK、IKK等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的關(guān)鍵信號(hào)分子[8]，在人體各種正常組織細(xì)胞中廣泛表達(dá)，在機(jī)體細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡和分化、抗氧化應(yīng)激等多種重要的細(xì)胞功能調(diào)控中發(fā)揮重要的作用[9]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXO1表達(dá)降低與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。FOXO1在多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著抑癌基因的生物學(xué)功能[10]。陳寶英等[11]研究證實(shí)，F(xiàn)OXO1在乳腺癌組織中表達(dá)降低，F(xiàn)OXO1的表達(dá)變化與腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤大小密切相關(guān)。Wang等[12]在研究中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXO1在肝細(xì)胞癌組織中表達(dá)降低，通過(guò)影響核糖體、剪接體、類固醇的合成影響蛋白的合成，在肝細(xì)胞癌變和肝癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。但目前有關(guān)FOXO1在骨肉瘤組織中的表達(dá)變化研究甚少，且作用機(jī)制尚未明確。本研究結(jié)果顯示，F(xiàn)OXO1 mRNA在骨肉瘤細(xì)胞MG-63中的表達(dá)也較成骨細(xì)胞hFOB1.19降低，提示FOXO1低表達(dá)在骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮重要的作用。

細(xì)胞無(wú)限增殖和凋亡受阻導(dǎo)致的增殖/凋亡平衡失衡是惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制[13]。近年來(lái)多項(xiàng)研究已證明FOXO1能夠抑制多種惡性腫瘤細(xì)胞的增殖，促進(jìn)其凋亡，從而發(fā)揮著抑癌基因的作用。Li等[14]報(bào)道人肝癌細(xì)胞中水通道蛋白9能夠抑制PI3K/Akt通路，上調(diào)細(xì)胞中FOXO1的表達(dá)，從而抑制癌細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡。Zhao等[15]發(fā)現(xiàn)，姜黃素通過(guò)抑制PI3K/Akt通路激活FOXO1，誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞凋亡。Yang等[16]在研究中發(fā)現(xiàn)FOXO1在肝細(xì)胞癌細(xì)胞中表達(dá)降低，miR-1269在肝細(xì)胞癌中表達(dá)增高，miR-1269通過(guò)抑制FOXO1的表達(dá)促進(jìn)癌細(xì)胞增殖。本研究將重組質(zhì)粒pcDNA3.1-FOXO1轉(zhuǎn)染至骨肉瘤MG-63細(xì)胞，上調(diào)細(xì)胞中FOXO1的表達(dá)，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染后骨肉瘤細(xì)胞增殖能力下降。進(jìn)一步通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后MG-63細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染后骨肉瘤細(xì)胞凋亡率上升。以上提示在骨肉瘤細(xì)胞中FOXO1也起著抑癌基因的作用，上調(diào)FOXO1的表達(dá)能夠抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖并促進(jìn)其凋亡，抑制骨肉瘤的進(jìn)展。

綜上所述，F(xiàn)OXO1在骨肉瘤細(xì)胞中呈低表達(dá)，上調(diào)骨肉瘤細(xì)胞中FOXO1的表達(dá)能夠抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡。這為骨肉瘤的靶向治療提供了可能的有效靶點(diǎn)。

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