孫 超，高 瑩，丁 晨，佟 洋，范 慧，張宏玲

（吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院 132101）

豬細(xì)小病毒(Porcine parvovirus，PPV)屬于細(xì)小病毒科細(xì)小病毒屬，是一種自主復(fù)制型病毒，臨床常以妊娠母豬流產(chǎn)、死胎、畸形胎、胎兒木乃伊化及弱仔等一系列癥狀為特征。豬細(xì)小病毒病常與其他導(dǎo)致母豬繁殖障礙的病原混合感染而致病，給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)了嚴(yán)重的損失[1-2]。目前國(guó)內(nèi)外針對(duì)豬細(xì)小病毒病的診斷有很多方法，其中以全病毒為檢測(cè)抗原的免疫學(xué)方法較常用,但由于全病毒在檢測(cè)應(yīng)用過程中有很強(qiáng)的感染性，且其生產(chǎn)和純化技術(shù)要求較高。因此應(yīng)用重組蛋白來(lái)檢測(cè)豬細(xì)小病毒病顯得尤為重要。鑒于此，本研究利用表達(dá)載體pET-SUMO在大腸桿菌中對(duì)VP2重組蛋白表達(dá)，并經(jīng)過濾膜、飽和硫酸銨、樹脂層析進(jìn)行一系列的純化獲得高純度的重組蛋白，為新型診斷試劑盒的研制提供基本資料。

1 材料與方法

1.1 菌株、質(zhì)粒

pET-sVP2重組質(zhì)粒為本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建；大腸桿菌表達(dá)載體pET-SUMO、宿主菌BL21均購(gòu)自北京原平皓生物技術(shù)有限公司。

1.2 主要試劑

限制性內(nèi)切酶NcoI和HindⅢ購(gòu)自南京生物制品有限公司；蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)購(gòu)自南京生物制品有限公司；T4DNA連接酶購(gòu)自Promega公司。質(zhì)粒提取純化試劑盒購(gòu)自O(shè)mega公司。DNA片段純化回收試劑盒購(gòu)自Axygen公司。

1.3 重組蛋白的表達(dá)、可溶性分析

采用不同 IPTG 濃度（0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2 mmol/L）、不同時(shí)間（0，1，2，3，4，5，6，7h）、不同溫度(25，27，29，31，33，35，37℃)對(duì)pET-sVP2重組蛋白進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。經(jīng)SDS-PAGE分析，確定重組蛋白的最佳條件誘導(dǎo)表達(dá)后，冰浴超聲裂解表達(dá)菌，于4℃離心機(jī)13000 r/min離心10min，收集上清和沉淀分別進(jìn)行SDS-PAGE電泳，鑒定其可溶性，為下一步蛋白的純化提供依據(jù)。

1.4 重組蛋白的純化

將經(jīng)SDS-PAGE電泳鑒定后的以包涵體形式表達(dá)的重組蛋白洗滌后，于－80℃冰箱反復(fù)凍融3次后進(jìn)行超聲裂解；離心，收集上清液，用0.45μm濾器過濾除去大分子雜質(zhì)。收集濾液分段加入硫酸銨，4℃攪拌過夜析出沉淀，然后離心6min，沉淀重懸于PBS中，透析、除鹽。將經(jīng)硫酸銨純化后的重組蛋白上Ni-NTA瓊脂糖凝膠柱進(jìn)行純化。用透析袋對(duì)純化后的蛋白進(jìn)行復(fù)性，用紫外分光光度法測(cè)定蛋白濃度。

2 結(jié)果

2.1 表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE

經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)的重組蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，可見一明顯52ku的目的條帶，與預(yù)期結(jié)果一致（見圖 1）。將重組菌體進(jìn)行超聲破碎，分別取上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE分析。結(jié)果顯示，重組蛋白在上清中含量較少，主要以包涵體的形式進(jìn)行表達(dá)（見圖 1）。

圖1 重組蛋白的SDS-PAGE分析

2.2 表達(dá)產(chǎn)物純化后的SDS-PAGE

取純化的蛋白樣品沸水浴5min，取20μL進(jìn)行SDS-PAGE，結(jié)果顯示經(jīng)過濾膜、飽和硫酸銨純化后除掉了大量的雜蛋白，經(jīng)過Ni-NTA柱純化后在52ku處僅有一清晰的特異性條帶（見圖2）。證明純化效果良好。紫外分光光度法測(cè)定蛋白濃度為2.29mg/mL。

圖2 重組蛋白的純化

3 討論

目前，國(guó)內(nèi)外針對(duì)豬細(xì)小病毒病的診斷有很多方法，其中以全病毒為檢測(cè)抗原的免疫學(xué)方法較為常用,但由于全病毒在檢測(cè)應(yīng)用過程中有很強(qiáng)的感染性，且其生產(chǎn)和純化技術(shù)要求較高。因此應(yīng)用重組蛋白作為抗原來(lái)檢測(cè)豬細(xì)小病毒病顯得尤為重要[3-4]。在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中，pET系統(tǒng)是蛋白表達(dá)的首選。在IPTG存在的條件下，該系統(tǒng)可調(diào)動(dòng)幾乎所有細(xì)胞資源都用于目的基因表達(dá)[5]。故本研究選擇大腸桿菌表達(dá)載體pET-SUMO，使得重組蛋白得以高效表達(dá)。常用的純化方法有中性鹽沉淀法、低溫乙醇沉淀法、凝膠柱層析法、免疫親和層析、高效液相色譜法等[6]。本研究通過對(duì)純化流程的優(yōu)化，對(duì)融合蛋白進(jìn)行純化并去除了雜蛋白，電泳結(jié)果可以看出，幾乎清除所有的雜蛋白而只保留了目的蛋白，試驗(yàn)證明大大提高了融合蛋白的純度。旨在為豬細(xì)小病毒病診斷方法的建立提供大量高純度的重組VP2蛋白；同時(shí)，也為實(shí)現(xiàn)重組VP2蛋白的規(guī)?；a(chǎn)提供參考數(shù)據(jù)。