范 新

(漢中三二O一醫(yī)院急診外科，陜西 漢中 723000)

膿毒癥是一種可危及生命的全身性炎癥反應(yīng)，急性發(fā)作時(shí)若未得到及時(shí)有效的治療可使多個(gè)器官和系統(tǒng)發(fā)生功能障礙，嚴(yán)重者出現(xiàn)膿毒性休克，死亡率近50%〔1〕。隨著醫(yī)療急救技術(shù)的快速發(fā)展，近年來(lái)膿毒癥死亡率呈下降趨勢(shì)，但老年膿毒癥患者因早期癥狀較為隱匿、診斷難度大且住院時(shí)多合并休克，導(dǎo)致死亡率明顯高于中青年患者〔2〕。因此，探索老年急性膿毒癥患者預(yù)后判斷的標(biāo)志物具有重要意義。CD20+CD24hi CD38hi 調(diào)節(jié)性B淋巴細(xì)胞(Bregs)是最新發(fā)現(xiàn)的可調(diào)節(jié)體內(nèi)免疫應(yīng)答的B淋巴細(xì)胞亞群〔3〕。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等炎癥性免疫相關(guān)疾病中均存在Bregs異常表達(dá)〔4〕。本次研究旨在探討老年急性膿毒癥患者外周血Bregs的變化情況及評(píng)估預(yù)后的價(jià)值。

1 對(duì)象與方法

1.1對(duì)象 選取2015年6～12月三二O一醫(yī)院急診科收治的老年急性膿毒癥患者。入選標(biāo)準(zhǔn)：符合SEPSIS-3診斷標(biāo)準(zhǔn)，非外傷或手術(shù)，住院時(shí)間>24 h；排除標(biāo)準(zhǔn)：合并自身免疫性疾病、惡性腫瘤、長(zhǎng)期服用糖皮質(zhì)激素類藥物或貧血的患者。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者或其家屬簽署知情同意書(shū)。將入組30 d設(shè)為研究終點(diǎn)，根據(jù)患者情況(痊愈出院或ICU轉(zhuǎn)普通病房、死亡)分為存活組和死亡組。

1.2方法

1.2.1臨床數(shù)據(jù)收集 記錄患者的年齡、性別、生命體征、感染部位、合并慢性病情況；常規(guī)進(jìn)行血液、痰液、尿液病原微生物培養(yǎng)；全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血常規(guī)、血肌酐、總膽紅素水平；免疫熒光層析法測(cè)定血清降鈣素原，免疫比濁法測(cè)定C反應(yīng)蛋白；電解質(zhì)分析儀和血?dú)夥治鰞x分別檢測(cè)電解質(zhì)、血?dú)?、?dòng)脈血乳酸(Lac)情況；計(jì)算急性生理與慢性健康評(píng)分量表(APACHEⅡ)評(píng)分和序貫器官衰竭評(píng)分。

1.2.2CD20+CD24 hi CD38hi Bregs檢測(cè) 分別于入院1、3、7 d抽取受試者空腹外周靜脈血5 ml，抗凝處理后2 000 r/min離心15 min，分離血漿，提取外周血單核細(xì)胞，放入無(wú)菌EP管中，分別加入FITC標(biāo)記的抗人CD20、PE標(biāo)記的抗人CD24、APC標(biāo)記的抗人CD38，室溫下暗室中靜置20 min，4 000 r/min離心10 min，棄去上清，加入染色洗滌液，離心后加2%多聚甲醛溶液固定，4 000 r/min離心10 min，離心后棄去上清，染色洗滌液重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)；以血常規(guī)中淋巴細(xì)胞數(shù)為參考計(jì)算Bregs所占比例。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SPSS21.0軟件，計(jì)量資料進(jìn)行t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資進(jìn)行χ2檢驗(yàn)；相關(guān)性進(jìn)行Spearman相關(guān)分析和二元Logistic回歸分析。

2 結(jié) 果

2.1入選患者一般情況 共入選116例患者，男76例，女40例，年齡60～91歲，平均(75.82±8.26)歲；合并疾?。郝宰枞苑渭膊?4例、心血管疾病24例、腦血管疾病20例、糖尿病26例、慢性腎病8例；感染部位：肺部78例、肝膽胰20例、腸道8例、泌尿道6例、皮膚軟組織4例；血培養(yǎng)均為陰性，痰液和尿液培養(yǎng)病原菌呈陽(yáng)性38例，其中8例患者培養(yǎng)出革蘭陽(yáng)性菌、26例患者培養(yǎng)出革蘭陰性菌、4例患者培養(yǎng)出真菌。

2.2兩組患者各臨床數(shù)據(jù)比較 死亡組APACHEⅡ評(píng)分、序貫器官衰竭評(píng)分明顯高于存活組(均P<0.05)；兩組患者性別構(gòu)成、年齡、總膽紅素、血肌酐、血清降鈣素原、C反應(yīng)蛋白、Lac之間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。見(jiàn)表1。

2.3兩組患者CD20+CD24hi CD38hi Bregs水平比較 Bregs流式細(xì)胞術(shù)設(shè)門(mén)策略及檢測(cè)情況見(jiàn)圖1。存活組和死亡組患者入院7 d CD20+CD24hi CD38hi Bregs水平均明顯低于入院1、3 d(均P<0.05)；入院1 d和3 d CD20+CD24hi CD38hi Bregs水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。入院1、3、7 d存活組CD20+CD24hi CD38hi Bregs水平均明顯低于死亡組(均P<0.05)。見(jiàn)表2。

表1 存活組與死亡組患者各臨床數(shù)據(jù)比較

A：圈定的為淋巴細(xì)胞群；B：去除黏連細(xì)胞；C：CD20+ B細(xì)胞占淋巴細(xì)胞比例；D：Bregs占CD20+ B細(xì)胞比例圖1 老年急性膿毒癥患者外周血CD20+ CD24hi CD38hi Bregs設(shè)門(mén)策略及檢測(cè)情況

表2 存活組與死亡組CD20+ CD24hi CD38hi Bregs水平比較

2.4CD20+2024hiCD38hi Bregs與各指標(biāo)相關(guān)性 入院1 d時(shí)老年急性膿毒癥患者外周血CD20+CD24hi CD38hi Bregs水平與APACHEⅡ評(píng)分呈負(fù)相關(guān)(r=-0.462，P=0.005)，與總膽紅素、血肌酐、血清降鈣素原、C反應(yīng)蛋白、Lac、序貫器官衰竭評(píng)分之間均無(wú)明顯相關(guān)性(P>0.05)。

2.5老年急性膿毒癥患者預(yù)后危險(xiǎn)因素分析 對(duì)老年急性膿毒癥患者存活組與死亡組之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的指標(biāo)CD20+CD24hi CD38hi Bregs、APACHEⅡ評(píng)分、序貫器官衰竭評(píng)分進(jìn)行二元Logistic回歸分析，最終CD20+CD24hi CD38hi Bregs和APACHEⅡ評(píng)分進(jìn)入方程，是影響老年急性膿毒癥患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 老年急性膿毒癥預(yù)后危險(xiǎn)因素二元Logistic回歸分析

2.6CD20+2024hiCD38hi Bregs、APACHEⅡ評(píng)分預(yù)測(cè)患者死亡的價(jià)值 入院后1、3、7 d CD20+CD24hi CD38hi Bregs水平、APACHEⅡ評(píng)分對(duì)老年急性膿毒癥患者預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值均較高(AUC 0.8～0.9)，其中入院7 d Bregs水平的預(yù)測(cè)價(jià)值最高(AUC=0.992)。見(jiàn)表4、圖2。

表4 APACHEⅡ評(píng)分及入院后不同時(shí)間點(diǎn)CD20+ CD24hi CD38hi Bregs對(duì)預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值

圖2 APACHEⅡ評(píng)分及入院后不同時(shí)間點(diǎn)Bregs預(yù)測(cè)患者預(yù)后的受試者工作特征(ROC)曲線

3 討 論

隨著我國(guó)人口老齡化的不斷加劇，老年膿毒癥患者數(shù)逐年上升，因膿毒癥致殘、致死以及再入院的發(fā)生率均較高〔5〕。老年膿毒癥患者發(fā)病早期診斷難度較大，目前仍缺少敏感度和特異度較高的預(yù)后判斷指標(biāo)；尋求可準(zhǔn)確有效判斷老年膿毒癥患者預(yù)后的標(biāo)志物受到該領(lǐng)域研究者的廣泛關(guān)注。

CD20+CD24 hi CD38hi Bregs水平與體內(nèi)免疫耐受明顯相關(guān)，是分泌白細(xì)胞介素(IL)-10的B淋巴細(xì)胞亞群主要表型。Bregs能夠通過(guò)分泌IL-10、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β等相關(guān)機(jī)制調(diào)控體內(nèi)免疫應(yīng)答和免疫耐受。不同疾病中Bregs表達(dá)具有差異性，相關(guān)研究顯示，Bregs在系統(tǒng)硬化癥患者中分泌量明顯下降，功能和表型均受損，當(dāng)給予B淋巴細(xì)胞受體及TLR9刺激后，B淋巴細(xì)胞出現(xiàn)P38Mark/STAT3信號(hào)通路激活受損〔6〕。亦有研究發(fā)現(xiàn)，自身免疫性風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者CD24hi CD38hi Bregs水平明顯低于健康人群〔7〕。

上述研究提示，Bregs可能通過(guò)抑制體內(nèi)免疫系統(tǒng)正常功能，參與炎癥性疾病的病理生理過(guò)程。本次研究顯示，Bregs水平降低程度與老年急性膿毒癥患者病情嚴(yán)重程度呈正比。

APACHEⅡ評(píng)分作為經(jīng)典的病情嚴(yán)重程度評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，廣泛用于臨床各類危重患者診治過(guò)程。相關(guān)研究顯示，APACHEⅡ評(píng)分與重者監(jiān)護(hù)室患者住院時(shí)間呈負(fù)相關(guān)，與死亡率呈正相關(guān)〔8〕。序貫器官衰竭評(píng)分在評(píng)估危重患者器官功能方面也具有較好的可靠性，高序貫器官衰竭評(píng)分與病死率呈正相關(guān)。本次研究也顯示，Bregs水平可作為評(píng)估老年急性膿毒癥患者預(yù)后的重要標(biāo)志物。

1秦慶華.調(diào)節(jié)性T細(xì)胞促效應(yīng)T細(xì)胞凋亡在膿毒癥免疫抑制中的作用及機(jī)制研究〔D〕.廣州：南方醫(yī)科大學(xué),2013.

2盛 博,陳 煒,趙 磊,等.HVHF治療對(duì)老年膿毒癥患者外周血單核細(xì)胞miRNA-155表達(dá)的影響〔J〕.中國(guó)老年學(xué)雜志,2017；37(12):3039-40.

3嚴(yán)尚學(xué).BLyS促進(jìn)MRL/lpr小鼠淋巴細(xì)胞活化的機(jī)制及TACI-Ig的作用〔D〕.合肥：安徽醫(yī)科大學(xué),2015.

4曾建瓊,程青虹,王桂萍.老年膿毒癥患者血糖變異度與預(yù)后的相關(guān)性〔J〕.中國(guó)老年學(xué)雜志,2017;37(10):2520-2.

5許昌海,金紅旭.持續(xù)性腎臟替代聯(lián)合血必凈對(duì)膿毒癥患者炎癥反應(yīng)、免疫功能的影響〔J〕.中國(guó)衛(wèi)生工程學(xué),2016;15(5):499-500.

6姜 楠.系統(tǒng)性硬化癥患者外周血中Th17細(xì)胞、CD4+CD25+Treg細(xì)胞及B細(xì)胞的研究〔D〕.北京：協(xié)和醫(yī)學(xué)院,2009.

7鄒 暉.重癥急性胰腺炎合并感染的危險(xiǎn)因素及預(yù)防研究〔J〕.中國(guó)衛(wèi)生工程學(xué),2017;16(2):228-9.

8崔莎莎,徐松寶,姜巖碩,等.腸出血性大腸埃希菌O157:H7緊密黏附素C300與LTB融合蛋白B細(xì)胞表位預(yù)測(cè)〔J〕.北華大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2011;12(3):296-9.