奐劍波，陳麗娜，史成和，代 維，袁丹鳳，周繼紅，韓志海

體溫過(guò)低癥是指機(jī)體核心溫度低于35 ℃的狀態(tài)，嚴(yán)重者可導(dǎo)致多器官功能障礙綜合癥，救治極為困難[1]。海水浸泡是導(dǎo)致體溫過(guò)低癥的重要原因，海水落水獲救低溫傷員與其他原因(如雪崩掩埋)導(dǎo)致的體溫過(guò)低癥相比，通常并未完全昏迷，無(wú)明顯呼吸道阻塞現(xiàn)象等，其預(yù)后有所不同[2]。對(duì)于海水浸泡型體溫過(guò)低癥的研究需要建立相應(yīng)的大鼠模型，現(xiàn)有模型多數(shù)在麻醉?xiàng)l件下完成，然而麻醉對(duì)于呼吸、心血管活動(dòng)的抑制與低溫可能有協(xié)同作用，由此帶來(lái)的病理生理改變不盡相同，麻醉對(duì)建立重度體溫過(guò)低癥大鼠模型的影響亟待明確。本研究通過(guò)實(shí)驗(yàn)對(duì)比麻醉與不麻醉大鼠海水浸泡性體溫過(guò)低癥模型建立時(shí)的腹腔溫度、活動(dòng)-意識(shí)狀況、呼吸、心率、肌顫、死亡率等差異，探討麻醉對(duì)于大鼠體溫過(guò)低癥模型建立的作用與影響，并討論不麻醉大鼠模型建立的可行性及適用范圍。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與特殊儀器材料 雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠由第三軍醫(yī)大學(xué)野戰(zhàn)外科研究所動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供[SCXK(渝)2012-0005] ；實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)海軍總醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)；冷熱恒溫水槽(型號(hào)TC-LR650，上海雙舜實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司)；溫度記錄器(iButton,型號(hào)DS1922L，Maxim/Dallas公司生產(chǎn)；設(shè)置溫度記錄啟動(dòng)時(shí)間為預(yù)期低溫浸泡實(shí)驗(yàn)前8 h，溫度記錄頻次1/min，放入90℃融化石蠟中浸泡3 s，取出冷卻，75%乙醇中浸泡消毒30 min備用)；自制大鼠水浴固定器；海鹽(廣州益爾生物工程有限公司，按比例配制鹽度3%海水浸泡用)等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法與觀察指標(biāo)

1.2.1 實(shí)驗(yàn)前處理與分組 大鼠實(shí)驗(yàn)前10 d麻醉，備皮，消毒，右上腹開2 cm切口，將預(yù)處理后的溫度記錄器置入腹腔，縫合切口并涂抹紅霉素軟膏，大鼠蘇醒后常規(guī)單籠飼養(yǎng)，每天給予青霉素鈉20萬(wàn)U腹腔注射,連續(xù)3 d，術(shù)后連續(xù)觀察10 d，選取大鼠手術(shù)切口愈合良好無(wú)感染，體重穩(wěn)定增長(zhǎng)，活動(dòng)自如，飲食排便良好的40只大鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，體重(286.5±10.7)g，按隨機(jī)數(shù)法隨機(jī)分為生理鹽水腹腔注射組(對(duì)照組)和1.5%戊巴比妥鈉腹腔注射組(麻醉組)，每組20只。

1.2.2 低溫海水浸泡實(shí)驗(yàn) 大鼠稱重后，麻醉組按體重30 mg/kg給予1.5%戊巴比妥鈉腹腔注射，對(duì)照組按體重相應(yīng)給予麻醉藥相同體積生理鹽水腹腔注射，10 min待麻醉組完全麻醉后將2組大鼠同時(shí)放入自制大鼠水浴固定器內(nèi)，然后置入(15±0.2)℃鹽度3%海水中浸泡，浸泡深度為鎖骨水平，每10 min觀測(cè)并記錄1次大鼠活動(dòng)意識(shí)狀況(分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)見后)、呼吸頻率、心率、肌顫頻率等，浸泡2 h后，每30 min觀測(cè)上述數(shù)據(jù)，如死亡記錄死亡時(shí)間；浸泡實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，處死大鼠，取出溫度記錄器，用專用儀器和軟件讀取腹腔溫度數(shù)據(jù)。

1.2.3 SD大鼠活動(dòng)意識(shí)簡(jiǎn)易分級(jí)標(biāo)準(zhǔn) 分為7級(jí)：應(yīng)激反應(yīng)激烈，活動(dòng)顯著增強(qiáng)；6級(jí)：較平靜狀態(tài)，活動(dòng)稍加強(qiáng)；5級(jí)：平靜穩(wěn)定，活動(dòng)自如；4級(jí)：意識(shí)稍微抑制，活動(dòng)度減低；3級(jí)：無(wú)明顯活動(dòng)，對(duì)輕刺激有反應(yīng)；2級(jí)：無(wú)活動(dòng)，對(duì)強(qiáng)刺激有反應(yīng)；1級(jí)：深度昏迷，對(duì)強(qiáng)刺激無(wú)任何反應(yīng)。

2 結(jié)果

2.1 腹腔溫度 實(shí)驗(yàn)前對(duì)照組與麻醉組腹腔溫度均正常，分別為(37.8±0.5)℃和(38.2±0.1)℃，在腹腔注射10 min后2組腹腔溫度均略有下降，對(duì)照組降幅(0.7±0.5)℃明顯小于麻醉組(1.8±0.5)℃(t=7.19，P<0.05)；海水浸泡后均快速下降，浸泡120 min左右逐漸接近水溫，然后維持相對(duì)穩(wěn)定的低溫狀態(tài)(將浸泡120 min前后分為體溫下降期和低溫維持期)。體溫下降期內(nèi)，2組均在10 min左右下降速度最快，且該時(shí)間點(diǎn)麻醉組腹腔溫度小于對(duì)照組[差值為(0.9±0.3)℃，t=3.01，P<0.05] ，30 min后下降速度趨緩，2組間差值逐漸減?。痪S持期對(duì)照組腹腔溫度(15.7±0.2)℃高于麻醉組(15.6±0.2)℃(t=3.72，P<0.05)，見圖1A。典型單個(gè)大鼠腹腔溫度連續(xù)變化曲線見圖3。

2.2 活動(dòng)意識(shí)等級(jí) 實(shí)驗(yàn)前對(duì)照組與麻醉組中位活動(dòng)意識(shí)等級(jí)均為5級(jí)，腹腔注射后對(duì)照組升至6級(jí)，而麻醉組降至3級(jí)；海水浸泡后對(duì)照組先迅速上升至7級(jí)，維持20 min左右，后快速下降并于60 min時(shí)降至3級(jí)，繼而階梯式緩慢下降，于300 min時(shí)降至1級(jí)，而麻醉組中位活動(dòng)意識(shí)等級(jí)則持續(xù)階梯式下降，于40 min左右降至2級(jí)，80 min左右降至1級(jí)。體溫下降期對(duì)照組中位活動(dòng)意識(shí)等級(jí)均大于麻醉組，差異先增大后減小，10 min時(shí)2組差異最大(分別為7級(jí)和3級(jí)，Z=5.94，P<0.05)；維持期2組中位活動(dòng)意識(shí)等級(jí)差異明顯(分別為2級(jí)和1級(jí)，Z=9.11，P<0.05)，見圖1B。

2.3 心率 實(shí)驗(yàn)前對(duì)照組與麻醉組心率均正常，分別為(366.0±26.4)/min和(397.8±16.6)/min，腹腔注射10 min后對(duì)照組升高了(32.5±23.2)/min，而麻醉組降低了(49.8±7.7)/min(變化幅度對(duì)比，t=15.08，P<0.05)；海水浸泡后對(duì)照組繼續(xù)升高，于10 min左右達(dá)到峰值，然后先快速下降后緩慢下降，至浸泡120 min時(shí)在較低水平維持相對(duì)穩(wěn)定，而麻醉組心率在浸泡過(guò)程中持續(xù)下降，下降速度先快后慢，至浸泡120 min左右低水平維持相對(duì)穩(wěn)定。整個(gè)浸泡過(guò)程中各時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組心率均大于麻醉組，差值先增大后變小，10 mim時(shí)2組差值最大(156.0±8.7)/min(t=17.83，P<0.05)；維持期對(duì)照組心率(81.0±10.4)/min仍高于麻醉組(55.9±6.7)/min(t=15.49，P<0.05)，見圖1C。

2.4 呼吸頻率 實(shí)驗(yàn)前對(duì)照組與麻醉組呼吸頻率均正常，分別為(85.4±11.0)/min和(90.9±3.4)/min，腹腔注射10 min后對(duì)照組升高了(5.9±5.4)/min，而麻醉組降低了(9.4±2.5)/min(變化幅度對(duì)比，t=11.5，P<0.05)；海水浸泡后對(duì)照組升高，于10 min左右達(dá)到峰值，然后先快速下降后緩慢下降，至浸泡120 min時(shí)在較低水平維持相對(duì)穩(wěn)定，而麻醉組在浸泡過(guò)程中持續(xù)降低，速度先快后慢，至浸泡120 min左右低水平維持相對(duì)穩(wěn)定。整個(gè)浸泡過(guò)程中各時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組呼吸頻率均大于麻醉組，差值先增大后變小，10 min時(shí)2組差值最大為(44.1±3.7)/min(t=12.05，P<0.05)；維持期對(duì)照組呼吸頻率(18.5±2.4)/min仍高于麻醉組(13.9±1.4)/min(t=13.7，P<0.05)，見圖1D。

2.5 肌顫頻率 實(shí)驗(yàn)前對(duì)照組與麻醉組均無(wú)肌顫產(chǎn)生，腹腔注射后2組仍無(wú)肌顫。海水浸泡后，對(duì)照組全部、麻醉組大部分(85%)大鼠出現(xiàn)肌顫，頻率均逐漸升高，對(duì)照組升高速度較麻醉組快，2組峰值均在浸泡20 min左右出現(xiàn)，對(duì)照組(46.5±11.8)/min明顯高于麻醉組(2.8±3.2)/min(t=15.99，P<0.05)，后2組肌顫均逐漸下降，對(duì)照組于110 min肌顫完全消失，晚于麻醉組(80 min)，見圖1E。

2.6 死亡率 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)照組首只大鼠死亡時(shí)間(80 min)晚于麻醉組(60 min)；對(duì)照組死亡率(35%)明顯低于麻醉組(75%)(χ2=6.47，P<0.05)；對(duì)照組中位死亡時(shí)間(165 min)晚于麻醉組(115 min)(圖2)。

圖1 SD大鼠低溫海水浸泡生命體征觀察注：圖中時(shí)間點(diǎn)“-10 min”為腹腔注射生理鹽水或者1.5%戊巴比妥鈉前，“0 min”為入水浸泡前，其余為浸泡后時(shí)間點(diǎn)

圖2 SD大鼠低溫海水浸泡生存曲線

圖3 典型腹腔溫度連續(xù)變化曲線

3 討論

海水浸泡性體溫過(guò)低癥在現(xiàn)代海戰(zhàn)中發(fā)生率較高，傷情較重，是海戰(zhàn)傷救治研究的重要內(nèi)容[3]。麻醉與否是區(qū)別意外性體溫過(guò)低癥和治療性低溫的一個(gè)重要特征，通常麻醉狀態(tài)下程序化的低溫處理對(duì)于人體的損傷明顯小于野外環(huán)境中低溫對(duì)人的直接損傷，故在建立大鼠模型研究海水浸泡性體溫過(guò)低癥時(shí)需要對(duì)是否麻醉進(jìn)行謹(jǐn)慎的思考[4]。采用不麻醉大鼠進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)涉及動(dòng)物倫理，本研究中我們將不麻醉大鼠采用自制水浴固定器固定，盡可能減少了其對(duì)于低溫海水環(huán)境應(yīng)激，同時(shí)由于低溫本身的“麻醉”效應(yīng)，意識(shí)逐漸散失，其在死亡前很長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)感受的傷害痛苦值可認(rèn)為較輕，符合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理要求；另外，該固定器還有效防止大鼠海水浸泡時(shí)的淹溺。建立不麻醉大鼠體溫過(guò)低癥模型，核心溫度的監(jiān)測(cè)采用傳統(tǒng)的麻醉時(shí)測(cè)溫方式顯然是不合適的，本團(tuán)隊(duì)預(yù)實(shí)驗(yàn)中利用電子溫度探針同時(shí)檢測(cè)低溫海水浸泡大鼠肛門、腹腔、胸腔溫度，發(fā)現(xiàn)腹腔溫度較肛門溫度更接近胸腔溫度，更能反映機(jī)體核心體溫。楊明等[5]利用連續(xù)溫度記錄系統(tǒng)回顧性描繪了不麻醉達(dá)烏爾黃鼠冬眠期間腹腔溫度變化曲線，本研究將該方法成功運(yùn)用到不麻醉大鼠低溫海水浸泡實(shí)驗(yàn)中，獲取了不麻醉大鼠的連續(xù)腹腔溫度變化曲線，避免了頻繁測(cè)溫對(duì)于不麻醉大鼠低溫浸泡實(shí)驗(yàn)的影響。大鼠比人更能耐受低溫，人核心體溫(通常指肛溫)達(dá)到28 ℃以下時(shí)即為重度體溫過(guò)低癥[1]，而在此核心溫度下大鼠的生存幾乎不受影響；科學(xué)家們習(xí)慣將大鼠的肛溫下降至15 ℃左右作為重度體溫過(guò)低癥的標(biāo)準(zhǔn)，低溫維持時(shí)間0.5～10 h不等[6-8]。本研究中麻醉與不麻醉大鼠模型腹腔溫度最終均穩(wěn)定在15～16 ℃，屬于重度海水浸泡性體溫過(guò)低癥模型。

研究發(fā)現(xiàn)建立海水浸泡體溫過(guò)低癥過(guò)程中麻醉不僅對(duì)意識(shí)產(chǎn)生了直接的抑制作用，同時(shí)也使大鼠腹腔溫度曲線發(fā)生了細(xì)微的變化，不僅使主動(dòng)活動(dòng)消失，同時(shí)也使被動(dòng)肌肉收縮發(fā)生困難，另外對(duì)于呼吸和心血管系統(tǒng)的影響無(wú)論在體溫下降期還是低溫維持期都是明顯而且巨大的，最終大大提高了海水浸泡體溫過(guò)低癥大鼠的死亡率，并使中位死亡時(shí)間提前。主要原因?yàn)?，戊巴比妥鈉作為常用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物麻醉用藥，具有擬γ-氨基丁酸的作用，能與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的突觸后膜γ-氨基丁酸受體結(jié)合，在沒有γ-氨基丁酸時(shí)大劑量戊巴比妥鈉能直接活化Cl-通道，Cl-的大量?jī)?nèi)流使突觸后膜發(fā)生超級(jí)化，進(jìn)而降低突觸后神經(jīng)元的興奮性，并主要在中樞神經(jīng)系統(tǒng)抑制腦干網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)上行激活系統(tǒng)，達(dá)到催眠、鎮(zhèn)靜效果，同時(shí)對(duì)呼吸和循環(huán)也有顯著的抑制作用[9]。有趣的是，與不麻醉相比，雖然麻醉大鼠主動(dòng)、被動(dòng)活動(dòng)(肌顫)被抑制，呼吸、心血管功能減弱，理論上麻醉大鼠的體溫下降比不麻醉大鼠更快，然而本研究中體溫下降過(guò)程中麻醉組較對(duì)照組腹腔溫最大差異僅約0.9 ℃，麻醉對(duì)于SD大鼠海水浸泡時(shí)腹腔溫變化差異并無(wú)想象中明顯，且低溫海水浸泡初始階段腹腔溫均呈現(xiàn)斷崖式下降，未出現(xiàn)顯著的體溫代償效應(yīng)。原因可能為，SD大鼠相對(duì)于大動(dòng)物或者人體重輕、體壁薄，機(jī)體與外界熱量交換缺乏縱深，難以代償?shù)蜏睾Ｋ畬?duì)于熱量的汲取，由于海水良好的導(dǎo)熱性能，浸泡海水溫度與體壁厚度成為了核心溫度下降速度的決定因素，其主動(dòng)或者被動(dòng)的生理產(chǎn)熱對(duì)溫度曲線變化的影響相對(duì)降低，在大動(dòng)物或者人類，由于體壁厚、主動(dòng)活動(dòng)代償?shù)?，體溫下降曲線可能呈反S下降的過(guò)程，需要后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。鑒于麻醉對(duì)建立重度海水浸泡體溫過(guò)低癥大鼠模型的巨大影響，我們?cè)谶M(jìn)行相關(guān)研究時(shí)需要根據(jù)研究目的對(duì)2種大鼠模型進(jìn)行對(duì)比選擇。

目前常用麻醉大鼠建模[7, 10]，麻醉大鼠具有操作便利、測(cè)溫方式選擇多樣、檢測(cè)指標(biāo)容易等優(yōu)點(diǎn)，然而不麻醉大鼠在反映真實(shí)海水浸泡低溫?fù)p傷時(shí)具有優(yōu)勢(shì)，且在某些研究方向難以被麻醉大鼠替代。首先，意識(shí)狀況是體溫過(guò)低癥分級(jí)的重要參考依據(jù)，重度體溫過(guò)低癥傷員意識(shí)均模糊或者消失，細(xì)化海水浸泡體溫過(guò)低癥分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)時(shí)需要在實(shí)驗(yàn)中保持大鼠處于清醒狀態(tài)，同時(shí)重度體溫過(guò)低癥傷員救治成功后神經(jīng)系統(tǒng)的改變也是研究熱點(diǎn)之一[11]，不麻醉大鼠模型在研究低溫與神經(jīng)意識(shí)相互關(guān)系時(shí)具有優(yōu)勢(shì)。其次，應(yīng)激反應(yīng)在低溫海水浸泡損傷中扮演重要角色，人體落水時(shí)促腎上腺皮質(zhì)素、糖皮質(zhì)激素、甲狀腺素、胰高血糖素等均分泌增高[12]，機(jī)體由此發(fā)生一系列相應(yīng)變化，然而隨著低溫維持時(shí)間延長(zhǎng)其變化趨勢(shì)不甚明了，其對(duì)體溫過(guò)低癥的救治影響較大，均需要以不麻醉大鼠來(lái)進(jìn)行研究。另外，麻醉雖然對(duì)于海水浸泡大鼠體溫下降及低溫維持階段的溫度變化曲線影響不大，但是由于其對(duì)能量代謝的影響固定存在的，這種影響反而更易在脫離低溫海水浸泡環(huán)境中表現(xiàn)出來(lái)，很可能對(duì)于大鼠體溫恢復(fù)能力的產(chǎn)生影響，加之麻醉與否還與自身活動(dòng)導(dǎo)致能量物質(zhì)貯備的消耗有關(guān)，不麻醉大鼠更能模擬體溫過(guò)低癥復(fù)溫過(guò)程中能量代謝變化趨勢(shì)，對(duì)于海水浸泡體溫過(guò)低癥的救治更加具有現(xiàn)實(shí)指導(dǎo)意義。

綜上所述，麻醉對(duì)建立重度海水浸泡性體溫過(guò)低癥大鼠模型影響較大，麻醉與不麻醉大鼠模型在研究海水浸泡體溫過(guò)低癥時(shí)各有優(yōu)缺點(diǎn)，不麻醉大鼠模型在低溫與神經(jīng)系統(tǒng)相互關(guān)系、低溫與應(yīng)激反應(yīng)、復(fù)溫時(shí)能量代謝等方面的研究更具優(yōu)勢(shì)。

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