孟祥祎，張?jiān)平?，陳雨欣，?嵩，張向宇

(佳木斯大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007)

以內(nèi)充氣體的微泡為載體，攜帶抗體的主動(dòng)性靶向超聲造影劑，經(jīng)過靜脈注射通過血管到達(dá)各組織器官，可以顯著增強(qiáng)病變部位和正常組織的對(duì)比度，在超聲分子成像和血管疾病靶向治療中有著重要的意義[1-2]。動(dòng)脈粥樣硬化是心血管系統(tǒng)常見病，危害嚴(yán)重，以動(dòng)脈粥樣斑塊形成為典型特征，因此早期準(zhǔn)確識(shí)別易損斑塊是預(yù)防和治療動(dòng)脈粥樣硬化的關(guān)鍵措施。VEGFR-2 作為重要的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的主要受體，高表達(dá)于易損斑塊新生血管的內(nèi)皮細(xì)胞[3-4]。常規(guī)超聲造影劑平均直徑為2～4μm，能自由通過肺循環(huán)，但不能透過血管內(nèi)皮，臨床應(yīng)用有一定局限性。而納米級(jí)超聲造影劑粒徑更小，穿透力更強(qiáng)，能夠通過血管內(nèi)皮，在特定的病變部位聚集，提高超聲診斷的準(zhǔn)確性和特異性[5-6]。根據(jù)這些機(jī)制，我們的實(shí)驗(yàn)研究借助生物素-親和素的橋連作用，將抗體 VEGFR-2 整合于納米級(jí)微泡造影劑表面，構(gòu)建具有特異性診斷斑塊新生血管的靶向超聲造像劑，使該納米微泡選擇性高濃度聚集于易損斑塊產(chǎn)生靶區(qū)顯影增強(qiáng)，為其今后的載藥治療研究提供依據(jù) 。

1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

大豆磷脂；吐溫-80；六氟化硫氣體；二肉豆蔻酰磷脂酰膽堿；二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙烯二醇2000-生物素；鏈親和素；生物素化小鼠抗兔 VEGFR-2 單克隆抗體；FITC標(biāo)記山羊抗小鼠二抗。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

電子天平、磁力攪拌器、超聲細(xì)胞粉碎儀、高速離心機(jī)、投射電子顯微鏡、激光粒度分析儀、熒光顯微鏡、流式細(xì)胞儀、彩色多普勒超聲診斷儀。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康新西蘭大白兔2只，平均體質(zhì)量2.2 kg ,每日給予高膽固醇蛋黃3個(gè)喂養(yǎng)4周, 采用高脂飲食損傷血管內(nèi)皮。

1.4 制備方法

采用超聲乳化法制備納米級(jí)脂質(zhì)微泡[7]。配制含1%吐溫80的生理鹽水20mL，取生物素化的DSPE-PEG(2000) 0.02g和大豆磷脂0.1g溶于該溶液，再加入0.04 g DMPC使磷脂常溫下充分溶脹。在細(xì)胞粉碎儀中超聲乳化2min(50W，40 kHz)，制備過程中持續(xù)通入SF6氣體。制得的納米微泡放在4℃的冰箱中5h靜置分層，棄去上層大粒徑微泡，收集中下層溶液洗滌，重懸制得納米級(jí)微泡造影劑。采用生物素-親和素法制備靶向微泡[8]，首先將鏈親和素加入制備好的生物素化微泡中孵育1h，離心，洗滌3次，得到親和素-生物素化微泡造影劑。然后將生物素化 VEGFR-2 單抗與親和素-生物素化微泡造影劑孵育過夜，最后與 FITC 標(biāo)記的山羊抗小鼠 IgG 稀釋液混合，在37℃孵育1h，得到熒光標(biāo)記 VEGFR-2 靶向納米級(jí)微泡造影劑。

1.5 微泡表征

用投射電子顯微鏡觀察靶向微泡和空白微泡的結(jié)構(gòu)、粒徑和形態(tài)；用激光粒度分析儀分析粒徑大小及分布；熒光顯微鏡下觀察靶向微泡與抗體結(jié)合率；將靶向微泡和空白微泡各 1ml，以稀釋液稀釋至流式細(xì)胞儀檢測(cè)其配體攜帶率。

1.6 體內(nèi)超聲成像

經(jīng)兔耳緣靜脈注射麻醉動(dòng)物，兔備皮后仰臥位固定于操作臺(tái)上暴露腹部掃查部位。用頭皮針經(jīng)尾靜脈建立靜脈通道后注入納米微泡0.5mL/kg,，隨后尾注生理鹽水沖洗管道。調(diào)節(jié)彩色超聲診斷儀，采用腹部探頭普通造影模式，探頭頻率 2～5 MHz；觀察動(dòng)脈內(nèi)膜面有無斑塊形成、斑塊部位、斑塊大小和回聲特點(diǎn)。

2 結(jié)果

2.1 微泡形態(tài)、形貌觀察和粒徑分析

利用投射電子顯微鏡觀察微泡的形貌。靶向微泡分布均勻，分散性較好 (圖1a)。粒徑小于700 nm的納米級(jí)微泡造影劑可穿越腫瘤組織血管內(nèi)皮間隙到達(dá)腫瘤靶區(qū)，在腫瘤組織中富集而實(shí)現(xiàn)被動(dòng)靶向[9]。用激光粒度分析儀分析其粒徑分布(圖2b)為416±78nm，符合作納米級(jí)造影劑的粒徑要求，也證實(shí)了投射電子顯微鏡的測(cè)量結(jié)果。

2.2 微泡熒光標(biāo)記觀察

結(jié)合了FITC 標(biāo)記的山羊抗小鼠 IgG的納米級(jí)磷脂微泡在光學(xué)模式圖2(a)中，微泡分散度較好，粒徑符合激光粒度分析儀的測(cè)量結(jié)果。在熒光模式圖2(b)中，絕大多數(shù)微泡表面可見明亮的黃色環(huán)狀熒光，而微泡以外的背景無熒光顯示，表明微泡已經(jīng)成果標(biāo)記上靶向抗體。應(yīng)用流式細(xì)胞儀測(cè)試抗體的結(jié)合率為42.71%。

2.3 體內(nèi)超聲成像實(shí)驗(yàn)

作為超聲造影劑的一個(gè)最重要的應(yīng)用是能夠增強(qiáng)超聲診斷信號(hào)的回波強(qiáng)度，首先，不注射造影劑，如圖3(a)，在圖像中回聲很低，可以從回聲信號(hào)中觀察到管內(nèi)、血管壁和血管外。另外，在白色箭頭所指的位置，能夠看到血管內(nèi)皮的增厚現(xiàn)象。但是在超聲二維圖像上，無法觀察到更有說服力的證據(jù)。

為了證實(shí)自制的超聲造影劑的對(duì)比成像能力，我們注入1mL的0.15 mL/kg自制的超聲造影劑，數(shù)秒鐘內(nèi)在血管中出現(xiàn)較強(qiáng)的多普勒增強(qiáng)。如圖3(b)，可以顯著的增強(qiáng)組織間的回聲。在白色箭頭所指的位置所顯示的圖像是區(qū)別周圍的，是與5(a)中白色箭頭相應(yīng)位置的圖像，通過超聲造影劑的加入可以確定動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的位置。證實(shí)了自制的超聲造影劑具有對(duì)比成像和靶向定位斑塊的能力。