康慧芬，徐 建，李曉靜，王佳文，楊惠琳，張立忠

(1.寧夏寶塔化工中心實驗室(有限公司),寧夏 銀川 750001； 2.寧夏寶塔石化科技實業(yè)發(fā)展有限公司,寧夏 銀川 750001)

枸杞是傳統(tǒng)的常用中藥材，具有養(yǎng)肝明目、補血安神、潤肺止咳、延緩衰老等功效[1]。有效化學(xué)成分主要包括色素類、多糖類和黃酮類化合物等[2]。黃酮類化合物是枸杞的重要活性成分，能改善血液循環(huán)、抗菌消炎、抗氧化、抗衰老、增強免疫力等，已作為天然色素、抗氧化劑、抗菌劑應(yīng)用于食品工業(yè)、藥物、化妝品等行業(yè)。由于其具有較強的藥理作用與生物活性，已成為國內(nèi)外關(guān)注和研究的熱點[3]。本研究采用超聲微波協(xié)同萃取法提取枸杞中的總黃酮。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

材料：枸杞(寧夏沃福百瑞生物食品工程有限公司)在60℃烘箱中烘干過夜，用粉碎機粉碎，混勻后待用。

標(biāo)準(zhǔn)品：蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(中國藥品生物制品檢定所);

試劑：乙醇、氫氧化鈉、硝酸鋁、亞硝酸鈉，均為分析純。

1.2 主要儀器

超聲微波協(xié)同萃取儀(上海新拓微波溶樣測試技術(shù)有限公司); 電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司); 紫外-可見分光光度計(德國耶拿儀器公司)等。

1.3 試驗方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

精密稱量10.00mg干燥至恒重的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品于100mL容量瓶中,加入70%乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻后備用。此標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為0.10mg/mL。

1.3.2 最大吸收波長的確定

精確量取10mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液于50mL容量瓶中,加入2mL 5%亞硝酸鈉溶液,混勻后于室溫放置6min；加入2mL 10%硝酸鋁溶液,混勻后室溫放置6min；再加入10mL 4%的氫氧化鈉溶液,搖勻；最后用蒸餾水定容，搖勻后室溫放置15min。用紫外-可見分光光度計在400～600nm間進行波譜掃描，確定最大吸收波長。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別精確移取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL于25mL容量瓶中,首先加入1mL 5%的亞硝酸鈉溶液,混勻后于室溫放置6min；然后加入1mL 10%的硝酸鋁溶液,混勻后于室溫放置6min；再加入5mL 4%的氫氧化鈉溶液,搖勻；最后用蒸餾水定容,搖勻后靜置15min。以不加樣品的溶液為參比溶液，在最大吸收波長處測定吸光度,以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度(C)為橫坐標(biāo)，吸光度(A)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.4 樣品的制備

精密稱取1.00g枸杞粉末,加入一定量70%乙醇溶液，稱重，在一定條件下超聲-微波協(xié)同萃取后繼續(xù)稱重，補足損失重量，過濾得到濾液。精確量取該濾液1.0mL于25mL容量瓶，加入顯色劑，定容搖勻靜置后在最大吸收波長處測定吸光度,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算提取液濃度，從而計算枸杞黃酮的提取率。

1.3.5 單因素試驗

(1)提取溫度考察試驗。在提取液濃度為70%乙醇溶液 ,料液比為1∶25(g/mL)，提取時間為25min的條件下,依次在提取溫度為30、40、50、60、70℃下進行提取,考察不同的提取溫度對枸杞中黃酮提取率的影響。

(2)提取液濃度考察試驗。在提取溫度50℃，料液比1∶25(g/mL)，提取時間25min的條件下,依次在50%、60%、70%、80%、90%的乙醇濃度下進行提取, 考察不同提取液濃度對枸杞中黃酮提取率的影響。

(3)料液比考察試驗。在提取溫度50℃,提取液濃度為70%乙醇溶液,提取時間25min的條件下,依次在料液比為1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30下進行提取, 考察不同的提取料液比對枸杞中黃酮提取率的影響。(4)提取時間考察試驗。在提取溫度50℃,提取液濃度為70%乙醇溶液，料液比為1∶20(g/mL)的條件下,依次提取10、15、20、25、30min,考察不同提取時間對枸杞中黃酮提取率的影響。

1.3.6 正交實驗

由于各影響因素之間具有交互作用，因此在單因素試驗的基礎(chǔ)上,根據(jù)已有資料和實際情況,對影響枸杞中黃酮提取率的4個因素,每個因素設(shè)計3個水平,進行L9(34)正交試驗(見表1),以枸杞中黃酮的提取率為考察指標(biāo),選擇最佳的提取條件。

表1 正交試驗因素水平設(shè)計

2 結(jié)果與分析

2.1 最大波長的確定結(jié)果

由如圖1可知，標(biāo)準(zhǔn)溶液在502nm處有最大吸收，因此選擇502nm作為測定吸收波長。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

吸光度A對濃度C的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為:A=25.954C-0.0065，相關(guān)系數(shù)R2=0.9994。

2.3 單因素實驗

(1)提取溫度考察試驗結(jié)果

圖2 提取溫度對枸杞黃酮提取率的影響

圖2為提取液濃度70%的乙醇溶液，料液比1∶25(g/mL)、提取時間為25min的條件下，于不同提取溫度下得到的提取率。由圖可知,隨著提取溫度不斷增加,枸杞黃酮的提取率也在逐漸增加。當(dāng)提取溫度達(dá)到50℃時,提取率增加緩慢,故綜合提取率和能量消耗考慮，以提取溫度為50℃為宜。

(2)乙醇濃度考察試驗結(jié)果

圖3 乙醇濃度對枸杞黃酮提取率的影響

圖3為在提取溫度為50℃，料液比為1∶25(g/mL)，提取時間25min的條件下,于不同乙醇濃度下測得到的枸杞黃酮提取率。由圖可知,隨著乙醇濃度的增加，黃酮提取率先隨之增加，當(dāng)乙醇濃度為70%時,提取率最高；之后隨著乙醇濃度進一步增加,枸杞黃酮提取率隨之降低。這可能是因為乙醇濃度不同，提取液的極性不同,而黃酮類化合物具有較高的極性,根據(jù)相似相溶的原理,當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%時，對枸杞黃酮的溶解能力最強,因此選擇70%乙醇溶液作為提取溶液。

(3) 料液比考察試驗結(jié)果

圖4為在提取溫度50℃,提取液為70%乙醇溶液,提取時間25min的條件下,于不同料液比下測得到的枸杞黃酮提取率。由圖4可以知道,隨著料液比的增大,枸杞黃酮提取率也隨之增大。這可能是因為料液比增大,枸杞粉末與提取液的接觸面增大,而黃酮類化合物就更加容易滲透出來；當(dāng)料液比增大到一定程度后,由于枸杞中黃酮含量有限,提取率的增加則趨于平緩。同時,液料比越大,提取液的用量就會增加,導(dǎo)致提取成本增加。因此,確定選擇料液比為1∶20。

圖4 料液比對枸杞黃酮提取率的影響

(4)提取時間考察試驗結(jié)果

圖5為提取溫度50℃,提取液為70%乙醇溶液，料液比為1∶20(g/mL)的條件下,于不同提取時間測得到的提取率。由圖5可知,隨著提取時間不斷增加,枸杞黃酮提取率也在逐漸增大。當(dāng)提取時間達(dá)到20min時,隨著時間的延長,提取率上升平緩,故綜合提取率和能量消耗考慮，提取時間以20min為宜。

圖5 提取時間對枸杞黃酮提取率的影響

2.4 正交試驗及結(jié)果分析

由表2正交試驗結(jié)果可以看出,各影響因素對枸杞黃酮提取率影響的先后順序為:提取溫度(A)>料液比(C) >乙醇濃度(B) >提取時間(D)。比較各因素的極差R值可以看出，提取溫度(A)和料液比(C)的極差較大，說明這兩個因素對枸杞黃酮提取率影響較為顯著；而乙醇濃度(B) 和提取時間(D)的極差較小，說明這兩個因素對枸杞黃酮提取率的影響較小。通過以上分析可以確定超聲-微波協(xié)同萃取的最佳提取條件為A2B1C2D2,即提取溫度50℃,料液比1∶20,提取液為60%乙醇溶液，提取時間20min。

表2 L9(34 )正交試驗結(jié)果

2.5 驗證試驗

將篩選得到的最佳提取條件A2B1C2D2，即提取溫度50℃, 提取液為60%乙醇溶液，料液比1∶20,提取時間20min,在此條件下重復(fù)實驗3次,計算枸杞黃酮提取率。經(jīng)試驗驗證(見表3),最佳提取條件下測得的三組枸杞黃酮平均提取率為1.98%，RSD為0.35%，重現(xiàn)性較好,本工藝條件合理。

表3 最佳工藝的驗證結(jié)果

2.6 方法對比

將超聲-微波協(xié)同萃取法與乙醇回流法[4]、超聲波法[5]以及微波法[6]測得的枸杞黃酮提取率進行比較，結(jié)果見表4。由表可知,超聲-微波協(xié)同萃取法與乙醇回流法和超聲波法相比,提取時間縮短,提取率增加；與微波法相比，提取時間雖有少量增加，但提取率增加明顯。由此可見,超聲-微波協(xié)同萃取法是一種工藝簡便、提取成本低、節(jié)約能源、提取率高的技術(shù)，可廣泛應(yīng)用于天然有效成分的提取。

表4 不同提取方法對枸杞黃酮提取率的影響

3 結(jié)論

(1)通過單因素試驗和正交試驗結(jié)果,確定了超聲-微波協(xié)同萃取枸杞黃酮的最佳工藝條件為:提取溫度50℃, 料液比為1∶20(g/mL),提取液為60%乙醇溶液,提取時間為20min,在此條件下枸杞黃酮提取率可達(dá)1.98%。

(2)超聲-微波協(xié)同萃取法與乙醇回流法、超聲波法和微波法相比提取時間短，能耗低，枸杞黃酮提取率大。該法簡單快速、高效無污染,對枸杞的開發(fā)利用具有重要意義。

綜上所述，超聲-微波協(xié)同萃取枸杞黃酮是一種高效的提取技術(shù)，提取工藝操作簡便，提取成本較低，節(jié)約能源，可以廣泛應(yīng)用于天然有效成分的提取，前景廣闊。