王鏡雅，朱彬彬，周維維，王嘉磊，任 凱，應 明

(天津理工大學 化學化工學院，天津 300384)

隨著我國工業(yè)的快速發(fā)展，其生產排出的廢氣量逐年增加，近年來造成了我國大氣嚴重污染。尤其是冶金行業(yè)產生的廢氣，其主要成分為，CO(23%)、CO2(20%)、H2(2%)、N2(50%)、CH2(2%)、O2(0.4%)等。天然耗氫產乙酸菌具有特殊的厭氧乙酰-CoA途徑[1-2]，其機理如圖1所示，它可以利用氫解酶將H2轉化為[H+]產生電子，再把2分子的CO2還原成乙酸的甲基和羧基[3]。在反應中，CO2和H2先被還原成CHO-THF，然后轉化為CH2-THF，再轉化為CH3-B12；在整個厭氧乙酰-CoA途徑中，起關鍵作用的酶是一氧化碳脫氫酶(Ni-CODH)，它可以把CO2催化還原成CO，形成CO與該酶的復合物CO- Ni-CODH，然后與CH3-B12形成CH3-CO- Ni-CODH，再進一步轉化為乙酰CoA后，繼而生成乙酸[4]。

本課題組從蘭州市皋蘭縣污水處理廠活性污泥中篩選得到了一株耗氫產乙酸菌WJL142，在5L磁力攪拌發(fā)酵罐中將CO2/H2轉化為乙酸。實驗中設計了CO2/H2發(fā)生裝置，確定了工業(yè)廢氣最佳模擬方案。在以2g/L的酵母粉為氮源，H2和CO2通氣量分別為5mL/min和10mL/min，發(fā)酵培養(yǎng)溫度為37℃[6]，且將種子液以37℃培養(yǎng)8h后按照10%的比例接入到5L發(fā)酵罐的條件下，將耗氫產乙酸菌發(fā)酵培養(yǎng)24h后，最終得到乙酸最大量為41.6 mM[7]。

圖1 厭氧乙酰-CoA途徑

1 實驗材料和方法

本實驗發(fā)酵菌種為耗氫產乙酸菌WJL142，從蘭州市皋蘭縣污水處理廠二級沉淀池的污泥中篩選得到[8]。

1.1 5L 磁力攪拌發(fā)酵罐氣體發(fā)酵實驗裝置

本實驗采用5 L磁力攪拌發(fā)酵罐(型號HVE-50，上海保興生物科技公司)，進行氣體發(fā)酵產乙酸實驗，其容積為5L，玻璃管體，工作壓力<0.1MP。該發(fā)酵罐具有溫度、轉速、空氣流量、pH、DO、補料、消泡顯示及控制功能，并且還配有空氣過濾器及機械消泡漿。本實驗中發(fā)酵罐初始溫度設置為37℃，轉速設置為100r/min，滅菌方式為高溫蒸汽滅菌鍋滅菌(121℃，30min)。發(fā)酵裝置如圖2所示。

1.2 發(fā)酵種子液的制備

首先配備500mL種子培養(yǎng)基，種子培養(yǎng)基的配方為：CHNaO2·2H2O 3.25 g/L， KH2PO40.25 g/L，K2HPO40.25g/L， MgCl2·H2O 0.3 g/L， FeCl30.25 g/L，NiSO40.016 g/L，ZnCl20.0116 g/L，CoCl·6H2O 0.0102 g/L，CuCl2·2H2O 0.005 g/L，MnCl2·4H2O 0.015 g/L[5]。配好后用0.25M的NaOH溶液調整pH值為7，加入錐形瓶中，然后用帶有玻璃管的橡膠塞塞住瓶口，再將玻璃管用錫箔紙進行密封，將其放入滅菌鍋中，在121℃溫度下滅菌20min。滅菌完成待冷卻至常溫后，將其放入無菌處理后的超凈工作臺中。取出活化的耗氫產乙酸菌WJL142平板，吸取200μL無菌水沖刷平板上的菌落，將菌液接入滅菌冷卻后的錐形瓶培養(yǎng)液中，反復進行3～5次。再將錐形瓶用橡膠塞密封，從被錫箔紙密封的玻璃管口處插入滅菌處理過的長針頭。輕輕來回搖晃錐形瓶，使接入的菌液和種子培養(yǎng)基充分混合，再放入如圖2所示的通氣搖床中，37 ℃恒溫，持續(xù)通入CO2/H2，靜止培養(yǎng)一定時間即得到發(fā)酵種子液。

1.3 5L發(fā)酵罐氣體發(fā)酵實驗方法

首先配制發(fā)酵培養(yǎng)基4L，發(fā)酵培養(yǎng)基即在種子培養(yǎng)基中加入4g/L二溴乙烷磺酸鈉(BES)，用以抑制甲烷的生成。將發(fā)酵培養(yǎng)基裝入清洗后的發(fā)酵罐后，采用pH值為4.0和6.18兩種標準溶液進行pH電極校正。用錫箔紙將濾菌膜、pH電極接頭以及各管路開口處密封，在尾氣排放口處，連接一個漏斗，用紗布和報紙將其包裹，將發(fā)酵罐放入滅菌鍋中，除尾氣排放口及平衡管外，其余管路全部密封，在121℃下，滅菌20min。

滅菌結束，待發(fā)酵罐冷卻后，轉移至發(fā)酵工作臺，連接冷卻水管路、尾氣冷凝管路、溫度計、pH電極。打開通氣管路及冷卻水。打開發(fā)酵罐主控制臺，設置各發(fā)酵參數如發(fā)酵溫度37℃、轉速100r/min等。待發(fā)酵罐各參數到達預期發(fā)酵參數后，開始接種，在接種環(huán)火焰保護下，快速將種子液接入發(fā)酵罐，擰緊接種口，移去接種環(huán)。發(fā)酵過程中，約每兩個小時取一次樣。取樣時，將取樣管打開，并夾住尾氣排放管和平衡管，用10mL無菌離心管接取發(fā)酵液。

1.4 乙酸檢測方法

本實驗采用高效液相色譜(L-2400 UV Detector，Hitachi)進行乙酸檢測。選用XAqua C18色譜柱(5μm，250 mm×4.6 mm)，流動相為0.2 %(V/V)磷酸和乙腈混合溶液(體積之比為96.5∶3.5)，流速為1 mL/min，紫外檢測波長為214 nm，乙酸的保留時間為4.222 min[6]，工作曲線方程為y=10-4x+0.0853(y：乙酸摩爾濃度，x：乙酸峰面積)，相關系數R2=0.9912。發(fā)酵樣品6000r/min離心10min，取3.5mL上清液，用0.45μm濾菌膜過濾后待用。

2 實驗結果與討論

2.1 氮源對耗氫產乙酸菌WJL142發(fā)酵產酸的影響

氮是構成細胞中核酸和蛋白質的主要元素之一，細菌細胞中氮占12%～15%，是微生物生長代謝過程中不可缺少的營養(yǎng)物質。采用耗氫產乙酸菌進行氣體發(fā)酵，CO2是唯一碳源，所以適當添加有機氮源能夠促進細胞生長，提高產酸量[7]。本實驗選用酵母粉作為WJL142氣體發(fā)酵的氮源。進行了5批次的梯度發(fā)酵實驗，酵母粉加入量分別為1g/L、2g/L、4g/L、6g/L、10g/L，發(fā)酵溫度37℃，將H2/CO2以4mL/min、8mL/min的速率通入培養(yǎng)基，發(fā)酵24h后取樣，用HPLC檢測發(fā)酵液中的乙酸含量，最終實驗結果如圖4所示。實驗結果表明，當酵母粉加入量為2g/L時，乙酸產量相對較高，約為32.38mM。在以后的單因素實驗中，發(fā)酵培養(yǎng)基中均加入2g/L的酵母粉。

2.2 發(fā)酵溫度對耗氫產乙酸菌WJL142產酸的影響

生長溫度是影響細胞生長的重要因素，適宜的培養(yǎng)溫度能提高代謝過程中酶的催化效率[6]。本研究選取了40℃和37℃兩種溫度，培養(yǎng)種子液和發(fā)酵液，進行了四次不同溫度組合的發(fā)酵實驗。發(fā)酵過程中均采用4ml/min、8ml/min的速率通入H2/CO2，培養(yǎng)基中添加2g/L的酵母粉，發(fā)酵24小時后，測定乙酸含量。實驗結果如圖5所示，最終實驗結果表明，當種子液和發(fā)酵培養(yǎng)溫度都為37℃時，耗氫產乙酸菌生長產酸效果最好，產酸量達到38.21mM。

2.3 CO2/H2通氣量對耗氫產乙酸菌WJL142產酸的影響

本實驗的研究目的是以CO2/H2為底物，利用耗氫產乙酸菌的厭氧-CoA代謝途徑轉化為乙酸，所以CO2是發(fā)酵過程中的唯一碳源，CO2/H2的通入量直接影響最終的乙酸含量。在實驗過程中，分別采用CO2/H2通氣量為3mL/min和6mL/min；4mL/min和8mL/min；5mL/min和10mL/min；6mL/min和12mL/min；7.5mL/min和15mL/min。在發(fā)酵溫度為37℃，以2g/L酵母粉為氮源的條件下發(fā)酵培養(yǎng)24小時。利用高效液相色譜檢測發(fā)酵液中的乙酸含量，通過圖6分析處理對比可知，當H2和CO2通氣量分別為5mL/min和10mL/min時，耗氫產乙酸菌發(fā)酵產酸含量相對較高約為38.47mM左右。

2.4 接種方式對耗氫產乙酸菌WJL142產酸的影響

2.4.2 種子液成熟度的影響

本實驗的目的是為了研究種子液培養(yǎng)時間對WJL142發(fā)酵產酸的影響，先后進行了5組實驗，種子液培養(yǎng)時間分別為6h、8h、10h、12h、24h。發(fā)酵過程中在預定時間內取樣檢測，圖8為采用不同成熟度的種子液進行發(fā)酵產生的乙酸變化曲線，很明顯，種子液培養(yǎng)8h后接入發(fā)酵罐乙酸菌增殖代謝最佳，能夠產生31.7mM的乙酸。

◆： 6h ■：8h ▲：12h ●：24h

2.4.1 接種量的影響

微生物接種量的多少直接會影響最終產物的生成。為研究接種量對WJL142產酸的影響，將培養(yǎng)8h的種子液，分別按照7%、10%、12%、14%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基，按照預定時間進行取樣，檢測樣品中的乙酸含量。最終結果如圖7所示，當接種量為10%，即種子液和發(fā)酵培養(yǎng)基比例為1∶10的條件下，乙酸菌WJL142的發(fā)酵代謝產酸情況最好，發(fā)酵45h乙產酸量達到40.9mM。

◆ 7% ■10% ●12% ▲14%

2.5 最優(yōu)條件下耗氫產乙酸菌WJL142產酸情況

通過以上實驗，了解了各影響因素對WJL142發(fā)酵代謝產酸的影響，為驗證在最優(yōu)條件下耗氫產乙酸菌WJL142發(fā)酵產酸情況，先后進行了3組實驗。首先在發(fā)酵罐中添加2g/L的酵母粉，然后將37℃培養(yǎng)8h后的種子液，按照10%的比例接入到發(fā)酵罐中，發(fā)酵溫度同樣設置為37℃，分別以5mL/min和10mL/min通入H2和CO2，按照預定的時間進行取樣，并對樣品進行預處理后，檢測其中的乙酸含量。發(fā)酵液pH值變化如圖9，最終的pH值降至4左右，整個發(fā)酵過程中的產酸量變化如圖10所示，從圖中可以看出，在最優(yōu)條件下發(fā)酵24h后，WJL142乙酸產量可以達到41.6mM。

圖9發(fā)酵液pH值變化曲線

圖10 WJL142發(fā)酵乙酸含量變化曲線

3 結論

本研究在活性污泥中發(fā)現了一種耗氫產乙酸菌WJL142，它具有特殊的厭氧乙酰-CoA代謝途徑，能將H2和CO2轉化為乙酸。實驗采用5L磁力攪拌發(fā)酵罐進行模擬廢氣發(fā)酵實驗，實驗中探究了影響耗氫產乙酸菌WJL142產乙酸的多種因素，包括：氮源、發(fā)酵溫度、CO2/ H2通氣量和接種方式。實驗結果表明，耗氫產乙酸菌WJL142最佳發(fā)酵條件是，以2g/L的酵母粉為氮源，種子液培養(yǎng)要培養(yǎng)8h，培養(yǎng)溫度為37℃，并按照10%的比例接入到發(fā)酵罐中，發(fā)酵溫度同樣設置為37℃， H2和CO2分別以5mL/min和10mL/min通入發(fā)酵罐中，發(fā)酵24h后，乙酸產量能達到41.6mM。