高茜，管瑩，米其利，黃海濤，楊繼，徐玉瓊，簡小朋，夭建華

1 云南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司，云南 昆明 650106；

2 上海新型煙草制品研究院有限公司，上海 200082

近年來，我國人民的口腔健康狀況發(fā)生了明顯的改變，相關(guān)疾病患病率向青中年偏移，其中變形鏈球菌和牙齦卟啉單胞菌是齲病和牙周病變的主要致病菌[1-4]。煙氣顆粒物能夠改變口腔內(nèi)微環(huán)境，對口腔內(nèi)定居微生物會產(chǎn)生影響。

口含煙是新型煙草制品，不產(chǎn)生煙氣，又能滿足攝入尼古丁的需求，是傳統(tǒng)卷煙的一種重要補(bǔ)充形式[5]?？诤瑹煴粓蟮琅c口腔白斑病變、口腔癌等疾病有關(guān)[6]，其生物學(xué)活性和安全性受到極大關(guān)注。然而，國內(nèi)外目前在口含煙對于口腔微生物菌群的影響尚無定論[7-9]，本文采用體外細(xì)菌培養(yǎng)及口腔唾液檢測兩種方法，選用了3種不同吸食方式的口含煙，對口腔總細(xì)菌、變形鏈球菌及牙齦卟啉單胞菌的影響進(jìn)行研究，并與傳統(tǒng)卷煙煙氣相比較。

1 材料與方法

1.1 研究樣品

General牌袋裝口含煙（White Mini口味，每袋重量約0.8 g，煙堿含量0.8%，G-M），Nicorette膠基口含煙（原味，每顆重量約1.2 g，煙堿含量2 mg，N-2），云南中煙開發(fā)含片型口含煙（酸角味，每顆重量約0.6 g，煙堿含量0.5 mg，S-0.5），玉溪牌卷煙（硬，焦油量11 mg，YX）。

1.2 研究對象

國際標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC25175（變形鏈球菌）和GIM1.387(牙齦卟啉單胞菌)購自廣東微生物菌種保藏中心。

隨機(jī)選擇志愿參加口腔試驗的志愿者，入選標(biāo)準(zhǔn)為：(1) 口腔健康，牙齒完整，咬合關(guān)系正常；(2) 無未經(jīng)治療的齲壞，齲失補(bǔ)牙面數(shù)不大于4，無正畸矯治器，無口腔軟組織疾病，無牙髓及根尖周病變；(3)無全身系統(tǒng)性疾病，無長期服藥史，未曾使用含氟牙膏及漱口水，實驗前2周和實驗期間未服用抗生素類藥物及影響唾液分泌的藥物。實驗前 2 h禁食、禁刷牙、漱口和吸煙。所有受試者均簽署知情同意書。

1.3 試劑和儀器

輕唾桿菌肽瓊脂培養(yǎng)基（Difco公司）；腦心浸液培養(yǎng)基、變形鏈球菌培養(yǎng)基（Oxoid公司）；凍干脫纖維羊血（研拓公司）；氯化鉀血紅素、維生素K1、亞碲酸鉀（卡邁舒公司）；L-半胱氨酸、桿菌肽（百靈威公司）；PBS磷酸緩沖液（GIBCO公司）；0.45 μm一次性過濾器（Millpore公司）；培養(yǎng)皿、離心管（Coning公司）。

參照文獻(xiàn)設(shè)計變形鏈球菌引物及探針[10]、細(xì)菌通用引物及探針[10]、牙齦卟啉單胞菌引物及探針[11]（Invitrogen公司）；實時熒光定量PCR試劑盒（KAPA? Probe公司），微生物裂解液（Takara公司）；熒光定量PCR 96孔板、熒光定量PCR96孔板膜（Biotipsci公司）；無水乙醇（西隴化工公司）。

二級生物安全柜（HFsafe-1500）；高壓蒸汽滅菌鍋（ALP CL-40M）；厭氧培養(yǎng)箱（BACTRON 1-2）；電子天平（梅特勒XS204）。

1.4 實驗方法

1.4.1 煙草制品的前處理

袋裝型口含煙：取袋裝口含煙制品1袋，去掉包裝后加入10 mL pH7.2的磷酸緩沖液于37 ℃下恒溫震蕩24 h（150 rpm）進(jìn)行萃取，然后8000轉(zhuǎn)離心10 min，取上請液在生物安全柜中用0.45 μm一次性過濾器過濾除菌，將待測液用無菌凍存管分裝在1 mL無菌管中凍存，測定煙堿含量后-20 ℃保存待用。

膠基型口含煙：取膠基型口含煙1粒，用剪刀剪成2 mm3小塊后加入研缽中，量取10 mL pH7.2的磷酸緩沖液，加入4～5 mL在研缽中，加熱至37 ℃浸泡30 min，再研磨10 min，將溶液移入15 mL離心管中，將剩下溶液倒入研缽中繼續(xù)研磨10 min，然后移入離心管中，用0.45 μm一次性過濾器過濾后，分裝在1 mL無菌離心管中，測定煙堿含量后-20 ℃保存待用。

含片型口含煙：取含片型口含煙1粒，放入15 mL離心管中，加入10 mL pH7.2的磷酸緩沖液，室溫放置1 h，待完全溶解后，在生物安全柜中用0.45 μm一次性過濾器過濾后，分裝在1 mL無菌離心管中，測定煙堿含量后-20 ℃保存待用。

傳統(tǒng)卷煙：參照YQ 2—2011《煙草及煙草制品煙氣安全性生物學(xué)評價 第1部分：中性紅細(xì)胞毒性法》附錄A標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行煙氣捕集[12]。將卷煙在恒溫恒濕箱中平衡48 h，選取重量和吸阻一致的煙支。按上述標(biāo)準(zhǔn)方法，分別在全自動轉(zhuǎn)盤式吸煙機(jī)上抽吸20支卷煙，用劍橋濾片捕集器中劍橋濾片捕集煙氣的總粒相物。劍橋濾片用二甲基亞砜（DMSO）浸泡，超聲波提取20 min，最后定容至 10 mg TPM/mL DMSO[12]，采用液相色譜法測定TPM中的煙堿含量[13]，-80 ℃低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 體外細(xì)菌培養(yǎng)實驗

取凍干粉狀貯存的國際標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC25175（變形鏈球菌）和GIM1.387(牙齦卟啉單胞菌)，常規(guī)方法接種于100 μL無菌生理鹽水中活化3 h，將復(fù)蘇的菌種分別涂布于變形鏈球菌和牙齦卟啉單胞菌固體培養(yǎng)基上，37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h。挑取牙齦卟啉單胞菌和變形鏈球菌單個菌落混懸于無菌水中，稀釋至OD600 在0.6-0.8之間，備用。

將上述凍存的煙草制品提取液取出，室溫解凍，使用磷酸鹽緩沖液將樣品稀釋至50 μg/mL、25 μg/mL、12.5 μg/mL 3個濃度。按1∶1的比例將待測樣品與細(xì)菌混合，每個濃度總量1 mL, 厭氧條件下37 ℃共培養(yǎng)6 h，然后取50 μL涂在對應(yīng)的培養(yǎng)板上，放置于厭氧培養(yǎng)箱內(nèi)37 ℃培養(yǎng)48 h，進(jìn)行計數(shù)。

1.4.3 志愿者口腔內(nèi)細(xì)菌檢測

1.4.3.1 唾液樣本采集

受試者唾液采集時間集中安排在每周二上午9∶00～11∶00，采集唾液在安靜的房間里進(jìn)行，受試者采用坐位，實驗前2 h禁食、禁刷牙、漱口和吸煙。

參考文獻(xiàn)報道方法進(jìn)行唾液采集[14]，靜態(tài)唾液進(jìn)行2次時間段的采集，以吸食口含煙的時間點為0點，靜態(tài)唾液的采集時間段為-5～0、90～95 min。動態(tài)唾液進(jìn)行4次時間段的采集，采集唾液的時間段為 0～2、2～5、5～10、10～15 min，持續(xù)使用時間共 15 min。在動態(tài)唾液收集完后受試者可正常走動，但禁刷牙、漱口和吸煙。所采集的唾液放于-20 ℃冰箱凍藏保存。經(jīng)一周間隔期做重復(fù)性試驗，共重復(fù)3次，收集方法一致。

1.4.3.2 唾液樣本DNA提取

取各個志愿者的唾液0.5 mL置于無菌1.5 mL EP管中，將EP管中唾液進(jìn)行4 ℃離心10 min（12000 r/min），去除上清液，再加入50 μL微生物PCR專用裂解緩沖液于EP管中，混合均勻，然后置于80℃水浴鍋中熱變性15 min，低速離心1 min（1000 r/min），最后取上清液與無菌水按1∶8比例稀釋后作為熒光定量PCR的模板。

1.4.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制及實時熒光定量PCR檢測

采用國際標(biāo)準(zhǔn)菌株提取DNA作為陽性標(biāo)準(zhǔn)品，總細(xì)菌標(biāo)準(zhǔn)品使用的是多種口腔細(xì)菌標(biāo)準(zhǔn)株DNA混合液（牙齦卟啉單胞菌、變形鏈球菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等）。測定陽性標(biāo)準(zhǔn)品的原始 DNA稀釋液在波長260 nm、280 nm的光密度值 ( optical density，OD)，OD260與 OD 280比值大于 1.8，表明純度合格。用OD260測定值和片段長度數(shù)據(jù)換算出陽性標(biāo)準(zhǔn)品原始DNA稀釋液的濃度（細(xì)菌數(shù)／μL）。陽性標(biāo)準(zhǔn)品梯度制備：取陽性標(biāo)準(zhǔn)品的原始DNA稀釋液 5 μL加水45 μL并充分混勻 10倍稀釋后，再根據(jù)實驗需要依次10倍稀釋，建立定量標(biāo)準(zhǔn)曲線。陰性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品采用滅菌雙蒸水。

反應(yīng)體系（20 μL）：2×SYBR mix 10 μL、上下游引物（序列見表1）各200 nmol/L、探針250 nmol/L、無菌水1.475 μL、模板（上清液）8 μL且混合均勻。反應(yīng)條件為：預(yù)變性95 ℃ 5 min，變性95 ℃ 15 s，退火／延伸 60 ℃ 1 min， 進(jìn)行45個循環(huán)。每個樣本檢測均重復(fù)3次，取其平均值。每次反應(yīng)均設(shè)空白對照和標(biāo)準(zhǔn)品陽性對照。

表1 熒光定量PCR所用的引物及探針Tab.1 Fluorescent quantitative PCR primers and probes

1.4.4 統(tǒng)計學(xué)分析

實驗結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，使用PrismGraphPad 6.0軟件進(jìn)行繪圖及統(tǒng)計學(xué)分析。多組間比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 不同類型的口含煙對體外細(xì)菌的影響

表2為3種口含煙提取液及傳統(tǒng)卷煙TPM對2種體外培養(yǎng)細(xì)菌生長的影響結(jié)果?？梢钥闯?，TPM對2種細(xì)菌均有明顯抑制作用，而3種口含煙提取液中，除G-W在高濃度時對牙齦卟啉單胞菌的抑制作用明顯外，其他均無顯著影響。

2.2 不同類型口含煙對唾液中細(xì)菌總量的影響

圖1A為唾液總細(xì)菌的熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線，圖1B為吸食口含煙及傳統(tǒng)卷煙后唾液中細(xì)菌量的動態(tài)變化。由圖1B可見，唾液中總細(xì)菌數(shù)目在吸食袋裝型、含片型口含煙及傳統(tǒng)卷煙后2 min內(nèi)降低明顯，在吸食的2-15 min逐步上升回復(fù)，在吸食結(jié)束休息1h之后已經(jīng)回復(fù)至吸食前水平；而在吸食膠基型口含煙后顯著增高，在2-5 min時間段達(dá)到高峰，隨后的5-15 min逐漸下降，在停止吸食后逐步恢復(fù)至吸食前水平。

圖2A為變形鏈球菌的熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線，圖2B為吸食口含煙及傳統(tǒng)卷煙后唾液中變形鏈球菌數(shù)量的動態(tài)變化。由圖2B可見，變形鏈球菌數(shù)量在吸食膠基型口含煙后明顯升高，在整個咀嚼過程（0-15 min）中變形鏈球菌的含量都遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于吸食前水平，直到休息1 h之后才逐漸回復(fù)；吸食含片型口含煙和傳統(tǒng)卷煙的2 min內(nèi)唾液中變形鏈球菌含量稍有降低，但在吸食10 min后均回復(fù)到吸食前水平；吸食袋裝型口含煙在吸食2 min內(nèi)稍有升高，隨后也在吸食10 min后回復(fù)到吸食前水平。

表2 口含煙和傳統(tǒng)卷煙TPM的體外抑菌試驗Tab.2 In vitro anti-bacterial test of SLT and traditional cigarette TPM

圖1 吸食煙草制品前后人唾液中細(xì)菌總量的動態(tài)變化Fig.1 Dynamic changes of total bacteria in human saliva before and after taking tobacco products

圖2 吸食煙草制品前后人唾液中變形鏈球菌數(shù)的動態(tài)變化Fig.2 Dynamic changes of Streptococcus mutans in human saliva before and after taking tobacco products

圖3 A為牙齦卟啉單胞菌的熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線，圖3B為吸食口含煙及傳統(tǒng)卷煙后唾液中牙齦卟啉單胞菌數(shù)量的動態(tài)變化。由圖3B可見，牙齦卟啉單胞菌數(shù)在吸食袋裝型和膠基型口含煙后都明顯升高，且一直持續(xù)到吸食5 min后才開始回復(fù)，吸食15 min后仍稍高于吸食前水平，一直到吸食后休息1 h才回復(fù)到吸食前水平；吸食含片型口含煙和傳統(tǒng)卷煙的2 min內(nèi)唾液中牙齦卟啉單胞菌數(shù)含量都稍有降低，在2-15 min時段均有所波動，但一致的是在吸食休息1 h后均回復(fù)到吸食前水平。

圖3 吸食煙草制品前后人唾液中牙齦卟啉單胞菌數(shù)的動態(tài)變化Fig.3 Dynamic changes of Porphyromonas gingivalis in human saliva before and after taking tobacco products

3 討論

吸煙被認(rèn)為是很多系統(tǒng)疾病的患病風(fēng)險因素，可能引起牙周炎、白斑等多種口腔疾病，因此，煙草與口腔健康越來越受到關(guān)注[15]?？谇桓缓瑺I養(yǎng)，受到諸多微生物群的影響，吸煙與口腔微生物的研究報道也越來越多，對于口含煙的相關(guān)研究較為少見，且研究結(jié)果不盡一致，其原因可能是煙草類型和微生物種群不同[16-18]。本研究從體內(nèi)和體外兩個方面研究了3種不同類型口含煙對人口腔總細(xì)菌及致病微生物的影響。由于不同類型的口含煙吸食方式差異較大，比如袋裝型采用上唇和牙齦之間含用，膠基型采用咀嚼方式，含片型直接采用舌上含服，因此這三類產(chǎn)品的前處理方式大有不同。但是無論哪種類型的制品，最重要的目的都是通過煙堿來讓消費者達(dá)到滿足感，煙堿含量是衡量不同類型制品間的有效橋梁，因此本文設(shè)置了在同樣煙堿濃度下測試不同提取物抑菌的效果。

本研究所涉及的兩種細(xì)菌與口腔疾病的關(guān)系比較明確。其中患齲情況和唾液變形鏈球菌數(shù)量具有明顯相關(guān)性。研究人員發(fā)現(xiàn)唾液中有齲和無齲組中變形鏈球菌水平具有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異，而吸煙人群患齲率較非吸煙人群明顯降低[19]。Tandon等人的研究顯示無煙氣煙草具有微弱的變形鏈球菌的抗性，而傳統(tǒng)煙草抑制效果更為顯著[20]。本研究結(jié)果與其基本一致，但略有不同的是在吸食袋裝型和膠基型口含煙時，唾液中的變形鏈球菌含量有所增高。變形鏈球菌在口腔中的存在方式是吸附在牙齒上，形成所謂的“生物膜”，袋裝型口含煙的吸食方式為貼附于牙齦和嘴唇之間，膠基型為咀嚼運(yùn)動，這兩種動作都有可能引起變形鏈球菌的脫落而導(dǎo)致唾液中含量升高。在吸食以上四種煙草制品一段時間之后，唾液中的變形鏈球菌含量回復(fù)至吸食前水平，這與細(xì)菌總量的結(jié)果是一致的。此外，Keen和Johnson報道了無煙氣煙草吸食者唾液中尼古丁含量對變形鏈球菌具有劑量依賴的促進(jìn)作用，可能會讓吸食者面臨齲齒風(fēng)險[21]。但眾所周知，一些無煙煙草含有甜味劑，其可能是增加變形鏈球菌體外生長的因素。

牙齦卟啉單胞菌是牙周炎的主要致病菌，即使是少量的牙齦卟啉單胞菌也能造成嚴(yán)重的牙周炎。已有的研究顯示，吸煙者牙齦卟啉單胞菌的感染率高于非吸煙者，但二者差異無顯著意義[22]。而Eggert等的研究發(fā)現(xiàn)吸煙者齦下菌斑中總細(xì)菌數(shù)增加，其中牙齦卟啉單胞菌的檢出率明顯高于非吸煙者[23]。另一些研究認(rèn)為吸煙者與非吸煙者齦下牙周致病菌無差異[24]。我們在體外的檢測發(fā)現(xiàn)：袋裝型產(chǎn)品G-W和傳統(tǒng)卷煙TPM可抑制該種細(xì)菌的數(shù)量。之前Sintija等研究顯示無煙氣煙草（snuffs）與吸煙人群口腔內(nèi)高水平的牙齦卟啉單胞菌相關(guān)[25]。但我們的研究結(jié)果顯示口含煙雖然在吸食時對唾液中牙齦卟啉單胞菌數(shù)量有所影響，但1h后均回復(fù)到吸食前水平，這說明短期吸食口含煙并不會對口腔內(nèi)的牙齦卟啉單胞菌造成不可逆轉(zhuǎn)的影響。

此外，不同類型的煙草制品由于吸食方式不同，對口腔微生物造成的影響也是有所差異。Liu等發(fā)現(xiàn)snuffs具有劑量依賴的抑菌性，而snus無抑制效果[15]。本文雖然在體外檢測時幾種口含煙均對口腔疾病相關(guān)微生物影響不大，但在體內(nèi)吸食過程中，口腔唾液的微生物含量還是有所波動，這種波動可能來自于產(chǎn)品在吸食過程中對口腔的直接物理作用，如膠基型煙草制品由于其具有粘附特性，因此可能會粘附一些牙齒及牙齦上的細(xì)菌，并隨著膠基型制品的吐出而清除。這也提示我們可以在口含煙的研發(fā)過程中主動添加一些針對性的抑菌物質(zhì)從而達(dá)到抑制致病微生物生長的作用。

4 結(jié)論

體外實驗顯示口含煙提取物對于體外變形鏈球菌無顯著性影響，對于牙齦卟啉單胞菌僅有袋裝型口含煙具有不同程度的抑制作用，而傳統(tǒng)卷煙TPM對這兩種細(xì)菌都有一定的抑制作用。

對志愿者的研究表明，吸食傳統(tǒng)卷煙和含片型口含煙時，唾液總細(xì)菌數(shù)、變形鏈球菌和牙齦卟啉單胞菌數(shù)變化趨勢基本一致，即開始時較少，隨后逐步恢復(fù)至吸食前水平；吸食膠基型口含煙時，唾液總細(xì)菌數(shù)、變形鏈球菌和牙齦卟啉單胞菌數(shù)都是先升高再逐漸回復(fù)到吸食前水平；吸食袋裝口含煙時，唾液總細(xì)菌數(shù)是先下降再回復(fù)，而變形鏈球菌和牙齦卟啉單胞菌數(shù)則是先稍有上升再逐漸回復(fù)到吸食前水平。