李書平, 韓 慧, 胥紅斌

(江蘇省常州市第二人民醫(yī)院 產(chǎn)科, 江蘇 常州, 213164)

眾所周知，缺血再灌注損傷是組織在缺血后又恢復(fù)供血，由氧自由基攻擊相應(yīng)組織細胞等多種機制引起的更為嚴重的損傷。自1977年, Hearse首次提出這一概念后，對其的研究主要集中在心、腦、肝、腎等臟器，對子宮內(nèi)膜細胞的研究還十分不足。子宮內(nèi)膜細胞缺血再灌注損傷在臨床實踐中屢見不鮮，越來越受到科研工作者和臨床醫(yī)生的重視。本研究從抑制線粒體程序性壞死通路出發(fā)，探討缺血再灌注損傷在子宮內(nèi)膜細胞中的潛在防治可能和理論基礎(chǔ)，現(xiàn)綜述如下。

1 缺血再灌注損傷的定義

缺血所引起的組織損傷是疾病致死的主要原因之一。缺血再灌注損傷是指組織器官經(jīng)過一定時間缺血再恢復(fù)血液灌注后其代謝、功能和結(jié)構(gòu)的損傷反而加重，甚至出現(xiàn)不可逆損傷的現(xiàn)象。在缺血性疾病搶救和治療過程中，科學(xué)家們漸漸發(fā)現(xiàn)，對組織造成損傷的主要因素，不是缺血本身引起的，而是恢復(fù)血液供應(yīng)后，過量的自由基攻擊這部分重新獲得血液供應(yīng)的組織內(nèi)的細胞而造成的，這種損傷，稱為缺血再灌注損傷(I/R)[1]。

盡管血流恢復(fù)對于防止組織死亡是絕對必要的，但將氧合血液再灌注到缺氧區(qū)域這件事本身可能會增加組織損傷，且超過單獨局部缺血所產(chǎn)生的組織損傷[2]。在外科手術(shù)、器官移植、創(chuàng)傷性休克、燒傷、凍傷和血栓等血液循環(huán)障礙時，都會出現(xiàn)缺血后再灌注損傷，并且具有潛在的危害和致殘后果。

2 缺血再灌注損傷在婦產(chǎn)科的重要性

任何有創(chuàng)檢查、婦產(chǎn)科手術(shù)，都有可能發(fā)生子宮內(nèi)膜細胞缺血再灌注損傷，并進而影響子宮的生殖功能。婦產(chǎn)科手術(shù)中，缺血再灌注損傷更是造成子宮大出血、子宮壞死和敗血癥等嚴重并發(fā)癥的主要因素之一[3-9]。而臨床常用的子宮收縮藥，如縮宮素催產(chǎn)和引產(chǎn)及產(chǎn)后出血，均有可能造成子宮收縮止血或阻斷血管止血的同時，造成子宮缺血再灌注損傷[10-12]。由此可得，減少或防治子宮缺血再灌注損傷是婦產(chǎn)科臨床實踐中的重要一環(huán)。

目前對于缺血再灌注損傷的研究多集中在對心、腦血管、肝、腎等疾病的研究上，其對于生殖器官影響的研究較少[13-15]。子宮缺血再灌注損傷是臨床婦產(chǎn)科常見的一種病理生理變化，近年來研究表明細胞凋亡與組織器官缺血再灌注損傷有關(guān)。抗子宮內(nèi)膜細胞缺血再灌注損傷作用和機制的研究，尋找高效、靶向的藥物，是產(chǎn)科的前沿問題，更為臨床防治子宮內(nèi)膜細胞缺血再灌注損傷提供了潛在可能性和理論依據(jù)。

3 子宮內(nèi)膜細胞缺血再灌注損傷的作用機制

缺血再灌注損傷的發(fā)病機制比較復(fù)雜，其過程是多因素的，涉及多種機制。以往研究[16-21]認為與氧自由基的產(chǎn)生、能量代謝障礙、細胞內(nèi)鈣超載以及炎性細胞激活并釋放炎性細胞因子等因素有關(guān)。

缺血再灌注時，細胞線粒體ATP生成減少，伴隨呼吸鏈電子傳遞減弱，導(dǎo)致線粒體膜電位(MMP)下降和活性氧簇(ROS)大量生成，引起氧化應(yīng)激，觸發(fā)線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(mPTP)開放，誘導(dǎo)細胞色素C(CytoC)等線粒體蛋白釋放，最終導(dǎo)致細胞損傷[17, 22-26]。

mPTP由蛋白電壓依賴性陰離子通道(VDAC, 位于線粒體外膜)、腺苷酸轉(zhuǎn)位子-1 (ANT-1, 位于線粒體內(nèi)膜)及親環(huán)蛋白D(CyPD, 位于線粒體基質(zhì))組成[27-28]。線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔是在生理條件下封閉的非選擇性、大電導(dǎo)通道。mPTP的打開導(dǎo)致線粒體功能的消除，是缺血/再灌注導(dǎo)致的心肌細胞壞死的主要機制，并且可以通過使用藥理學(xué)或遺傳操作直接抑制mPTP開放限制了體內(nèi)梗死面積。

多個促生存信號通路通常靶向抑制mPTP開放。盡管mPTP的分子結(jié)構(gòu)尚未建立，但最近的研究[29]已經(jīng)表明了，每個mPTP亞基的作用和幾種與mPTP直接相互作用的蛋白質(zhì)的功能。Cell等[30-31]雜志發(fā)表的論文證實, P53在調(diào)節(jié)線粒體mPTP通道開放中起核心作用。mPTP的開放導(dǎo)致線粒體內(nèi)膜電位的喪失, ATP產(chǎn)生的破壞, ROS產(chǎn)生增加，細胞器腫脹，線粒體功能障礙以及隨之而來的壞死。

親環(huán)蛋白D以及腺嘌呤核苷酸轉(zhuǎn)運體和磷酸鹽載體被認為是參與mPTP開放的重要調(diào)節(jié)劑。ROS的產(chǎn)生增加可以進一步觸發(fā)其他通過PARP1等分子介導(dǎo)的壞死途徑，導(dǎo)致不可逆的細胞損傷[32]。多種應(yīng)激誘導(dǎo)P53磷酸化激活，后者轉(zhuǎn)位到線粒體并和CyPD耦聯(lián)，介導(dǎo)mPTP開放及細胞壞死[30, 33]。有趣的是，該通路并不介導(dǎo)細胞凋亡，因此該通路又被稱之為“程序性壞死通路”[30, 34-35]。

最新的研究[36-37]結(jié)果證實，該線粒體“程序性細胞壞死”通路同樣介導(dǎo)了氧糖剝奪后復(fù)氧(OGDR, 一種體外缺血再灌注模型)誘導(dǎo)的子宮內(nèi)膜細胞損傷。在人T-HESC子宮內(nèi)膜細胞中, OGDR誘導(dǎo)細胞程序性壞死，具體表現(xiàn)為: 線粒體內(nèi)CyPD-p53-ANT1耦聯(lián)，線粒體去極化，MMP下降，并伴隨著ROS生成，細胞色素C釋放及乳酸脫氫酶(LDH)胞外釋放。

4 親環(huán)蛋白D抑制劑靶向抑制線粒體程序性壞死

親環(huán)蛋白D抑制劑環(huán)孢菌素A(CsA)[38]及shRNA敲減親環(huán)蛋白D均能顯著抑制OGDR誘導(dǎo)的子宮內(nèi)膜細胞損傷[39]。與此同時，研究人員們還發(fā)現(xiàn)，中藥單體人參Rh2(GRh2)亦能顯著抑制該程序性細胞壞死通路而保護子宮內(nèi)膜細胞免受OGDR損傷。

目前已知的親環(huán)蛋白D抑制劑有環(huán)孢菌素A/CsA, Debio 025, SCY-635, NIM 811及新型小分子抑制劑Compound 19等，下面將分別介紹這些親環(huán)蛋白D抑制劑。

4.1 環(huán)孢菌素A

環(huán)孢菌素A(CsA)是一種從絲狀真菌(tolypocladium inflatum)培養(yǎng)液中分離出的由 11 個氨基酸組成的環(huán)肽。從 20 世紀 80 年代開始，環(huán)孢菌素A就作為免疫抑制劑用于臨床。它在器官移植治療中發(fā)揮了重大作用，奠定并推動了器官移植的發(fā)展。作為免疫抑制劑它還被應(yīng)用于一些自身免疫性疾病的治療，如對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎及白塞病(Behet′s disease, 貝赫切特綜合征)，取得了較為滿意的療效。對1型糖尿病、牛皮癬和寄生蟲病如瘧疾、血吸蟲等有一定療效。此外，環(huán)孢菌素 A 還具有廣泛的其他生物學(xué)活性，如抗真菌、抗寄生蟲、抗 HIV、抗炎、逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞多藥耐藥等作用。

近年來，科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)環(huán)孢菌素A在許多細胞和體內(nèi)模型中顯示出細胞保護性能，這可能取決于親環(huán)蛋白A與鈣調(diào)磷酸酶或親環(huán)蛋白D與線粒體通透性轉(zhuǎn)換(PT)孔的相互作用的干擾。這一通路與組織缺血再灌注損傷的通路不謀而合。故近年來環(huán)孢菌素A已被提出用于預(yù)防急性心肌梗死(MI)再灌注損傷的治療。根據(jù)一項Meta分析[40]發(fā)現(xiàn)，與安慰劑相比，環(huán)孢素對梗死面積有不同程度的影響，這為缺血再灌注損傷的防治提供了潛在的可能性。但是，由于其存在比較嚴重的肝毒性、腎毒性、神經(jīng)系統(tǒng)毒性、常見的厭食、惡心、嘔吐等胃腸道反應(yīng)以及溶解性差，治療指數(shù)窄，生物利用度低等缺點，影響了它在這些領(lǐng)域的進一步應(yīng)用。人們開始嘗試對其結(jié)構(gòu)進行改造，合成了一系列化合物，并從中尋找毒副作用低的免疫抑制劑，或雖然無免疫抑制活性，但毒性低，具有其他生物學(xué)活性的衍生物。

4.2 Debio025

不同于環(huán)孢菌素A, Debio 025是一種沒有免疫抑制活性的親環(huán)素抑制劑。它是一種合成的環(huán)孢菌素，雖不具有免疫抑制能力，但對親環(huán)蛋白A(CypA)相關(guān)的順式-反式脯氨酰異構(gòu)酶(PPIase)活性具有高抑制效力。在體外和體內(nèi)都證實了與環(huán)孢菌素相比缺乏免疫抑制作用[41]。它可與親環(huán)蛋白D形成二元復(fù)合物，使線粒體通透性毛細孔脫落，并隨后導(dǎo)致細胞壞死[42-43]。因此, Debio 025只是選擇性地與親環(huán)蛋白D結(jié)合，而沒有環(huán)孢菌素A那樣強烈的不良反應(yīng)。臨床試驗證實, Debio 025的安全性來源于總患者人數(shù)約1 800例，這支持了第三階段關(guān)鍵臨床試驗的啟動[44]。但Debio 025與親環(huán)蛋白D形成二元復(fù)合物，與環(huán)孢菌素A相比，二元復(fù)合物對鈣調(diào)磷酸酶的親和力顯著降低。因此，其治療效果也相應(yīng)不足。

4.3 SCY-635

SCY-635是一種新型非免疫抑制性環(huán)孢菌素類似物。SCY-635以納摩爾濃度抑制親環(huán)蛋白的肽基脯氨酰異構(gòu)酶活性，但在濃度高達2 μmol/L時未顯示出可檢測到的鈣調(diào)磷酸酶磷酸酶活性的抑制[45]。同Debio 025相似, SCY-635也沒有免疫制性，但與環(huán)孢菌素A相比, SCY-635與親環(huán)蛋白D形成二元復(fù)合物，二元復(fù)合物對鈣調(diào)磷酸酶的親和力顯著降低，在提高濃度的情況下，仍難以達到預(yù)期療效。

4.4 NIM811

NIM811是一種線粒體通透性轉(zhuǎn)換抑制劑，也被稱為N-甲基-4-異亮氨酸環(huán)孢菌素，它是一種結(jié)合親環(huán)蛋白的四取代的環(huán)孢菌素類似物，它與親環(huán)蛋白以高于環(huán)孢菌素的親和力結(jié)合，然而這種二元復(fù)合物不能結(jié)合鈣調(diào)磷酸酶，因此缺乏免疫抑制活性。也有研究[46]認為, NIM 811對凋亡的抑制作用與CsA相當，但在較高濃度下CsA失去效力，而NIM 811沒有。從而認為NIM 811可抑制線粒體通透性轉(zhuǎn)換，對其所引起的細胞凋亡和壞死細胞死亡有一定的作用。

然而, NIM 811和SCY-635的臨床試驗僅限于探索性的Ⅰ期和Ⅱ期臨床試驗，納入小型、相對明確的患者群體。因此，這些化合物的完整臨床安全性尚待確定。無論是環(huán)孢菌素A這一經(jīng)典的親環(huán)蛋白D抑制劑，還是Debio 025, SCY-635, NIM 811這些新型非免疫抑制性環(huán)孢菌素類似物，由于這些親環(huán)蛋白D抑制劑存在所需濃度高、特異性差、水溶性差、毒副作用大等原因，成藥性差，故臨床應(yīng)用前景并不樂觀[44, 47-48]。

4.5 Compound 19

為了進一步改進和研發(fā)親環(huán)蛋白D抑制劑, Shore等[49]根據(jù)親環(huán)蛋白D的分子機構(gòu)，研發(fā)了多種可能的親環(huán)蛋白D選擇性抑制劑，并鑒定Compound 19(化合物19, C19)為高效的、選擇性的親環(huán)蛋白D小分子抑制劑[50]?；衔?9介導(dǎo)的細胞保護需要與親環(huán)蛋白D結(jié)合，因為當親環(huán)蛋白D被靶向的shRNA沉默時，化合物19就不能進一步保護細胞免受缺血再灌注損傷?；衔?9幾乎阻斷缺血再灌注損傷誘導(dǎo)的p53-CyPD線粒體締合, mPTP開放和隨后的細胞色素C釋放。進一步的研究表明，化合物19抑制紫外線誘導(dǎo)的活性氧(ROS)產(chǎn)生，脂質(zhì)過氧化和DNA損傷?；衔?9可能通過沉默親環(huán)蛋白D從而調(diào)節(jié)線粒體死亡途徑。因此，化合物19可能是可以用于治療子宮內(nèi)膜細胞缺血再灌注損傷等疾病的先導(dǎo)化合物[50]。根據(jù)該研究的方法，便可人工合成該小分子化合物。

隨后，科研工作者們的初步研究結(jié)果證實，低濃度的化合物19(1 μmol/L)能顯著抑制OGDR誘導(dǎo)的子宮內(nèi)膜細胞程序性壞死。其活性要顯著優(yōu)于傳統(tǒng)的親環(huán)蛋白D抑制劑CsA。因此，通過體內(nèi)、外系統(tǒng)觀察新型親環(huán)蛋白D抑制劑化合物19抗子宮內(nèi)膜細胞缺血再灌注損傷作用，解析其作用的分子機制，可能是臨床實踐中抗子宮內(nèi)膜細胞缺血再灌注損傷的新思路、新工具。

通過對近年來科研工作的匯總，作者認為I/R(體外則為OGDR模型)誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜細胞p53線粒體轉(zhuǎn)位[51]后者親環(huán)蛋白D(線粒體mPTP組成蛋白)耦聯(lián)，從而介導(dǎo)線粒體mPTP開放，細胞色素C釋放, ROS生成，細胞程序性壞死。該機制可能是I/R誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜細胞損傷的核心分子機制。而通過藥理學(xué)(如化合物19)手段，便可靶向阻斷該線粒體通路而抑制缺血再灌注誘導(dǎo)的子宮內(nèi)膜細胞死亡。

[1] LH Toledo-Pereyra. Advances in Ischemia and Reperfusion[J]. Journal of investigative surgery: the official journal of the Academy of Surgical Research, 2015, 28(5): 233-235.

[2] Halladin N L. Oxidative and inflammatory biomarkers of ischemia and reperfusion injuries[J]. Dan Med J, 2015, 62(4): B5054-B5063.

[3] Van de Velde M, Diez C, Varon AJ. Obstetric hemorrhage[J]. Curr Opin Anaesthesiol, 2015, 28(2): 186-190.

[4] Mullins T L, Miller R J, Mullins E S. Evaluation and Management of Adolescents with Abnormal Uterine Bleeding[J]. Pediatr Ann, 2015, 44(9): e218-e222.

[5] Deering S, Rowland J. Obstetric emergency simulation[J]. Semin Perinatol, 2013, 37(3): 179-188.

[6] Bennett A R, Gray SH. What to do when she's bleeding through: the recognition, evaluation, and management of abnormal uterine bleeding in adolescents[J]. Curr Opin Pediatr, 2014, 26(4): 413-419.

[7] Mullins T L, Miller RJ, Mullins E S. Evaluation and Management of Adolescents with Abnormal Uterine Bleeding[J]. Pediatr Ann, 2015, 44(9): e218-e222.

[8] Levy-Zauberman Y, Pourcelot A G, Capmas P, et al. Update on the management of abnormal uterine bleeding[J]. J Gynecol Obstet Hum Reprod, 2017, 46(8): 613-622.

[9] Pecchioli Y, Oyewumi L, Allen LM, et al. The Utility of Routine Ultrasound in the Diagnosis and Management of Adolescents with Abnormal Uterine Bleeding[J]. J Pediatr Adolesc Gynecol, 2017, 30(2): 239-242.

[10] Clark S L. Obstetric hemorrhage[J]. Semin Perinatol, 2016, 40(2): 109-111.

[11] Le Gouez A, Mercier F J. Major obstetric hemorrhage[J]. Transfus Clin Biol, 2016, 23(4): 229-232.

[12] AJ Friedman. Obstetric hemorrhage[J]. J Cardiothorac Vasc Anesth, 2013, 27(Suppl 4): 674-679.

[13] Ibáez B, Heusch G, Ovize M, et al. Evolving therapies for myocardial ischemia/reperfusion injury[J]. J Am Coll Cardiol, 2015, 65(14): 1454-1471.

[16] Kalogeris T, Bao Y, Korthuis R J. Mitochondrial reactive oxygen species: a double edged sword in ischemia/reperfusion vs preconditioning[J]. Redox Biol, 2014, 2: 702-714.

[17] Javadov S, Kuznetsov A. Mitochondrial permeability transition and cell death: the role of cyclophilin d[J]. Front Physiol, 2013, 4: 76-83.

[19] Tsujimoto Y, Nakagawa T, Shimizu S. Mitochondrial membrane permeability transition and cell death[J]. Biochim Biophys Acta, 2006, 1757(9/10): 1297-1300.

[20] Tsujimoto Y, Shimizu S. Role of the mitochondrial membrane permeability transition in cell death[J]. Apoptosis, 2007, 12(5): 835-840.

[21] Jobe S M, Wilson K M, Leo L, et al. Critical role for the mitochondrial permeability transition pore and cyclophilin D in platelet activation and thrombosis[J]. Blood, 2008, 111(3): 1257-1265.

[22] Halestrap A P. Calcium, mitochondria and reperfusion injury: a pore way to die[J]. Biochem Soc Trans, 2006, 34(Pt 2): 232-237.

[23] Ong S B, Gustafsson A B. New roles for mitochondria in cell death in the reperfused myocardium[J]. Cardiovasc Res, 2012, 94(2): 190-196.

[24] Hausenloy D J, Yellon D M. Ischaemic conditioning and reperfusion injury[J]. Nat Rev Cardiol, 2016, 13(4): 193-209.

[28] Votyakova T V, Reynolds IJ. DeltaPsi(m)-Dependent and -independent production of reactive oxygen species by rat brain mitochondria[J]. J Neurochem, 2001, 79(2): 266-277.

[29] Miura T, Tanno M. The mPTP and its regulatory proteins: final common targets of signalling pathways for protection against necrosis[J]. Cardiovasc Res, 2012, 94(2): 181-189.

[30] Vaseva A V, Marchenko N D, Ji K, et al. p53 opens the mitochondrial permeability transition pore to trigger necrosis[J]. Cell, 2012, 149(7): 1536-1548.

[31] Elrod J W, Molkentin J D. Physiologic functions of cyclophilin D and the mitochondrial permeability transition pore[J]. Circ J, 2013, 77(5): 1111-1122.

[32] Ying Y, Padanilam B J. Regulation of necrotic cell death: p53, PARP1 and cyclophilin D-overlapping pathways of regulated necrosis[J]. Cell Mol Life Sci, 2016, 73(11/12): 2309-2324.

[33] Komarov P G, Komarova E A, Kondratov R V, et al. A chemical inhibitor of p53 that protects mice from the side effects of cancer therapy[J]. Science, 1999, 285(5434): 1733-1737.

[38] Uchino H, Ishii N, Shibasaki F. Calcineurin and cyclophilin D are differential targets of neuroprotection by immunosuppressants CsA and FK506 in ischemic brain damage[J]. Acta Neurochir Suppl, 2003, 86: 105-111.

[39] Fayaz S M, Raj Y V, Krishnamurthy R G. CypD: The Key to the Death Door[J]. CNS Neurol Disord Drug Targets, 2015, 14(5): 654-663.

[41] Ptak R G, Gallay P A, Jochmans D, et al. Inhibition of human immunodeficiency virus type 1 replication in human cells by Debio-025, a novel cyclophilin binding agent[J]. Antimicrob Agents Chemother, 2008, 52(4): 1302-1317.

[42] Reutenauer J, Dorchies O M, Patthey-Vuadens O, et al. Investigation of Debio 025, a cyclophilin inhibitor, in the dystrophic mdx mouse, a model for Duchenne muscular dystrophy[J]. Br J Pharmacol, 2008, 155(4): 574-584.

[43] Wissing E R, Millay D P, Vuagniaux G, et al. Debio-025 is more effective than prednisone in reducing muscular pathology in mdx mice[J]. Neuromuscul Disord, 2010, 20(11): 753-760.

[44] Hopkins S, Gallay P. Cyclophilin inhibitors: an emerging class of therapeutics for the treatment of chronic hepatitis C infection[J]. Viruses, 2012, 4(11): 2558-2577.

[45] Hopkins S, Scorneaux B, Huang Z, et al. SCY-635, a novel nonimmunosuppressive analog of cyclosporine that exhibits potent inhibition of hepatitis C virus RNA replication in vitro[J]. Antimicrob Agents Chemother, 2010, 54(2): 660-672.

[47] Dunsmore C J, Malone K J, Bailey K R, et al. Design and synthesis of conformationally constrained cyclophilin inhibitors showing a cyclosporin-A phenotype in C. elegans[J]. Chembiochem, 2011, 12(5): 802-810.

[48] Akao M, Takeda T, Kita T, et al. Serofendic acid, a substance extracted from fetal calf serum, as a novel drug for cardioprotection[J]. Cardiovasc Drug Rev, 2007, 25(4): 333-341.

[49] Shore E R, Awais M, Kershaw N M, et al. Small Molecule Inhibitors of Cyclophilin D To Protect Mitochondrial Function as a Potential Treatment for Acute Pancreatitis[J]. J Med Chem, 2016, 59(6): 2596-2611.

[50] Xie L, Cheng L, Xu G, et al. The novel cyclophilin D inhibitor compound 19 protects retinal pigment epithelium cells and retinal ganglion cells from UV radiation[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2017, 487(4): 807-812.

[51] Fayaz S M, Rajanikant GK. Modelling the molecular mechanism of protein-protein interactions and their inhibition: CypD-p53 case study[J]. Mol Divers, 2015, 19(4): 931-943.