徐艷雯 范蓮 季超毅 徐笑挺 黃逸勛 鄭永霞

(嘉興學(xué)院醫(yī)學(xué)院，浙江 嘉興 314001)

在法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，損傷時間推斷(dating of wound)一直是國內(nèi)外學(xué)者致力于研究的重點和難點，準(zhǔn)確推斷損傷時間可以為案件偵破和審理提供線索和證據(jù)。這一領(lǐng)域關(guān)注的主要問題是：傷口造成的順序，生前傷還是死后傷，遭受致命傷后的存活時間和受傷是否由意外事故造成。機(jī)體損傷后，原本處于穩(wěn)定狀態(tài)的內(nèi)環(huán)境被打亂，必然會發(fā)生一些變化，幾乎所有這一領(lǐng)域的關(guān)注點都在傷口邊緣活性分子的變化，以期尋找一些與損傷時間有良好相關(guān)性的指標(biāo)，指導(dǎo)法醫(yī)學(xué)實踐，采用的方法也從單純的形態(tài)學(xué)檢查發(fā)展到蛋白、基因水平。

1 藥物性肝損傷及其發(fā)病機(jī)制

大部分藥物的代謝發(fā)生在肝臟，因此肝臟相較于其他器官也容易受到藥物的損害。某些藥物在肝內(nèi)經(jīng)過細(xì)胞色素P450藥酶作用，代謝轉(zhuǎn)化為一些毒性藥物，如親電子基團(tuán)，自由基和過氧化物，與大分子物質(zhì)如蛋白質(zhì)、核酸共價結(jié)合或造成細(xì)胞質(zhì)膜的脂質(zhì)過氧化，破壞了細(xì)胞膜的完整性和膜的Ca2+-ATP酶系，使細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境的Ca2+穩(wěn)態(tài)破壞，導(dǎo)致肝細(xì)胞壞死。除此之外，氧自由基、四氯化碳、氟烷等藥物也可引起肝細(xì)胞壞死。另外，其代謝產(chǎn)物也可與肝細(xì)胞的蛋白質(zhì)結(jié)合，形成新抗原，誘導(dǎo)免疫反應(yīng)[3][4]。比如：在特殊類型藥物性肝損傷中，遺傳因素對其產(chǎn)生重大影響。

2 藥物性肝臟損害臨床診斷的問題

在臨床工作中常常運用幾個血清生物標(biāo)記，如谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、總膽紅素、堿性磷酸酶，幫助識別在臨床試驗中的嚴(yán)重藥物性肝損傷事件[5]。然而，這些生物標(biāo)志物仍然存在假陽性、假陰性的情況，缺乏較強的敏感性，特異性。例如，血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶表達(dá)異常不僅與肝臟損傷有關(guān)，也可能出現(xiàn)在腎損傷或肌肉壞死的情況中。有些藥物能引起血清轉(zhuǎn)氨酶升高，但沒有造成嚴(yán)重的肝損傷，導(dǎo)致假陽性[6]。這些情況的存在都顯示傳統(tǒng)肝損傷指標(biāo)作為藥物性肝損傷的生物標(biāo)志物的局限性。因此，尋找一個對藥物性肝損傷具有高度敏感性，特異性的指標(biāo)具有必要性。

3 MicroRNA概述

MicroRNAs(miRNAs)是內(nèi)源性無編碼功能的小分子單鏈RNA，長僅有20～25個核苷酸的單鏈小分子組成。miRNA最早發(fā)現(xiàn)于線蟲(Ceanorhadbitis elegans)，這種內(nèi)源性小分子RNA能夠通過RNA-RNA的相互作用調(diào)節(jié)特定蛋白的翻譯[1]。后續(xù)越來越多的的實驗說明microRNA幾乎具有調(diào)控幾乎所有生物學(xué)活動的功能而不是單單局限在調(diào)控某個生理過程，具體表現(xiàn)為細(xì)胞增殖，細(xì)胞凋亡，細(xì)胞自噬等方面[2]。如今，miRNA已成為重大疾病發(fā)生機(jī)制和治療策略研究中不可缺少的研究對象。

3.1 與藥物性肝損傷有關(guān)的MicroRNA和發(fā)病機(jī)理

外源性物質(zhì)的反應(yīng)可以由肝臟的miRNAs調(diào)節(jié)。例如，大鼠由于在乙酰氨基酚或四氯化碳等肝臟毒素中的暴露，使得體內(nèi)多種miRNA的表達(dá)發(fā)生改變，如miR-298和miR-370的表達(dá)下調(diào)，它們被認(rèn)為是調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激相關(guān)基因。在接觸過三苯氧胺后，在大鼠肝臟中檢測到有17-92簇、miR-106a和miR-34升高，它們被認(rèn)為是致癌miRNA，因此這種情況被認(rèn)為是患有嚴(yán)重的肝癌的表現(xiàn)[7]。另一個研究小組證明了二氧雜芑在環(huán)境中無處不在，并在人類和野生動物中積累，改變了miR-101a及其目標(biāo)環(huán)氧合酶-2的表達(dá)，它們在肝損傷中起著重要的作用。根據(jù)研究發(fā)現(xiàn)，在miR-106b抑制表達(dá)的患者中，肝毒性藥物氟烷引起Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路異常和TOP/FOP熒光比值的顯著上調(diào)，導(dǎo)致嚴(yán)重的肝損傷[8]。綜上所述，這些研究表明，miRNAs在肝毒性的藥理和毒理學(xué)過程中起著重要的作用。正如在miRNAs中所示，通過調(diào)控目標(biāo)基因，可以參與到藥物性肝損傷發(fā)展過程中。

3.2 循環(huán)miRNAs是藥物性肝損傷的潛在生物標(biāo)志物

盡管對miRNAs作為生物標(biāo)志物的研究主要集中在癌癥研究領(lǐng)域，但它們作為毒物生物標(biāo)志物的潛力最近也得到了研究。在過去的幾年里，許多動物和臨床研究已經(jīng)發(fā)表，表明miRNA比傳統(tǒng)的藥物性肝損傷的生物標(biāo)志物有優(yōu)勢。它們是異常穩(wěn)定的，在病理狀態(tài)下具有高度的肝臟特異性和顯著的改變，在體液中很容易檢測到，而且在物種之間是嚴(yán)格保守的[9]。因此使用血液循環(huán)中miRNAs作為新的藥物性肝損傷的生物標(biāo)記具有可實行性。比如用于診斷特異性肝損傷時，血液循環(huán)中的miRNA-122明顯升高。Wang等[10]在對乙酰氨基酚誘導(dǎo)的肝損傷模型中發(fā)現(xiàn)，給藥后24 h，血漿中有44種miRNA的表達(dá)水平是對照組的2倍以上，其中25種顯著升高，而miR-122變化最顯著。為了檢測miR-122的靈敏性，他們在給予對乙酰氨基酚不同劑量后1 h和3 h檢測血漿miR-122和ALT的變化，兩者都呈現(xiàn)出劑量和時間依賴性，但對乙酰氨基酚過量暴露引起miR-122的變化更加明顯，而且在亞毒性劑量給藥后3 h和中毒劑量給藥后1 h，就可以檢測到血漿中miR-122的升高，血清轉(zhuǎn)氨酶卻無明顯變化。

幾個獨立的組織提供了額外的數(shù)據(jù)支持使用miRNAs作為藥物性肝損傷生物標(biāo)記。某一組實驗證實小鼠血漿miR-122水平與d-半乳糖胺和酒精引起的肝臟損傷相關(guān)。他們還證實，miR-122的變化比谷丙轉(zhuǎn)氨酶的變化更大，更重要的是，miR-122在肝臟明顯的組織病理學(xué)變化之前被檢測到顯著的升高，這表明miR-122可以用于早期診斷和監(jiān)測疾病。Bala[11]和他的同事發(fā)現(xiàn)，血漿miR-122和miR-155在酒精和炎性肝損傷中主要與外泌素含量高有關(guān)，而在對乙酰氨基酚引起的肝損傷中，這些miRNAs主要存在于可溶性蛋白含量較高的部分。這些結(jié)果表明，循環(huán)miRNAs可以作為生物標(biāo)志物來區(qū)分肝細(xì)胞損傷和炎癥，而外生或蛋白相關(guān)的miR-122可能提供進(jìn)一步的肝臟病理機(jī)制。同一組還比較了40種不同于致命或亞致死劑量乙酰氨基酚的血漿miRNA，發(fā)現(xiàn)miR-574-5p，miR-135a，miR-466g，miR-1196，,miR-466f-3p和miR-877在致死性肝毒性的設(shè)置中被上調(diào)，miR-342-3p，miR-195，miR-375，miR-29c，miR-148a和miR-652明顯下調(diào)。因此，人類血漿中miRNAs的差異表達(dá)可能有助于區(qū)分致命和次等致死肝毒性。

與小鼠相比，大鼠的對乙酰氨基酚所致肝損傷的敏感性較低。使用化學(xué)或特殊飲食管理的大鼠模型，Yamaura等人檢查了急性肝損傷(肝細(xì)胞損傷或膽汁淤積)和慢性肝損傷(脂肪變性、脂肪肝炎和纖維化)的血漿miRNA水平。他們的結(jié)果顯示，miR-122水平比氨基轉(zhuǎn)移酶的水平更快、更顯著地增加，反映了肝細(xì)胞損傷的程度。重要的是，他們的研究還表明，血漿miRNAs的表達(dá)譜與肝損傷類型不同，這表明這些miRNAs可能是不同類型肝損傷的特異性和敏感的生物標(biāo)志物。Su等人[12]還報道，miR-122、miR-192和miR-193有可能成為診斷herb所致肝損傷的敏感、特異性和非侵襲性生物標(biāo)志物。此外，Starckx和同事證實，在四種具有不同類型和肝毒性作用機(jī)制的化合物(乙酰氨基酚、烯丙醇、甲萘基異硫氰酸酯和苯巴比妥)后，在大鼠血漿中miR-122水平顯著升高。小鼠肝細(xì)胞的miR-122分泌與其他標(biāo)志物的反應(yīng)一致，與谷丙轉(zhuǎn)氨酶/AST和組織病理學(xué)評價所示的肝損傷一致。與其他常規(guī)生物標(biāo)記物相比，血漿miR-122的變化明顯較早，具有廣泛的動態(tài)范圍。綜上所述，上述所有發(fā)現(xiàn)表明，miR-122有很大的潛力可作為肝臟損傷的生物標(biāo)志物，并可為評估臨床前研究和開發(fā)新藥的肝毒性提供額外的價值。

與小鼠相比，對乙酰氨基酚誘發(fā)的大鼠肝損傷的易感性較低。使用經(jīng)過化學(xué)或特殊飲食管理的老鼠模型，Yamaura等人檢查急性肝損傷(肝細(xì)胞損傷或膽汁淤積)及慢性肝損傷(脂肪變性、脂肪性肝炎、纖維化)血漿miRNA水平，他們的研究結(jié)果顯示，miR-122比氨基轉(zhuǎn)移酶升高更快、更顯著，反映肝細(xì)胞損傷程度。重要的是，他們的研究還表明，血漿miRNAs的表達(dá)譜與肝損傷類型不同，這表明這些miRNAs可能是不同類型肝損傷的特異性和敏感的生物標(biāo)志物。Su等人[13]也報告miR-122、miR-192和miR-193有可能成為診斷herb引起肝損傷的敏感、特異性和非侵襲性生物標(biāo)志物。此外，Starckx[14]和同事證實，在四種具有不同類型和肝毒性作用機(jī)制的化合物(乙酰氨基酚、烯丙醇、甲萘基異硫氰酸酯和苯巴比妥)起作用后，大鼠血漿中miR-122水平顯著升高。小鼠肝細(xì)胞的miR-122分泌與其他標(biāo)志物的反應(yīng)一致，與谷丙轉(zhuǎn)氨酶/AST和組織病理學(xué)評價所示的肝損傷一致。與其他常規(guī)生物標(biāo)記物相比，血漿miR-122的變化明顯較早，具有廣泛的動態(tài)范圍。綜上所述，上述所有發(fā)現(xiàn)表明，miR-122作為肝臟損傷的生物標(biāo)志物有很大的潛力，并可為評估臨床研究和開發(fā)新藥的肝毒性提供額外的價值。

4 在人類藥物性肝損傷中循環(huán)miRNAs作為生物標(biāo)志物

據(jù)文獻(xiàn)報道外周血循環(huán)miRNAs主要來源于凋亡或壞死細(xì)胞的主動釋放，以及循環(huán)細(xì)胞的裂解或是miRNAs被包裹在外核體中經(jīng)細(xì)胞分泌后釋放入外周血，值得注意的是，在肝臟和血漿中共存在約93種miRNAs，其中67種可見于血漿中，55種可見于肝組織中，其中8種在所有人的肝組織中能檢測到，29種在所有人血漿中能檢測到，只有5種在所有人的肝組織和血漿中都能檢測到。Zhang等[15]建立了兩種肝損傷小鼠模型(D-胺基半乳糖和酒精所致的肝損傷模型)來評估肝損傷，在D-胺基半乳糖所致的肝損傷模型中，早在腹腔注射0.5 h后，就有血漿miR-122的增高，而且所有的小鼠均出現(xiàn)肝臟損傷的病理學(xué)變化，但是在此時間點，谷丙轉(zhuǎn)氨酶的活性并沒有發(fā)生改變。酒精所致的肝損傷模型與D-胺基半乳糖所致的肝損傷模型檢測結(jié)果基本一致。而不同的是酒精所致的肝損傷模型中，0.5 h并沒有發(fā)現(xiàn)小鼠的肝臟有組織病理學(xué)改變，在酒精灌胃更長的時間內(nèi)才有了肉眼可以觀察到的病理學(xué)改變。與常規(guī)標(biāo)志物谷丙轉(zhuǎn)氨酶相比，在檢測這些類型的肝臟損傷時，miR-122可能是一個更加靈敏的指標(biāo)，因為miR-122的表達(dá)水平改變可能還更先于肉眼可見的組織病理學(xué)變化。

Jetten等[16]人也證明了miR-19b和miR-29c在經(jīng)低劑量乙酰氨基酚治療后在人的血細(xì)胞中被上調(diào)。然而，谷丙轉(zhuǎn)氨酶的水平?jīng)]有改變。這些結(jié)果表明，當(dāng)肝損害用常規(guī)標(biāo)記無法檢測時，循環(huán)miRNAs的表達(dá)譜可能會發(fā)生改變。事實上，另一項研究顯示，miR-122和高遷移率組1、全長和caspase-cleUNK keratin-18，比谷丙轉(zhuǎn)氨酶更敏感，更早確定乙酰氨基酚引起的急性肝損傷[17]。Thulin和他的同事還發(fā)現(xiàn)，在早期的時間點，血清keratin-18和miR-122的水平顯著升高，而藥物性肝損傷患者的血清keratin-18和miR-122的水平明顯高于谷丙轉(zhuǎn)氨酶[18]。循環(huán)miRNAs因其在肝組織表達(dá)的特異、穩(wěn)定和靈敏而有望成為肝毒性新的可靠的生物標(biāo)志物。

5 結(jié)論

藥物性肝損傷的預(yù)測、診斷和管理都是非常復(fù)雜的問題。目前的生物標(biāo)志物或者評估藥物性肝損傷的方法包括生物化學(xué)標(biāo)記，如氨基轉(zhuǎn)移酶、總膽汁酸、組織病理學(xué)或超微結(jié)構(gòu)病理學(xué)、活性代謝產(chǎn)物[19-20]，由于敏感性、穩(wěn)定性或特異性較差，這些常規(guī)的毒理學(xué)生物標(biāo)志物無法為肝毒性的早期評價提供準(zhǔn)確的信息。新型、可靠、信息豐富的生物標(biāo)志物的發(fā)展，仍然是臨床和臨床前的重要課題。肝臟特異性miRNA-122已被證實參與肝臟發(fā)育、分化、代謝和應(yīng)激反應(yīng)的各個過程。與常規(guī)肝毒性標(biāo)志物相比，循環(huán)miR-122能有效且持續(xù)地將肝內(nèi)損傷與較高的敏感性和特異性區(qū)分開來。因此，miR-122有望成為藥物性肝損傷的臨床生物標(biāo)志物。

雖然使用循環(huán)miRNA來早期診斷藥物性肝損傷具有廣闊前景，但在臨床應(yīng)用前仍需要進(jìn)一步的研究。要解決的主要問題包括：缺乏大的樣本量進(jìn)行驗證分析，常規(guī)臨床實驗室缺乏檢測方法這些都制約著其進(jìn)一步發(fā)展?？傊?，使用miRNAs，特別是miR-122，作為藥物性肝損傷的非侵入性生物標(biāo)志物顯示了巨大的潛力，但仍處于初級階段仍需要對循環(huán)miRNAs進(jìn)行更多的研究，以期真正具有臨床可應(yīng)用性。