苗栓林,曹曉朋,胡麗芳

非小細(xì)胞肺癌是我國(guó)最常見、病死率最高的惡性腫瘤,其主要類型包括腺癌、鱗癌等小細(xì)胞肺癌，約占全部肺癌的80%[1]。由于非小細(xì)胞肺癌早期臨床特征不明顯，其檢出率和診斷率低下，患者確診時(shí)多為中晚期并伴轉(zhuǎn)移，其中肺癌骨轉(zhuǎn)移是其最常見的轉(zhuǎn)移類型之一，可導(dǎo)致常規(guī)手術(shù)治療、放化療效果欠佳，嚴(yán)重威脅患者的生命安全[2]。由于肺癌骨轉(zhuǎn)移患者自身?xiàng)l件普遍較差，故放化療治療相對(duì)受限[3]。細(xì)胞免疫治療作為新型治療技術(shù)，對(duì)多種惡性腫瘤療效滿意，本研究選擇自體細(xì)胞免疫治療(cytokine-induced killer, CIK)聯(lián)合序貫放化療治療肺癌骨轉(zhuǎn)移，探討其應(yīng)用效果與病理組織表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)基因突變狀態(tài)的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1臨床資料 選擇2015年1月—2017年2月延安大學(xué)咸陽(yáng)醫(yī)院收治的肺癌骨轉(zhuǎn)移91例，男51例，女40例；年齡(48.3±11.6)歲；病程(3.72±1.65)年；病理類型：腺癌48例，小細(xì)胞肺癌30例，鱗癌13例；轉(zhuǎn)移情況：肋骨轉(zhuǎn)移32例，胸椎轉(zhuǎn)移28例，腰椎轉(zhuǎn)移25例，骨盆轉(zhuǎn)移6例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①根據(jù)臨床表現(xiàn)和肺癌組織病理活檢確診肺癌，同位素全身骨掃描確診肺癌骨轉(zhuǎn)移；②符合CIK治療、序貫化放療適應(yīng)證；③患者和家屬均具備獨(dú)立行事能力，了解治療風(fēng)險(xiǎn)，愿意配合治療研究。排除標(biāo)準(zhǔn)：①存在骨結(jié)核、骨折、骨惡性腫瘤等疾??；②存在精神心理疾病，難以配合治療。本研究已獲醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2治療及檢測(cè)方法

1.2.1序貫放化療治療方法：全部病例評(píng)估治療潛在風(fēng)險(xiǎn)、相關(guān)治療適應(yīng)證，給予序貫放化療治療，即NP化療方案：酒石酸長(zhǎng)春瑞濱注射液(江蘇豪森藥業(yè)股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字：H20031337)30 mg/m2靜脈注射，第1 d、第8 d；注射用順鉑(山東鳳凰制藥股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字：H20056422)40mg靜脈滴注，第1～3 d。4周為1個(gè)療程，連續(xù)化療3個(gè)療程?；熃Y(jié)束后，應(yīng)用放療直線加速器(美國(guó)瓦里安公司生產(chǎn))于化療第1 d給予放療，2 Gy/d，每周放療5次。每周10 Gy，總劑量為60 Gy。

1.2.2自體CIK細(xì)胞免疫治療方法：化療第1 d同時(shí)給予自體CIK細(xì)胞免疫治療，常規(guī)采集外周靜脈血100 ml，差速離心分離單個(gè)核細(xì)胞。放入無血清培養(yǎng)基并于37℃孵箱中培養(yǎng)2 h，PBS去除未貼壁細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)并加入購(gòu)自齊魯制藥有限公司(國(guó)藥準(zhǔn)字：201612086LAB)的注射用重組人白細(xì)胞介素-11注射液(rhIL-11)和購(gòu)自廈門特寶生物工程股份有限公司(國(guó)藥準(zhǔn)字：20141127、20160609)的注射用重組人粒細(xì)胞/巨噬細(xì)胞集落刺激因子(rhGM-CSF)誘導(dǎo)單個(gè)核細(xì)胞CIK方向分化，加入白介素-1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等細(xì)胞因子誘導(dǎo)CIK成熟，經(jīng)形態(tài)學(xué)和分子生物標(biāo)志物鑒定后持續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)，回輸至患者體內(nèi)，隔日1次，共4次。

1.2.3免疫組化檢測(cè)EGFR基因突變情況：CT引導(dǎo)穿刺獲得肺癌組織，乙醇梯度脫水、包埋后石蠟切片、二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化，去除內(nèi)源性過氧化物酶，pH 6.0檸檬酸鹽緩沖液高溫高壓修復(fù)并冷卻至室溫，羊血清封閉后滴加EGFR抗del19和mut21突變抗體(Abcam Technology, Cambridge, UK)，稀釋比例1∶100，4℃孵育過夜；次日依次給予鏈霉素標(biāo)記的羊抗兔二抗孵育15 min，鏈霉素標(biāo)記的抗生物素孵育10 min，顯微鏡下DAB顯色1～3 min，流水沖洗10 min，蘇木素復(fù)染細(xì)胞核2 min，流水再次沖洗10 min返藍(lán)，最終經(jīng)乙醇梯度脫水和二甲苯透明后中性樹膠封片，顯微鏡下評(píng)估EGFR突變情況。免疫組化二抗試劑盒及DAB顯色液均購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。

1.2.4基因測(cè)序法檢測(cè)EGFR基因突變情況：在用實(shí)時(shí)熒光定量核酸擴(kuò)增檢測(cè)系統(tǒng)(qPCR)方法檢測(cè)同時(shí)，采用基因測(cè)序法檢測(cè)EGFR基因突變情況。肺癌組織標(biāo)本經(jīng)10%福爾馬林固定、石蠟包埋后切片，直接采用基因測(cè)序法檢測(cè)EGFR基因是否存在基因缺失、突變情況，初次檢測(cè)結(jié)果采用引物再次進(jìn)行反向測(cè)序驗(yàn)證?；蚍治鰞x型號(hào)為ABI 3710Genetic Analyzer(美國(guó)Applied Biosystems公司)。EGFR測(cè)序法檢測(cè)相關(guān)突變的引物序列如下:del19上游引物：5'-GCAATATCAGCCTTAGGTGCGGCT-3'，下游引物5'-CATAGAAAGTGAACATTTAGGATGTG-3'；mut21上游引物：5'-CTAACGTTCGCCAGCCATAAGTCC-3'，下游引物:5'-GCTGCGAGCTCACCCAGAATGTCTGG-3'。

1.3觀察指標(biāo)及方法

1.3.1療效判定：根據(jù)中國(guó)肺癌骨轉(zhuǎn)移診療專家共識(shí)(2014版)[4]評(píng)估自體CIK細(xì)胞免疫治療聯(lián)合序貫化療的效果，即治療后3個(gè)月觀察患者癥狀改善程度，癌灶大小變化。治療有效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)為：癌癥所致疼痛、呼吸困難等癥狀緩解甚至消失，肺癌及轉(zhuǎn)移灶縮小，無明顯不良反應(yīng)和并發(fā)癥。

1.3.2EGFR基因突變?cè)u(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)：EGFR基因突變免疫組化檢測(cè)的陽(yáng)性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)為細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒，評(píng)分包括陽(yáng)性細(xì)胞比例評(píng)分和顯色強(qiáng)度評(píng)分兩項(xiàng)，二者之積即為該組織EGFR表達(dá)評(píng)分。每一份標(biāo)本均由兩名病理科醫(yī)師經(jīng)盲法評(píng)估，取平均值作為表達(dá)水平進(jìn)行評(píng)分。①陽(yáng)性細(xì)胞評(píng)分：<5%，0分；5%～25%，1分；26%～50%，2分；51%～75%，3分；>75%，4分。②染色強(qiáng)度評(píng)分：陰性0分；弱陽(yáng)性1分；中等2分；強(qiáng)陽(yáng)性3分。評(píng)分≤7分視為陰性，評(píng)分≥8分視為陽(yáng)性[5]。

2 結(jié)果

2.1臨床療效 91例肺癌骨轉(zhuǎn)移經(jīng)治療后有效者70例，有效率達(dá)76.92%。

2.2免疫組化檢測(cè)結(jié)果 EGFR基因突變陽(yáng)性為細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒。見圖1。治療有效組EGFR基因的del19和mut21突變檢測(cè)評(píng)分和陽(yáng)性率均明顯高于治療無效組 (P<0.05)。見表1。

表1 兩組表皮生長(zhǎng)因子受體基因突變差異評(píng)分和突變陽(yáng)性率比較

2.3基因測(cè)序檢測(cè)結(jié)果 治療有效組EGFR基因的del19和mut21突變檢出率均明顯高于治療無效組 (P<0.05)。見表2。

表2 兩組表皮生長(zhǎng)因子受體基因突變陽(yáng)性率比較[例(%)]

圖1兩組免疫組化檢測(cè)表皮生長(zhǎng)因子受體基因突變(SP×200)

A.有效組del19檢測(cè)結(jié)果;B.有效組mut21檢測(cè)結(jié)果;C.無效組del19檢測(cè)結(jié)果;D.無效組mut21檢測(cè)結(jié)果

3 討論

免疫治療是近年繼手術(shù)、放療、化療之后第4種具有治愈惡性腫瘤疾病希望的治療技術(shù)。因腫瘤細(xì)胞存在較強(qiáng)的免疫逃逸和免疫抑制功能，可有效擺脫正常免疫細(xì)胞的殺傷效應(yīng)[6]。因此，通過誘導(dǎo)和增強(qiáng)機(jī)體對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫力，經(jīng)免疫系統(tǒng)特異性殺傷腫瘤細(xì)胞，成為控制腫瘤生長(zhǎng)，最終實(shí)現(xiàn)惡性腫瘤治愈[7]的新技術(shù)。目前，免疫治療常用的方法主要包括免疫細(xì)胞治療、免疫檢查點(diǎn)特征性抑制劑、針對(duì)性抗體、溶瘤病毒、特異性癌癥疫苗，其他免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)劑等，被應(yīng)用于不同腫瘤的基礎(chǔ)研究和臨床試驗(yàn)性治療，取得了一定的療效[8]。

近年來，大量惡性腫瘤的免疫治療研究發(fā)展迅速，亦成為晚期非小細(xì)胞肺癌臨床治療的熱點(diǎn)[9]。本研究基于肺癌發(fā)病、發(fā)展的特點(diǎn)和原理，選擇自體CIK細(xì)胞免疫治療。CIK細(xì)胞是主要組織相容性復(fù)合物不受限的T淋巴免疫細(xì)胞，其分子表現(xiàn)為CD3+CD56+T陽(yáng)性，具有極快的增殖和復(fù)制能力、廣譜抗瘤性和強(qiáng)殺瘤活性[10]。人外周血單個(gè)核細(xì)胞經(jīng)科學(xué)培養(yǎng)、針對(duì)性誘導(dǎo)分化成熟CIK細(xì)胞，重新回輸至患者體內(nèi)，可提高腫瘤細(xì)胞識(shí)別能力，并通過釋放大量分子靶向毒性顆粒作用于腫瘤細(xì)胞膜，裂解腫瘤細(xì)胞導(dǎo)致其死亡[11]。此外，與其他自體治療技術(shù)一致，具有免疫排斥發(fā)生率低、治療相對(duì)安全的優(yōu)勢(shì)[12]。

骨轉(zhuǎn)移是肺癌最常見的轉(zhuǎn)移部位之一，以肋骨、胸椎、腰椎、骨盆等多見，可致患者骨骼疼痛、功能癱瘓甚至死亡。針對(duì)肺癌骨轉(zhuǎn)移，常規(guī)放化療可大規(guī)模的殺滅和抑制肺癌細(xì)胞，但殘留腫瘤細(xì)胞成為日后復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的重要根源或唯一根源，也是手術(shù)、放化療治療失敗的根本原因[13-15]。故輔以CIK細(xì)胞免疫治療，可在細(xì)胞水平針對(duì)殘留的肺癌細(xì)胞繼續(xù)殺滅并抑制肺癌，極大地降低了復(fù)發(fā)率、轉(zhuǎn)移率，延長(zhǎng)生存時(shí)間，并有效提高其生存質(zhì)量[16-17]。本研究對(duì)全部肺癌骨轉(zhuǎn)移給予自體CIK細(xì)胞免疫治療聯(lián)合序貫放化療，有效70例，有效率達(dá)76.92%，證實(shí)該治療臨床效果確切。

EGFR是ErbB家族的一種跨膜糖蛋白，作為細(xì)胞增殖和信號(hào)傳導(dǎo)受體，可刺激細(xì)胞生長(zhǎng)失控、持續(xù)生長(zhǎng)，最終發(fā)生癌變和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，如骨轉(zhuǎn)移、腦轉(zhuǎn)移等[18-19]。目前，大量研究發(fā)現(xiàn)EGFR 基因突變狀態(tài)是篩選非小細(xì)胞肺癌患者進(jìn)行酪氨酸激酶抑制劑( TKI) 治療最有價(jià)值的指標(biāo)[20-23]。同時(shí)，檢測(cè) 19 外顯子 E746-A750 缺失和 21 外顯子 L858R 點(diǎn)突變的 EGFR 基因突變特異性抗體已成為準(zhǔn)確、快速和經(jīng)濟(jì)的 EGFR 基因突變篩查方法用。本研究分別采用免疫組化和qPCR法檢測(cè)肺癌組織中EGFR基因突變情況，發(fā)現(xiàn)自體CIK細(xì)胞免疫治療聯(lián)合序貫放化療治療有效組EGFR基因突變檢出率顯著高于無效組，即del19和mut21檢出率均顯著高于無效組，提示EGFR基因突變的肺癌骨轉(zhuǎn)移，給予該方法治療具有更好的療效。

綜上所述，肺癌骨轉(zhuǎn)移進(jìn)行自體CIK細(xì)胞免疫聯(lián)合序貫放化療，療效滿意，且EGFR組織基因突變狀態(tài)應(yīng)用該方法療效更好。

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