羅瀟宇，任垠安，高浩杰，高恩光，王應(yīng)軍,*

1. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)環(huán)境學(xué)院，成都 611130 2. 四川雅安經(jīng)濟(jì)開(kāi)發(fā)區(qū)規(guī)劃建設(shè)和安全生產(chǎn)環(huán)境保護(hù)局，雅安 612500

納米技術(shù)已在許多領(lǐng)域得以應(yīng)用。與此同時(shí)，納米材料通過(guò)生產(chǎn)、水處理應(yīng)用和其他商品使用等途徑直接或間接進(jìn)入到水環(huán)境中，可能會(huì)對(duì)一些水生生物造成危害。ZnO、CuO和TiO2等納米材料對(duì)藻類(lèi)的光合作用影響顯著，能改變?cè)寮?xì)胞內(nèi)葉綠素含量或干擾光合作用過(guò)程中光電子轉(zhuǎn)運(yùn)[1]。多壁碳納米管(multi-walled carbon nanotubes, MWCNTs)作為納米技術(shù)產(chǎn)品之一，由于其出色的性能，諸如：優(yōu)異的導(dǎo)電性、高抗拉強(qiáng)度、巨大的表面積以及半導(dǎo)體和吸附潛力，使得它在環(huán)境保護(hù)方面也有一定的應(yīng)用[2-3]。Mueller等[4]預(yù)測(cè)世界范圍內(nèi)碳納米管產(chǎn)量在每年350～500噸水平。隨著需求的增加，碳納米管大規(guī)模的商業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用引起了人們關(guān)于這些納米材料對(duì)環(huán)境和人體潛在影響的擔(dān)憂(yōu)[5]。盡管納米材料的環(huán)境濃度已經(jīng)有模型研究預(yù)測(cè)，但關(guān)于納米材料的實(shí)際環(huán)境濃度大部分還是未知的[4]。例如，碳納米管的釋放將導(dǎo)致納克和毫克水平的環(huán)境濃度[4]，碳納米管在水生環(huán)境中的濃度級(jí)通常估計(jì)為ng·L-1[6]。雖然對(duì)實(shí)際環(huán)境濃度的了解相對(duì)較少，但研究者們對(duì)碳納米管的潛在毒性和環(huán)境影響還是予以了一定關(guān)注。

研究表明單壁碳納米管不僅可導(dǎo)致大鼠肺部組織損傷和肉芽腫的形成[7-8]，還可引起小鼠肝臟組織蛋白質(zhì)的氧化損傷和大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷[9-10]。還有研究指出在純培養(yǎng)條件下，納米材料具有抗菌性[11-14]。納米二氧化鈰在低濃度(≤80 mg·L-1)時(shí)可促進(jìn)蛋白核小球藻的生長(zhǎng)及光合色素及可溶性性蛋白質(zhì)的合成，但在高濃度(>80 mg·L-1)時(shí)對(duì)蛋白核小球藻具有毒性效應(yīng)[15]。碳納米材料往往通過(guò)靜電、氧化或細(xì)胞膜穿刺等作用產(chǎn)生效應(yīng)，特別是通過(guò)產(chǎn)生活性氧或氮物質(zhì)產(chǎn)生氧化作用，這均需要緊密接觸才會(huì)破壞細(xì)胞膜[16]。在水體環(huán)境中，水底沉積物中高濃度水平的MWCNTs對(duì)無(wú)脊椎動(dòng)物多樣性無(wú)影響，在3個(gè)月的暴露時(shí)間里，無(wú)脊椎動(dòng)物的數(shù)量增加。相比之下，經(jīng)過(guò)15個(gè)月的暴露，檢測(cè)結(jié)果表明2 mg·L-1的MWCNTs對(duì)沉積物中的群落結(jié)構(gòu)有著顯著影響[17]。未純化和氧化處理的MWCNTs在實(shí)驗(yàn)室條件下對(duì)普通小球藻均有劑量效應(yīng)關(guān)系：未純化MWCNTs的IC50值為(5.5±1.8) mg·L-1，氧化MWCNTs的IC50值為(6.9±1.9) mg·L-1，且它們的毒性效應(yīng)主要來(lái)自MWCNTs的團(tuán)聚遮光效應(yīng)[18]。研究者通過(guò)“超聲懸浮”和“普通攪拌”2種方式對(duì)雙壁碳納米管進(jìn)行實(shí)驗(yàn)處理，結(jié)果顯示采用“超聲懸浮”的雙壁碳納米管對(duì)假微型海鏈藻和骨藻具有更大的毒性，表明雙壁碳納米管在水環(huán)境中的生物毒性與它們的分散狀態(tài)有關(guān)[19]。在光照條件下，單璧碳納米管在純水中可以產(chǎn)生活性氧自由基[20]?；钚匝踝杂苫稍黾友趸瘔毫?，導(dǎo)致細(xì)胞膜質(zhì)過(guò)氧化、破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)或?qū)е旅富钚援惓?，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。因此，碳納米管導(dǎo)致的氧化脅迫也可能是碳納米管致毒機(jī)理的一部分。

藻類(lèi)作為水體中的一種初級(jí)生產(chǎn)者，對(duì)水生生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定具有重要作用。水環(huán)境中的許多水溶性污染物可通過(guò)食物鏈進(jìn)入人體，對(duì)人體健康造成影響[21]。由于小球藻細(xì)胞小，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，在環(huán)境中暴露得較為全面，所以學(xué)者們將小球藻應(yīng)用于重金屬的毒性研究，通過(guò)暴露實(shí)驗(yàn)，從小球藻某些生理指標(biāo)來(lái)衡量重金屬毒性[22]。

本文通過(guò)研究原始多壁碳納米管(original multi-walled carbon nanotubes, P-MWCNTs)及羥基化多壁碳納米管(hydroxylated multi-walled carbon nanotubes, MWCNTs-OH)對(duì)蛋白核小球藻(Chlorellapyrenoidosa)葉綠素a含量、比生長(zhǎng)速率μ、可溶性蛋白質(zhì)含量、總抗氧化能力值(total antioxidant capacity, T-AOC)和丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量的影響，探究原始多壁碳納米管及羥基化多壁碳納米管對(duì)蛋白核小球藻毒性效應(yīng)機(jī)制，為評(píng)估2種類(lèi)型多壁碳納米管對(duì)藻類(lèi)的生物學(xué)效應(yīng)及其環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)積累提供一定的數(shù)據(jù)資料和科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

蛋白核小球藻(FACHB-5)購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院野生生物種質(zhì)庫(kù)——淡水藻種庫(kù)。在超凈臺(tái)中，將藻種轉(zhuǎn)接到滅菌之后的BG11培養(yǎng)基中，在25 ℃、光照度3 000～4 000 lux、光周期12 h Light/12 h Dark的光照培養(yǎng)箱(RXZ型智能人工氣候箱，寧波，江南儀器廠)中，每天定時(shí)搖瓶3次培養(yǎng)。BG11培養(yǎng)基配方如Wu等[23]在其文獻(xiàn)中所述。

P-MWCNTs的物化參數(shù)為：納米管外徑(OD)10～20 nm，內(nèi)徑(ID)5～10 nm，納米管長(zhǎng)度(length) 10～30 μm，比表面積(SSA)>150 m2·g-1，純度>98wt%；MWCNTs-OH的物化參數(shù)為：OD 10～20 nm，ID 5～10 nm，length 10～30 μm，SSA>170 m2·g-1，純度>98wt%。二者購(gòu)自中科時(shí)代納米成都有機(jī)化學(xué)有限公司。將定量的P-MWCNTs和MWCNTs-OH分散到BG11培養(yǎng)基中，配成4 mg·L-1的母液，再滅菌待用。由于P-MWCNTs和MWCNTs-OH均不溶于水，水系中分散性不佳，在水中靜置會(huì)沉至容器底部，實(shí)驗(yàn)使用前置于超聲波清洗機(jī)(KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗機(jī)，200 W、40 kHz，昆山超聲儀器有限公司)超聲20 min，使得2種類(lèi)型的MWCNTs分散液更為均勻?？扇苄缘鞍踪|(zhì)、T-AOC和MDA試劑盒購(gòu)自南京建成生物科技有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 MWCNTs表征

P-MWCNTs和MWCNTs-OH結(jié)構(gòu)表征前在100 ℃烘箱中干燥24 h。熱重分析(TGA)研究材料的熱穩(wěn)定性，掃描電鏡(SEM)表征碳納米管的微觀形貌結(jié)構(gòu)。

1.2.2 藻種的擴(kuò)大培養(yǎng)

取處于對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期的蛋白核小球藻(Chlorellapyrenoidosa)，在無(wú)菌條件下轉(zhuǎn)接到BG11培養(yǎng)基中，于上述藻培養(yǎng)條件下活化7 d，再進(jìn)一步擴(kuò)大培養(yǎng)以滿(mǎn)足實(shí)驗(yàn)需求。

1.2.3 暴露實(shí)驗(yàn)

本文參照OECD201藻類(lèi)生長(zhǎng)抑制實(shí)驗(yàn)方法，將蛋白核小球藻接種在滅菌后的三角錐形瓶中，其初始藻接種藻密度為1 000 000 cells·mL-1，再分別加入定量P-MWCNTs和MWCNTs-OH母液，使最終實(shí)驗(yàn)濃度為0、5、10、20、40、80 mg·L-1，在光照度3 000～4 000 lux、光周期12 h Light/12 h Dark的光照培養(yǎng)箱中暴露96 h。每組實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)平行。

1.2.4 比生長(zhǎng)速率的測(cè)定

自實(shí)驗(yàn)接種之日起，每隔24 h取樣，用血球計(jì)數(shù)板在顯微鏡下測(cè)定藻細(xì)胞密度N(cells·mL-1)。利用如下公式計(jì)算比生長(zhǎng)速率μ。

式中：μ—為比生長(zhǎng)速率(d-1)；Nt—T時(shí)刻的藻細(xì)胞密度(cells·mL-1)；N0—初始藻細(xì)胞密度(cells·mL-1)；T—暴露時(shí)間(d)。

1.2.5 葉綠素a的測(cè)定

在實(shí)驗(yàn)室條件下，葉綠素a與生物量呈顯著正相關(guān)關(guān)系[24]。從0 h到96 h每天定時(shí)取5 mL藻液，8 000 r·min-1離心10 min，棄上清液，加入5 mL 90%丙酮(V/V)，搖勻，放入冰箱，4 ℃避光萃取24 h以提取蛋白核小球藻細(xì)胞中的葉綠素a；把萃取過(guò)后的葉綠素a提取液置于高速離心機(jī)中，10 000 r·min-1離心10 min取上清液，以90%丙酮作為參比，置于分光光度計(jì)中測(cè)定上清液在波長(zhǎng)分別為630 nm、645 nm、663 nm和750 nm時(shí)的吸光度。葉綠a含量采用周永欣等[25]的方法計(jì)算：

C=11.64×A663-A750-2.16×A645-A750+0.10×A630-A750

式中：C—樣品葉綠素含量(μg·mL-1)；V1—提取液體積(mL)；V2—藻液體積(mL)；N—藻細(xì)胞密度(cells·mL-1)。

1.2.6 可溶性蛋白質(zhì)、T-AOC和MDA含量的測(cè)定

在實(shí)驗(yàn)第96小時(shí)分別取每個(gè)錐形瓶中藻液40 mL，4 500 r·min-1離心10 min，棄上清液，用5 mL生理鹽水懸浮洗滌2～3次以除去附著在蛋白核小球藻表面的培養(yǎng)基，再離心，之后就可得到藻細(xì)胞。然后把藻細(xì)胞轉(zhuǎn)移至研缽中，加入2 mL預(yù)冷的生理鹽水和少量的石英砂進(jìn)行冰浴研磨，直到鏡檢無(wú)完整藻細(xì)胞為止，定容到10 mL，4 ℃下5 000 r·min-1離心10 min，上清液即為樣本提取粗酶液?？扇苄缘鞍缀繙y(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)法[26]，T-AOC測(cè)定采用鐵離子還原能力法(FRAP法)[27]，MDA含量測(cè)定采用硫代巴比妥酸法(TBA法)[26]。

圖1 多壁碳納米管(MWCNTs)TGA和SEM表征圖注：TGA為熱重分析；DTA為差熱分析法；SEM表示掃描電子顯微鏡。1-1和1-2為原始多壁碳納米管(P-MWCNTs)的TGA和SEM的表征圖； 1-3和1-4為羥基化多壁碳納米管(MWCNTs-OH)的TGA和SEM的表征圖。Fig. 1 The TGA curve and SEM image of multi-walled carbon nanotubes (MWCNTs)Note: TGA stands for thermogravimetric analysis; DTA stands for differential thermal analysis; SEM stands for scanning electron microscope. Figure 1-1 and figure 1-2 show the TGA curve and SEM image of original multi-walled carbon nanotubes (P-MWCNTs); figure 1-3 and figure 1-4 show the TGA curve and SEM image of hydroxylated multi-walled carbon nanotubes (MWCNTs-OH).

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 22.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析及t檢驗(yàn)，P<0.05表示有顯著性差異，用*表示。采用Origin進(jìn)行圖表繪制。

2 結(jié)果(Results)

2.1 MWCNTs表征

P-MWCNTs的TGA和SEM表征圖分別如圖1-1和圖1-2所示，MWCNTs-OH的TGA和SEM表征圖分別如圖1-3和圖1-4所示。對(duì)比表征圖可知MWCNTs-OH被截?cái)啵荏w破裂并且開(kāi)口。樣品表面光滑，分散性提高，一部分碳管直徑變厚。P-MWCNTs和MWCNTs-OH的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)穩(wěn)定。

2.2 MWCNTs對(duì)蛋白核小球藻生長(zhǎng)的影響

圖2-1和圖2-2分別顯示了蛋白核小球藻在不同濃度P-MWCNTs和MWCNTs-OH暴露下其比生長(zhǎng)速率變化情況。由圖2-1可知，與對(duì)照組相比，P-MWCNTs濃度分別為5 mg·L-1和10 mg·L-1實(shí)驗(yàn)組的生長(zhǎng)趨勢(shì)一致，它們的比生長(zhǎng)速率都是在72 h達(dá)到最大，96 h后，蛋白核小球藻的生長(zhǎng)都會(huì)有所減緩。當(dāng)P-MWCNTs濃度達(dá)到20 mg·L-1時(shí)，蛋白核小球藻的生長(zhǎng)受到抑制，這種抑制現(xiàn)象也出現(xiàn)在更高P-MWCNTs濃度的實(shí)驗(yàn)組。最小比生長(zhǎng)速率(-0.91 d-1)出現(xiàn)在暴露于80 mg·L-1P-MWCNTs 24 h后的實(shí)驗(yàn)組，這表明80 mg·L-1的P-MWCNTs能對(duì)蛋白核小球藻的生長(zhǎng)產(chǎn)生明顯的抑制作用。由圖2-2可知，與對(duì)照組相比，MWCNTs-OH濃度分別為5 mg·L-1、10 mg·L-1和20 mg·L-1實(shí)驗(yàn)組的生長(zhǎng)趨勢(shì)一致，它們的比生長(zhǎng)速率都是先增加再減小，實(shí)驗(yàn)96 h后比生長(zhǎng)速率又增大，但小于48 h比生長(zhǎng)速率。當(dāng)MWCNTs-OH濃度分別達(dá)到40 mg·L-1和80 mg·L-1時(shí)，蛋白核小球藻的生長(zhǎng)從24 h逐漸受到抑制，且隨著實(shí)驗(yàn)時(shí)間的延長(zhǎng)，蛋白核小球藻的比生長(zhǎng)速率越來(lái)越小。最小比生長(zhǎng)速率(-0.43 d-1)出現(xiàn)在暴露于80 mg·L-1MWCNTs-OH 96 h后的實(shí)驗(yàn)組，這表明80 mg·L-1的MWCNTs-OH亦能對(duì)蛋白核小球藻的生長(zhǎng)產(chǎn)生明顯的抑制作用，且這種抑制作用隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而加強(qiáng)。

圖2 不同濃度P-MWCNTs和MWCNTs-OH對(duì)蛋白核小球藻生長(zhǎng)的影響注：*表示與對(duì)照組相比，P<0.05。Fig. 2 The effects of P-MWCNTs and MWCNTs-OH on the growth of Chlorella pyrenoidosaNote: compared with the control, *P<0.05.

圖3 P-MWCNTs和MWCNTs-OH對(duì)蛋白核小球藻葉綠素a含量的影響Fig. 3 The effects of P-MWCNTs and MWCNTs-OH on the content of chlorophyll a in Chlorella pyrenoidosa

2.3 MWCNTs對(duì)蛋白核小球藻葉綠素a含量的影響

圖3-1和圖3-2分別顯示了蛋白核小球藻在不同濃度P-MWCNTs和MWCNTs-OH暴露下葉綠素a含量的變化情況。由圖3-1可知，暴露在P-MWCNTs 24 h后，與對(duì)照組相比，P-MWCNTs的所有實(shí)驗(yàn)組蛋白核小球藻葉綠素a含量都低于對(duì)照組，P-MWCNTs濃度范圍為0～10 mg·L-1實(shí)驗(yàn)組在實(shí)驗(yàn)48 h內(nèi)葉綠素a含量均有所增長(zhǎng)且較為平緩，48 h后，濃度范圍0～10 mg·L-1實(shí)驗(yàn)組葉綠素a含量增長(zhǎng)速率增大，而濃度范圍為20～80 mg·L-1實(shí)驗(yàn)組的葉綠素a含量從實(shí)驗(yàn)一開(kāi)始就維持在較低水平，與對(duì)照組差異顯著(P<0.05)，且組間差異不顯著(P> 0.05)?？偟膩?lái)說(shuō)，蛋白核小球藻葉綠素a含量呈隨著P-MWCNTs濃度增加而降低的趨勢(shì)，當(dāng)P-MWCNTs濃度≥20 mg·L-1時(shí)，蛋白核小球藻葉綠素a含量一直減少。由圖3-2可知，暴露在MWCNTs-OH 24 h后，與對(duì)照組相比，MWCNTs-OH的所有實(shí)驗(yàn)組蛋白核小球藻葉綠素a含量都低于對(duì)照組，濃度范圍為0～10 mg·L-1實(shí)驗(yàn)組在實(shí)驗(yàn)24 h內(nèi)葉綠素a含量均有所增長(zhǎng)且較為平緩，24 h后，0～20 mg·L-1實(shí)驗(yàn)組葉綠素a含量增長(zhǎng)速率增大，48 h后，0～20 mg·L-1實(shí)驗(yàn)組葉綠素a含量增長(zhǎng)速率又減小，而MWCNTs-OH濃度范圍為40～80 mg·L-1實(shí)驗(yàn)組的葉綠素a含量從實(shí)驗(yàn)一開(kāi)始也維持在較低水平，與對(duì)照組差異顯著(P<0.05)，且組間差異亦不顯著(P>0.05)?？偟膩?lái)說(shuō)，蛋白核小球藻葉綠素a含量呈隨著MWCNTs-OH濃度增加而降低的趨勢(shì)，當(dāng)MWCNTs-OH濃度≥40 mg·L-1時(shí)，蛋白核小球藻葉綠素a含量一直減少。

2.4 MWCNTs對(duì)蛋白核小球藻可溶性蛋白質(zhì)含量的影響

圖4顯示了蛋白核小球藻分別在不同濃度P-MWCNTs和MWCNTs-OH脅迫96 h后可溶性蛋白質(zhì)含量的變化情況。由圖4可知，蛋白核小球藻可溶性蛋白質(zhì)含量整體隨MWCNTs濃度的增加呈先增加后減少的趨勢(shì)。具體而言，當(dāng)?shù)鞍缀诵∏蛟灞┞对?0 mg·L-1和20 mg·L-1MWCNTs-OH實(shí)驗(yàn)條件下，藻細(xì)胞可溶性蛋白質(zhì)含量相對(duì)于對(duì)照組有明顯增加(P<0.05)，而蛋白核小球藻暴露在5 mg·L-1、10 mg·L-1和20 mg·L-1P-MWCNTs實(shí)驗(yàn)條件下，藻細(xì)胞可溶性蛋白質(zhì)含量相對(duì)于對(duì)照組沒(méi)有發(fā)生顯著改變(P>0.05)。當(dāng)?shù)鞍缀诵∏蛟宸謩e暴露在濃度為40 mg·L-1和80 mg·L-1P-MWCNTs和MWCNTs-OH實(shí)驗(yàn)條件下，它們的可溶性蛋白質(zhì)含量明顯低于對(duì)照組(P<0.05)。

2.5 MWCNTs對(duì)蛋白核小球藻總抗氧化能力值的影響

圖5顯示了蛋白核小球藻分別在不同濃度P-MWCNTs和MWCNTs-OH暴露96 h后總抗氧化能力值(T-AOC)的變化情況。由圖5可知，蛋白核小球藻的T-AOC在2種MWCNTs暴露條件下隨著納米材料暴露濃度的增加而減小。與對(duì)照組相比，20 mg·L-1以及更高濃度P-MWCNTs實(shí)驗(yàn)組蛋白核小球藻的T-AOC更小(P<0.05)，而至于MWCNTs-OH實(shí)驗(yàn)組，40 mg·L-1以及更高濃度暴露下的蛋白核小球藻具有更小的T-AOC(P<0.05)。在相同濃度的MWCNTs暴露下，MWCNTs-OHs實(shí)驗(yàn)組的蛋白核小球藻具有比P-MWCNTs實(shí)驗(yàn)組蛋白核小球藻更大的T-AOC。當(dāng)?shù)鞍缀诵∏蛟宸謩e暴露在濃度為5 mg·L-1和10 mg·L-1的2種MWCNTs的實(shí)驗(yàn)條件下，T-AOC變化不顯著(P>0.05)。

圖4 P-MWCNTs和MWCNTs-OH對(duì)蛋白核小球藻可溶性蛋白質(zhì)含量的影響注：*表示實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組差異顯著(P<0.05)。Fig. 4 The effects of P-MWCNTs and MWCNTs-OH on the content of soluble protein in Chlorella pyrenoidosaNote: * indicated that the difference was significant (P< 0.05) between exposure groups and control group.

圖5 P-MWCNTs和MWCNTs-OH對(duì)蛋白核小球藻總抗氧化能力值(T-AOC)的影響注：*表示實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組差異顯著(P<0.05)。Fig. 5 The effects of P-MWCNTs and MWCNTs-OH on the total anti-oxidation capacity (T-AOC) value in Chlorella pyrenoidosaNote: * indicated that the difference was significant (P< 0.05) between exposure groups and control group.

2.6 MWCNTs對(duì)蛋白核小球藻MDA含量的影響

圖6顯示了蛋白核小球藻分別在不同濃度P-MWCNTs和MWCNTs-OH暴露96 h后MDA含量的變化情況。由圖6可知，蛋白核小球藻細(xì)胞MDA含量整體呈隨MWCNTs濃度增大而增加的趨勢(shì)。與對(duì)照組相比，蛋白核小球藻暴露在20 mg·L-1以及更高濃度P-MWCNTs條件下，其MDA含量開(kāi)始顯著增加(P<0.05)；而MWCNTs-OH實(shí)驗(yàn)組，40 mg·L-1以及更高濃度實(shí)驗(yàn)組的蛋白核小球藻MDA含量也開(kāi)始顯著增加(P<0.05)。5 mg·L-1和10 mg·L-1P-MWCNTs以及5 mg·L-1、10 mg·L-1和20 mg·L-1MWCNTs-OH實(shí)驗(yàn)組蛋白核小球藻的MDA含量與對(duì)照組相比沒(méi)有發(fā)生明顯變化(P>0.05)。

圖6 P-MWCNTs和MWCNTs-OH對(duì)蛋白核小球藻 丙二醛(MDA)含量的影響注：*表示實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組差異顯著(P<0.05)。Fig. 6 The effects of P-MWCNTs and MWCNTs-OH on the content of malonlydialdehyde (MDA) in Chlorella pyrenoidosaNote: * indicated that the difference was significant (P< 0.05) between exposure groups and control group.

3 討論(Discussion)

盡管目前碳納米管的實(shí)際環(huán)境濃度并不明確，但是研究者們已經(jīng)著手碳納米管的環(huán)境毒性效應(yīng)研究[28-29]。本實(shí)驗(yàn)中，蛋白核小球藻暴露在10 mg·L-1及以下濃度P-MWCNTs的條件下，其比生長(zhǎng)速率在24～72 h增大，在96 h比生長(zhǎng)速率減小，可能是由于藻細(xì)胞活性在72 h處最大，在96 h后又變得稍弱。而在實(shí)驗(yàn)室條件下，當(dāng)P-MWCNTs濃度達(dá)到20 mg·L-1時(shí)，蛋白核小球藻的比生長(zhǎng)速率從24 h開(kāi)始便為負(fù)數(shù)，說(shuō)明抑制作用變得更強(qiáng)。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，這種抑制作用一直存在。至于這種抑制作用強(qiáng)弱的變化還有待進(jìn)一步研究。當(dāng)?shù)鞍缀诵∏蛟灞┞对跐舛取?0 mg·L-1的MWCNTs-OH條件下，其比生長(zhǎng)速率先增大、后減小、再增大?？傮w上，隨著MWCNTs-OH濃度的增加，每個(gè)計(jì)算時(shí)刻的藻細(xì)胞比生長(zhǎng)速率減小，這可能是因?yàn)镸WCNTs-OH與藻細(xì)胞之間的共沉降作用不穩(wěn)定導(dǎo)致的，此作用還有待進(jìn)一步研究。類(lèi)似的，在實(shí)驗(yàn)室條件下，當(dāng)MWCNTs-OH濃度達(dá)到40 mg·L-1時(shí)，蛋白核小球藻的比生長(zhǎng)速率從24 h開(kāi)始便為負(fù)數(shù)，說(shuō)明蛋白核小球藻的生長(zhǎng)在40 mg·L-1及更高濃度的MWCNTs-OH暴露下，受到了越來(lái)越強(qiáng)的抑制，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，這種抑制作用同樣是一直存在的，且在96 h的抑制作用最強(qiáng)。以上現(xiàn)象表明，2種MWCNTs對(duì)蛋白核小球藻的生長(zhǎng)抑制作用存在著差異，這可能是因?yàn)樵谥苽淞u基化多碳納米管時(shí)引入了新的官能團(tuán)，改變了原始多壁碳納米管的結(jié)構(gòu)，引起了性質(zhì)的差異，導(dǎo)致它們?cè)诃h(huán)境行為的差異。

葉綠素a存在于所有綠色植物體內(nèi)，是葉綠素重要組成成分之一，它能吸收和轉(zhuǎn)換光能。同時(shí)，葉綠素a在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)條件下與藻細(xì)胞生物量有著顯著的正相關(guān)關(guān)系[24]。本實(shí)驗(yàn)中，葉綠素a含量可一定程度代表蛋白核小球藻生物量，而且能在一定程度上反映藻細(xì)胞在納米材料暴露下光合作用的強(qiáng)弱。當(dāng)P-MWCNTs濃度低于20 mg·L-1、MWCNTs-OH濃度低于40 mg·L-1時(shí)，藻細(xì)胞的葉綠素a含量變化明顯。這可能是因?yàn)樵趯?shí)驗(yàn)初期由MWCNTs導(dǎo)致的遮蔽效應(yīng)誘導(dǎo)藻細(xì)胞合成更多的葉綠素，以利于在低光強(qiáng)時(shí)，微藻光合作用接受光子，既而導(dǎo)致葉綠素a含量變化。隨著實(shí)驗(yàn)時(shí)間的延長(zhǎng)，MWCNTs在培養(yǎng)基中的分散趨于穩(wěn)定后，劑量效應(yīng)占主導(dǎo)地位，藻細(xì)胞中葉綠素酯還原酶的合成受到抑制，影響了氨基-γ-酮戊酸的合成，降低了葉綠素含量，繼而抑制了蛋白核小球藻的生長(zhǎng)[30]。

蛋白質(zhì)是生物體的物質(zhì)基礎(chǔ)，亦是酶系統(tǒng)的物質(zhì)基礎(chǔ)，蛋白質(zhì)對(duì)生物體的代謝活動(dòng)起著至關(guān)重要作用[31]。蛋白核小球藻暴露在2種類(lèi)型MWCNTs 96 h后，5 mg·L-1和10 mg·L-1P-MWCNTs實(shí)驗(yàn)組以及5 mg·L-1、10 mg·L-1和20 mg·L-1MWCNTs-OH實(shí)驗(yàn)組的藻蛋白質(zhì)含量均有所增加。這可能是因?yàn)殡S著MWCNTs濃度的增加，藻細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)開(kāi)始積累，為了應(yīng)對(duì)這種環(huán)境脅迫并保持細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生和消除平衡，藻細(xì)胞的抗氧化系統(tǒng)介入，更多的抗氧化酶在胞內(nèi)合成以抵制脅迫，以使細(xì)胞能緩和由脅迫導(dǎo)致的損害。而以上生理過(guò)程中所涉及的酶是細(xì)胞可溶性蛋白質(zhì)的組成部分[30]，所以胞內(nèi)可溶性蛋白質(zhì)含量輕微增加。而當(dāng)?shù)鞍缀诵∏蛟宸謩e暴露在20 mg·L-1P-MWCNTs和40 mg·L-1MWCNTs-OH的實(shí)驗(yàn)條件下，P-MWCNTs和MWCNTs-OH對(duì)蛋白核小球藻產(chǎn)生了一定的毒性效應(yīng)。主要是因?yàn)樵寮?xì)胞的抗氧化系統(tǒng)已不能有效抵御由過(guò)高濃度MWCNTs濃度導(dǎo)致的脅迫。同時(shí)，在過(guò)高濃度的P-MWCNTs或MWCNTs-OH條件下，2種納米材料穿過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的概率大大增加。此外，進(jìn)入藻細(xì)胞內(nèi)的MWCNTs會(huì)增加蛋白質(zhì)水解酶的活性，加速蛋白質(zhì)水解，導(dǎo)致了可溶性蛋白質(zhì)含量減少[32]。

藻類(lèi)的抗氧化防御系統(tǒng)與藻類(lèi)細(xì)胞的機(jī)體健康狀況之間有著緊密聯(lián)系。防御系統(tǒng)分為酶系統(tǒng)和非酶系統(tǒng)，這2種系統(tǒng)協(xié)調(diào)作用，互相依賴(lài)。更強(qiáng)的抗氧化能力表明機(jī)體健康狀態(tài)更好且具有更強(qiáng)的抗脅迫能力。反之，機(jī)體健康狀態(tài)越惡劣且抗脅迫能力更弱。當(dāng)P-MWCNTs濃度低于20 mg·L-1以及MWCNTs-OH濃度低于40 mg·L-1時(shí)，蛋白核小球藻細(xì)胞通過(guò)自己抗氧化系統(tǒng)介入調(diào)節(jié)，以抵御環(huán)境脅迫，藻細(xì)胞健康狀態(tài)良好，因此T-AOC值維持在高水平。當(dāng)P-MWCNTs濃度≥20 mg·L-1以及MWCNTs-OH濃度≥40 mg·L-1時(shí)，蛋白核小球藻細(xì)胞的抗氧化系統(tǒng)已不能有效抵御環(huán)境脅迫，細(xì)胞健康狀況惡化，導(dǎo)致藻細(xì)胞活性降低并出現(xiàn)細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，因此T-AOC值減小。

當(dāng)?shù)鞍缀诵∏蛟迨艿江h(huán)境脅迫時(shí)，細(xì)胞內(nèi)酶系統(tǒng)產(chǎn)生ROS，這些ROS能夠攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸，引發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化，并促進(jìn)合成脂質(zhì)過(guò)氧化物。丙二醛(MDA)，一種脂質(zhì)過(guò)氧化物，間接反映了ROS對(duì)藻類(lèi)細(xì)胞的攻擊嚴(yán)重程度[33]。當(dāng)細(xì)胞的T-AOC變?nèi)鯐r(shí)，藻類(lèi)細(xì)胞的抗氧化系統(tǒng)受到干擾，ROS產(chǎn)生和清除的平衡被破壞，導(dǎo)致藻類(lèi)細(xì)胞的ROS積累加劇和膜脂過(guò)氧化損傷，MDA含量迅速增加。同時(shí)，MDA又會(huì)抑制和降低抗氧化酶的活性和含量。