侯天芳，王廣發(fā)，陳乾華,*

1. 航空總醫(yī)院呼吸科，北京 100012 2. 北京大學(xué)第一醫(yī)院呼吸和危重癥科，北京 100034

流行病學(xué)研究顯示PM2.5與慢性炎癥性疾病的發(fā)病和死亡率增加密切相關(guān)[1-2]，但其致病機(jī)制目前尚不清楚。因此了解PM2.5危害人類健康的機(jī)制，對闡明大氣污染引發(fā)健康損害、死亡及醫(yī)療費用增加具有非常重要的意義。目前已知Th1/Th2的平衡對機(jī)體免疫及健康具有非常重要的意義，其參與許多氣道慢性炎癥性疾病的病理生理過程，也已成為部分疾病例如哮喘等疾病治療的新的靶位[3]，大氣顆粒物對肺部免疫系統(tǒng)有潛在的毒性作用，既往研究表明炎癥及免疫失衡可能是其重要機(jī)制[4-5]。由于流式細(xì)胞術(shù)快速靈活定量的特點，特別是和單克隆抗體結(jié)合應(yīng)用后，在免疫細(xì)胞分型、分選及特性研究方面有著非常重要的作用，本文采用流式細(xì)胞術(shù)檢測大氣細(xì)顆粒物氣管滴注后小鼠肺臟淋巴細(xì)胞亞群Th1/Th2比例，以期為大氣顆粒物誘發(fā)免疫毒理失衡方面的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實驗材料

1.1.1 主要實驗設(shè)備及試劑

所用流式細(xì)胞儀為BD influx，Anti-CD3抗體(Abcam)、Anti-CD4抗體(Abcam)、cell activation cocktail (without Brefeldin A) (Biolegend)、PE-anti-mouse CD4 (Biolegend)、APC-anti-mouse、IL-4 (Biolegend)、PE/Cy7-anti-mouse INF-γ (Biolegend)、固定破膜劑(Biolegend)。

1.1.2 PM2.5顆粒的采集、提取和懸液制備

顆粒物采集：采樣點為北京大學(xué)第一醫(yī)院內(nèi)科樓樓頂，應(yīng)用Staplex PM2.5大流量采樣器，流量為1.13 m3·min-1，流量精度3%，玻璃纖維濾膜(20.3 cm×25.4 cm)收集顆粒物，于2016年1月連續(xù)采樣96 h。

顆粒物提取及PM2.5顆粒物懸液的制備參考既往文獻(xiàn)[6]。于動物實驗前一天用生理鹽水配制不同濃度的細(xì)顆粒物混懸液，超聲振蕩混勻，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆茫褂们霸俅纬曊袷幓靹颉?/p>

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗動物及處理

實驗動物為北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司(生產(chǎn)許可證編號 SCXK(京)2012-0001)提供的28只SPF級8周齡雄性BALB/c小鼠，體重為(25±2) g，在北京大學(xué)第一醫(yī)院動物實驗中心(SYXK(京)2014-0010)飼養(yǎng)于SPF級屏障環(huán)境中。小鼠自由進(jìn)食飼料及飲水。室溫23～25 ℃，12 h光/12 h黑暗(8:00—20:00開燈；20:00—8:00熄燈)，濕度25%～30%。小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后開始實驗。通過了實驗動物福利倫理審查(動物倫理編號：J201609)，根據(jù)PM2.5暴露的劑量不同隨機(jī)分為4組：生理鹽水對照組(NS control group)、PM2.5低劑量暴露組(2.5 mg·kg-1)、PM2.5中劑量暴露組(10 mg·kg-1)及PM2.5高劑量暴露組(20 mg·kg-1)，對照組給予等體積的無菌生理鹽水溶液。建模方法采用氣管滴注，氣管滴注量為50 μL·只-1·次-1，用5%水合氯醛麻醉處理，一周滴注2次，氣管滴注14 d后麻醉處死取材。

1.2.2 肺組織病理學(xué)觀察

氣道滴注末次暴露結(jié)束后24 h內(nèi)過量麻醉處死小鼠。采用氣管灌注10%福爾馬林溶液固定法固定小鼠整個左肺后，左肺重新投入10%福爾馬林固定液再固定24 h，常規(guī)石蠟包埋，后續(xù)進(jìn)行蘇木素-伊紅(HE)染色及免疫組織化學(xué)Envision染色，操作步驟嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

1.2.3 肺臟淋巴細(xì)胞的獲取

全程無菌條件下進(jìn)行操作，用剪刀剪碎肺臟，用10 mL玻璃注射器針芯輕輕捻磨肺臟，加入I型膠原酶加DNase酶消化肺組織細(xì)胞，置于37 ℃恒溫孵育箱消化1 h后，用70 μm無菌細(xì)胞篩網(wǎng)過濾一次后收集肺臟單細(xì)胞懸液至離心管中。用吸管小心吸取肺臟組織單細(xì)胞懸液加于分離液液面上，400～500 g，離心20～30 min，離心后，用吸管小心吸取第二層環(huán)狀乳白色淋巴細(xì)胞層到另一離心管中，向離心管中加入5～10 mL磷酸鹽緩沖液(PBS)液，反復(fù)洗滌2遍，計數(shù)肺臟淋巴細(xì)胞。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測T淋巴細(xì)胞亞群比例

獲取的淋巴細(xì)胞混勻后置于6孔培養(yǎng)皿內(nèi)，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育刺激阻斷6 h。刺激后的細(xì)胞收集，PBS洗2遍，測定細(xì)胞密度1×107mL-1，按照細(xì)胞表面熒光染色方案，進(jìn)行CD4+T淋巴細(xì)胞表面染色后，固定破膜進(jìn)行胞內(nèi)抗體染色，嚴(yán)格按照試劑說明書操作程序進(jìn)行染色。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

圖1 大氣細(xì)顆粒物滴注后肺組織病理學(xué)變化注：(A)對照組肺終末細(xì)支氣管和肺泡上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)；(B)低劑量暴露組肺組織顯示支氣管炎癥、肺間隔增寬和脫落的上皮細(xì)胞(黑色箭頭)；(C和D)高劑量暴露組可見鏡下肺泡巨噬細(xì)胞吞噬顆粒物(黑色短箭頭)和肺泡內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤(黑色長箭頭)；bar=200 μm。Fig. 1 Histopathological changes in lung after an intratracheal instillation of PM2.5Note: (A) A Control lung showing terminal bronchiole and alveolar epithelia; (B) Mice lung instilled with 5 mg·kg-1 PM2.5 showing bronchiole with inflammation, lung widened interval partly and falling off of epithelial cells (black arrow); (C and D ) Mice lung instilled with 20 mg·kg-1 PM2.5 showing alveolar macrophages with engulfed particles (black short arrows) and inflammatory infiltration in bronchiole and alveolar (black long arrow); bar=200 μm.

圖2 大氣細(xì)顆粒物暴露后小鼠肺組織免疫組化結(jié)果Fig. 2 Immunohistochemical results of lung tissue in mice after exposure to fine particulate matter

2 結(jié)果(Results)

2.1 大氣細(xì)顆粒物氣管滴注小鼠后肺組織HE染色病理變化

圖1A可見生理鹽水對照組小鼠細(xì)小支氣管和肺泡結(jié)構(gòu)正常，支氣管粘膜上皮完整，支氣管腔和肺泡腔內(nèi)未見炎性滲出，支氣管腔和肺泡腔內(nèi)未見吞噬顆粒物質(zhì)的巨噬細(xì)胞和明顯的炎細(xì)胞浸潤，無平滑肌的增生和基底膜的增厚。PM2.5暴露小鼠可見彌漫性細(xì)小支氣管和血管周圍炎性細(xì)胞的浸潤，包括中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤，有淋巴濾泡的形成，未見明顯嗜酸粒細(xì)胞增多。氣道上皮有不同程度的脫落，上述改變在中高劑量組小鼠的肺組織較為明顯。高劑量暴露組細(xì)小支氣管粘膜上皮增生明顯，圖1C可見大量吞噬顆粒物質(zhì)的肺泡巨噬細(xì)胞(塵細(xì)胞)，有的塵細(xì)胞已經(jīng)浸潤到肺泡腔中，圖1D可見淋巴細(xì)胞浸潤。

2.2 大氣細(xì)顆粒物氣管滴注小鼠肺組織免疫組化染色結(jié)果

HE病理結(jié)果顯示在中高劑量暴露組中，鏡下可見大量的淋巴細(xì)胞浸潤，因此我們選取了中高劑量暴露組進(jìn)行免疫組化染色，如圖2所示，小鼠經(jīng)PM2.5高劑量暴露后肺組織光鏡下可見免疫炎性細(xì)胞明顯浸潤，染色結(jié)果提示圖2A深棕色著色區(qū)(陽性表達(dá))為CD3+T細(xì)胞，圖2B棕色著色區(qū)(陽性表達(dá))為CD4+T細(xì)胞，bar=100 μm。

2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測肺臟細(xì)胞Th1/Th2比例變化

通過流式細(xì)胞術(shù)檢測肺臟淋巴細(xì)胞Th1/Th2亞群變化，結(jié)果顯示與生理鹽水對照組相比，低中劑量時，隨著暴露劑量的增加，Th1亞群有增高趨勢，但是差異無統(tǒng)計學(xué)意義；Th2亞群在不同暴露組之間差異亦有統(tǒng)計學(xué)意義；但是，隨著暴露劑量的增加，結(jié)果顯示Th1/Th2比值逐漸增高，尤其中高劑量PM2.5暴露后差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(見表1)。

3 討論(Discussion)

研究發(fā)現(xiàn)北京市冬季霧霾呈現(xiàn)重污染反復(fù)出現(xiàn)的特點[7]，這與國內(nèi)外其他城市的大氣污染特征有所不同[8]。形成霧霾的主要成分是高濃度的大氣細(xì)顆粒物，其危害也最為嚴(yán)重。研究表明PM2.5是北京地區(qū)的主要污染物之一[9]，污染水平有明顯的季節(jié)變化規(guī)律，且冬季和春季的污染水平較高[10]。PM2.5是一類大小形態(tài)不同、表面成分復(fù)雜的懸浮顆粒。PM2.5表面附著有大量的有毒物質(zhì)，如金屬元素、過渡金屬元素、非金屬元素、有機(jī)生物元素和碳元素等多種復(fù)雜成分[11]，其中金屬元素和過渡金屬元素作為北京市PM2.5的主要成分[12-13]，對人體健康造成的危害最為突出[14]。毒理學(xué)研究證實多種過渡金屬(包括Fe、Ni、Cu和Zn)能夠促發(fā)氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，從而誘導(dǎo)生物學(xué)危害[15-16]。本研究中所使用的PM2.5收集于北京中心城區(qū)近主干道區(qū)域，具有監(jiān)測代表性，本研究課題所檢測的重金屬和過渡金屬均為大氣細(xì)顆粒物的主要有毒成分[17-20]。由于PM2.5化學(xué)特性極為復(fù)雜，其成分以及含量不同引起的生物毒理特性也不同[21-22]。值得注意的是，近年來發(fā)現(xiàn)過渡金屬元素可以誘發(fā)機(jī)體免疫炎性損傷[23-24]。

本研究采用HE染色、免疫組化及流式細(xì)胞學(xué)等方法，探究PM2.5暴露誘發(fā)肺部淋巴細(xì)胞的失衡。首先，小鼠肺組織HE病理研究發(fā)現(xiàn)小鼠經(jīng)PM2.5暴露后，隨著暴露劑量的增大及暴露次數(shù)的增多，支氣管黏膜上皮出現(xiàn)不同程度的增生，氣道上皮不同程度的脫落，肺泡間隔增寬，以及不同程度的淋巴細(xì)胞聚集及吞噬顆粒的巨噬細(xì)胞浸潤。此外，肺組織免疫組化染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)各中高劑量組CD3+T淋巴細(xì)胞和CD4+T淋巴細(xì)胞大量聚集，提示淋巴細(xì)胞參與炎癥反應(yīng)過程。研究發(fā)現(xiàn)Th1/Th2細(xì)胞平衡在調(diào)控機(jī)體免疫功能方面起到關(guān)健作用，其在免疫相關(guān)的肺損傷疾病中是一對重要的調(diào)節(jié)細(xì)胞[25-27]。

本研究通過流式細(xì)胞術(shù)對PM2.5暴露后的小鼠肺臟T淋巴細(xì)胞亞群進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示中高劑量PM2.5暴露后小鼠肺臟細(xì)胞中Th1/Th2比值增大，因此提示這種暴露模式有助于Th1占優(yōu)勢的免疫應(yīng)答。近年來相關(guān)研究亦發(fā)現(xiàn)PM2.5誘發(fā)的肺部損傷中存在免疫失衡狀態(tài)[28]。這為今后大氣細(xì)顆粒物暴露誘發(fā)的肺部疾病提供理論指導(dǎo)，研究發(fā)現(xiàn)Th細(xì)胞的分化受多種因素的影響[29]，如抗原的種類和濃度、抗原提呈細(xì)胞的類型和局部微環(huán)境的作用等。盡管大氣顆粒物的暴露劑量、顆粒大小和組成有所不同，PM2.5暴露仍在不同程度上誘發(fā)淋巴細(xì)胞亞群比例失衡[30]。另有研究發(fā)現(xiàn)PM2.5暴露刺激人類肺泡巨噬細(xì)胞后致使Th1相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)增高，而Th2相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)水平下降[31]，亦有研究發(fā)現(xiàn)動物暴露于大氣顆粒物后支氣管肺泡灌洗液中Th2相關(guān)細(xì)胞因子反而增高[32]，這種T淋巴失衡方向的不完全統(tǒng)一，考慮與研究設(shè)計、PM2.5表面復(fù)雜的成分及暴露后時相不同等有關(guān)。

表1 流式細(xì)胞術(shù)檢測肺臟細(xì)胞Th1/Th2比例結(jié)果Table 1 The result of Th1/Th2 in mice lung detected by flow cytometry n=7)

注：與對照組比較，*P<0.05。

Note: *P<0.05, compared with the control group.

本文通過流式細(xì)胞術(shù)檢測大氣細(xì)顆粒物氣管滴注后小鼠肺細(xì)胞中Th1/Th2比例，高劑量暴露后小鼠肺臟淋巴細(xì)胞亞群向Th1偏移，為進(jìn)一步了解大氣顆粒物誘發(fā)免疫毒理失衡方面奠定科學(xué)基礎(chǔ)。