李崗，吳聲敢,2,3,4，蔡磊明,2,3,4,*

1. 浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究所,杭州 310021 2. 浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)業(yè)部農(nóng)藥檢測重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,杭州 310021 3. 浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 浙江省農(nóng)藥殘留檢測與控制研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,杭州 310021 4. 浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 浙江省植物有害生物防控省部共建國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地,杭州 310021

1 發(fā)明與發(fā)展(Devised and developing comet assay)

彗星實(shí)驗(yàn)(comet assay)也叫單細(xì)胞凝膠電泳實(shí)驗(yàn)(single cell gel electrophoresis, SCGE)，是瑞典科學(xué)家O. Ostling和K.J. Johanson于1984年發(fā)明，刊登在期刊《生物化學(xué)與生物物理研究通訊》上，當(dāng)初叫“微電泳技術(shù)(microelectrophoresis)”。實(shí)驗(yàn)中，把鼠淋巴細(xì)胞L5178Y-S和中國倉鼠的成纖維細(xì)胞C1-1懸浮，進(jìn)行物理輻照后，包埋在瓊脂糖膠中，在中性緩沖液中裂解細(xì)胞，接著在5 V·cm-1電場中電泳5 min，再用吖啶橙染色，最后用熒光顯微鏡鏡檢。發(fā)現(xiàn)DNA向陽極遷移，輻照后的細(xì)胞更明顯，還發(fā)現(xiàn)受輻照細(xì)胞能在1 h內(nèi)修復(fù)超過50%的損傷[1]。

1988年彗星實(shí)驗(yàn)迎來第一次重大改進(jìn)。Singh進(jìn)一步發(fā)明了低水平損傷DNA的定量檢測技術(shù)，把人白細(xì)胞暴露于X射線和H2O2后，瓊脂糖膠包埋，接著裂解和電泳都改為堿性條件下進(jìn)行，因?yàn)橹行约?xì)胞裂解液和中性電泳液不能檢測單鏈斷裂類型的DNA損傷。改進(jìn)后發(fā)現(xiàn)，H2O2處理的DNA遷移模式比X射線的要整齊和同質(zhì)(homogeneous)。不同類型的細(xì)胞對DNA損傷的修復(fù)能力有很大差異。Singh改進(jìn)后的彗星實(shí)驗(yàn)技術(shù)適用檢測單個(gè)細(xì)胞DNA損傷和修復(fù)，所需細(xì)胞少，1 000個(gè)就足夠，細(xì)胞不需要放射性標(biāo)記，因此，此法適用于任何有核細(xì)胞。還能檢測同一種群的細(xì)胞對DNA損傷物的不同反應(yīng)[2]，此后，1990改名為彗星實(shí)驗(yàn)[3]。

1993年彗星實(shí)驗(yàn)又一次改進(jìn)。1993年以前，彗星實(shí)驗(yàn)只能檢測DNA是否有斷裂損傷，不能分辨非斷裂損傷，不能確定DNA損傷類型。改進(jìn)后的彗星實(shí)驗(yàn)，可以確定氧化型非斷裂損傷。即解旋后用核酸內(nèi)切酶Ⅲ(thymine glycol DNA glycosylase-Endo III, endonuclease III)處理DNA，可識別氧化損傷的嘧啶[4-6]。同樣，用甲酰氨嘧啶DNA糖基化酶fpg (formamidopyrimidine DNA glycosylase, fpg)處理后，可識別氧化損傷的嘌呤[7]，如8-氧鳥嘌呤，這些酶可造成氧化損傷部位的DNA斷裂，增加慧尾的含量。因此，可用酶切慧星實(shí)驗(yàn)檢測非斷裂型DNA氧化損傷，如用Ro19-8022和可見光(主要產(chǎn)生8-氧鳥嘌呤)暴露肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549，在細(xì)胞裂解后，用fpg處理類核體30 min或45 min，可顯著增加慧尾的濃度[8-9]。fpg修飾的彗星實(shí)驗(yàn)檢測大鼠的不同組織細(xì)胞暴露于甲基磺酸甲酯(methyl methanesulfonate, MMS)后，產(chǎn)生高水平的氧化的或烷基化的堿基或fpg傷口[10]?？寡趸瘎ρ趸瘬p傷DNA的影響實(shí)驗(yàn)表明，非吸煙健康人連續(xù)12周暴露在不同的類胡蘿卜素單體下，其淋巴細(xì)胞的內(nèi)源性氧化損傷并沒有受到顯著影響，未見高水平的DNA斷裂損傷[11]，混合維生素C、維生素E和?胡蘿卜素干預(yù)非吸煙人和吸煙人，可顯著降低二者淋巴細(xì)胞的內(nèi)源性DNA氧化損傷[12]，而吸煙人的高水平的氧化堿基在20 d后消失了，發(fā)現(xiàn)抗氧化劑的種類和劑型對氧化損傷的DNA修復(fù)有潛在的影響，如維生素C的緩釋劑型和快釋劑型對DNA損傷修復(fù)的效果不同，男性吸煙者只攝入緩釋型維生素C可以顯著減少fpg或核酸內(nèi)切酶Ⅲ識別的損傷位點(diǎn)[13]。改進(jìn)后的酶切彗星實(shí)驗(yàn)還能提供基因的遺傳多態(tài)性相關(guān)的遺傳背景與環(huán)境因子信息，如著色性干皮病(xeroderma pigmentosum group D, XPD)基因的編碼區(qū)312-751，純合野生型基因型的彗尾密度比癌癥病人低2倍，暗示維持正常的DNA修復(fù)活性能抑制癌癥的發(fā)生和發(fā)展[14]。

彗星實(shí)驗(yàn)常和微核實(shí)驗(yàn)同時(shí)進(jìn)行，從不同角度探索毒物的損傷效應(yīng)。彗星實(shí)驗(yàn)主要測定原始的DNA斷裂損傷，而微核實(shí)驗(yàn)測定的是DNA不可修復(fù)的損傷，這些損傷是非修復(fù)的或不正確修復(fù)的損傷。2種實(shí)驗(yàn)的結(jié)果常呈正相關(guān)。例如，非洲爪蟾幼蛙暴露在甲基磺酸乙酯(ethyl methanesulfonate, EMS)后造成其紅細(xì)胞DNA損傷和微核率增加[15]。彗星實(shí)驗(yàn)還和其他指標(biāo)如活性氧(ROS)結(jié)合，探索毒性機(jī)制，如乙草胺通過誘導(dǎo)ROS造成花背蟾蜍(Strauchbuforaddei)的DNA損傷，同時(shí)發(fā)現(xiàn)N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl-l-cysteine, NAC)和褪黑素(melatonin, MEL)可減輕乙草胺造成的DNA損傷[16]。

自從Singh提出堿性彗星實(shí)驗(yàn)后，在遺傳毒性檢測中得到快速發(fā)展。1999年，歐洲國家成立了一個(gè)彗星實(shí)驗(yàn)專家組，一致推薦Singh的堿性彗星實(shí)驗(yàn)作為檢測化學(xué)品遺傳毒性的標(biāo)準(zhǔn)方法，該法經(jīng)優(yōu)化后，可用于檢測單鏈斷裂的DNA損傷、堿性不穩(wěn)定位點(diǎn)、DNA-DNA或DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)損傷和單鏈斷裂的不完全切除修復(fù)位點(diǎn)。其特點(diǎn)是：可檢測低水平的DNA損傷，只需少量細(xì)胞，靈活經(jīng)濟(jì)，簡便快速，例如檢測DNA損傷的修復(fù)能力。DNA損傷的修復(fù)類型有(1)切除修復(fù)。包括切除堿基缺失位點(diǎn)、8氧鳥嘌呤、單鏈斷裂缺口、大體積的加合物和環(huán)丁烷嘧啶二聚體等，切除修復(fù)路徑主要受翻譯后修飾調(diào)控[17]。(2)重組修復(fù)。修復(fù)的是雙鏈斷裂的缺口和鏈間交聯(lián)。(3)錯(cuò)配修復(fù)。修復(fù)的是堿基的錯(cuò)配、插入或缺失[18-19]。細(xì)胞應(yīng)對DNA損傷，通過激活復(fù)雜的信號通路來決定細(xì)胞的命運(yùn)，或者促進(jìn)細(xì)胞死亡，或修復(fù)損傷而存活[20]。盡管細(xì)胞存在這些修復(fù)機(jī)制，但是DNA的損傷依然保持在較高的水平，至少在健康的人體中是這種情況。DNA的修復(fù)能力可看作是突變或癌癥的有價(jià)值的標(biāo)志物，因?yàn)椴畹男迯?fù)能力與高風(fēng)險(xiǎn)的癌癥相關(guān)，例如，頭頸鱗狀癌細(xì)胞的DNA修復(fù)能力就很差[21]。DNA的修復(fù)潛能經(jīng)常用DNA芯片或RT-PCR方法，測定修復(fù)通路基因的轉(zhuǎn)錄水平，但是它的酶活性不僅依賴轉(zhuǎn)錄或翻譯水平，還要依賴表型分析的結(jié)果[22]。檢測修復(fù)過程動(dòng)態(tài)的最簡單的方法是進(jìn)行彗星實(shí)驗(yàn)，暴露于DNA損傷物后，在不同的時(shí)間點(diǎn)取樣測定，進(jìn)行挑戰(zhàn)實(shí)驗(yàn)(challenge assay)。例如，用水溶性的?胡蘿卜素或番茄紅素培養(yǎng)的淋巴細(xì)胞，暴露在博來霉素(bleomycin)或H2O2下，結(jié)果表明?胡蘿卜素能保護(hù)DNA鏈，防止其斷裂，但是不能阻止其堿基的氧化損傷[23]。而?隱黃素(β-cryptoxanthin)能保護(hù)HeLa細(xì)胞和Caco-2細(xì)胞免受H2O2誘導(dǎo)的DNA損傷，呈現(xiàn)明顯的DNA修復(fù)效應(yīng)。因此，標(biāo)準(zhǔn)的彗星實(shí)驗(yàn)可用來測定細(xì)胞對DNA損傷的修復(fù)能力。

2000年，歐洲食品安全局主張采用系列實(shí)驗(yàn)來評估化學(xué)品的遺傳毒性，即首先對化學(xué)品進(jìn)行細(xì)菌回復(fù)突變實(shí)驗(yàn)(后采用OECD TG471準(zhǔn)則[24])和體外微核實(shí)驗(yàn)(后采用OECD 487[25])，只要有一個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果呈陽性，再進(jìn)行3個(gè)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，包括哺乳動(dòng)物紅細(xì)胞微核實(shí)驗(yàn)(即OECD TG474準(zhǔn)則[26])、彗星實(shí)驗(yàn)(即OECD TG489準(zhǔn)則[27])和轉(zhuǎn)基因嚙齒動(dòng)物細(xì)胞基因突變實(shí)驗(yàn)(即OECD TG488準(zhǔn)則[28])。

2014年，經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織(OECD)專門發(fā)布哺乳動(dòng)物體內(nèi)彗星實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)則即OECD TG489[27]，內(nèi)容包括實(shí)驗(yàn)原理、局限性、對照信息、方法的詳細(xì)描述和彗星圖象定量打分(推薦采用的自動(dòng)和半自動(dòng)軟件)。其中重要的是對細(xì)胞彗星圖象進(jìn)行定義，分成3類，可打分的(scorable)，非打分的(non-scorable)和刺猬形(hedgehog)?？纱蚍值腻缧羌?xì)胞定義為慧核和慧尾清晰且不與其他細(xì)胞重疊的細(xì)胞。彗星評價(jià)采用慧尾DNA的百分?jǐn)?shù)或慧尾強(qiáng)度(tail intensity, TI)，表示DNA的斷裂量，再結(jié)合校正曲線和已知條件即每個(gè)Gy可誘導(dǎo)每109Dalton DNA中0.3個(gè)斷裂，可計(jì)算實(shí)際DNA的斷裂頻率，校正曲線是gamma射線或X-ray的劑量(0～10 Gy)為自變量與慧尾DNA的百分?jǐn)?shù)為因變量之間建立的線性關(guān)系[29-30]。刺猬形細(xì)胞DNA也叫鬼魂細(xì)胞(ghost cell)或云狀細(xì)胞，認(rèn)為它是一種嚴(yán)重?fù)p傷的細(xì)胞(慧核小或不存在，大的彌散狀尾巴)。通過圖像分析得到的TI不可靠，對刺猬細(xì)胞應(yīng)該單獨(dú)評價(jià)，它的形成機(jī)制還不清楚。大鼠肝細(xì)胞彗星實(shí)驗(yàn)表明，它可能是破碎細(xì)胞時(shí)的機(jī)械損傷或試劑誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性[31]。刺猬形彗星也不能認(rèn)為是凋亡細(xì)胞或細(xì)胞毒性。這樣的慧星常表示連續(xù)的DNA損傷，應(yīng)該對其進(jìn)行全面評估[32]。

2 技術(shù)要點(diǎn)(Methodical critical steps)

彗星實(shí)驗(yàn)經(jīng)過不斷改進(jìn)，其共同基本步驟包括制備懸浮細(xì)胞、凝膠包埋、細(xì)胞裂解、解旋、電泳、中和、染色和圖象分析。體外彗星實(shí)驗(yàn)，先獲得懸浮細(xì)胞后暴露處理。體內(nèi)彗星實(shí)驗(yàn)，制備懸浮細(xì)胞前實(shí)驗(yàn)個(gè)體進(jìn)行暴露處理。其中實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵步驟應(yīng)包括：

2.1 制備懸浮細(xì)胞

獲得懸浮細(xì)胞因物種而異。人、鼠、魚等常從其循環(huán)系統(tǒng)中獲取細(xì)胞，如血細(xì)胞或淋巴細(xì)胞。

蚯蚓的小細(xì)胞常用于彗星實(shí)驗(yàn)，小細(xì)胞來自蚯蚓的體腔液，是體腔液中含量最豐富的細(xì)胞，類似于脊椎動(dòng)物的白細(xì)胞。蚯蚓體腔細(xì)胞的收集方法，包括提取液法、穿刺法、電擊法和超聲波法等[27,33]。其中提取液法最常用，其包含：5 mmol·L-1Na2-EDTA(乙二胺四乙酸)或EGTA(乙二醇二乙醚二胺四乙酸)、50.4 mmol·L-1或10 mg·mL-1愈創(chuàng)木酚甘油醚、95%生理鹽水(即0.85 g NaCl溶于每100 mL H2O)或磷酸鹽緩沖液(PBS)和5%乙醇或甲醇，pH 7.3～7.5。其中EDTA或EGTA和生理鹽水或PBS的作用是維持活細(xì)胞正常活性。愈創(chuàng)木酚甘油醚的作用在于溶解細(xì)胞粘液，釋放細(xì)胞。乙醇或甲醇的作用刺激蚯蚓釋放體腔液。

植物彗星實(shí)驗(yàn)最大困難是獲得懸浮細(xì)胞或類核，常用根和葉進(jìn)行[34-35]，實(shí)驗(yàn)方案因組織或物種而異[36]，通常的堿性溶液提取方法不能從植物細(xì)胞中釋放完整的DNA，用機(jī)械破碎或化學(xué)處理的方法可對DNA造成新的損傷，葉片中的高濃度色素如葉綠素和代謝物對分離DNA可能造成新的損傷，所以，棄用葉片細(xì)胞而選用根尖細(xì)胞，但是高頻率分裂的細(xì)胞對實(shí)驗(yàn)又產(chǎn)生影響。盡管植物細(xì)胞彗星實(shí)驗(yàn)比較困難，但是也有成功的例子，例如Cr(VI)對豌豆(Pisumsativum)DNA損傷實(shí)驗(yàn)[37]，Cd-Zn對煙草的影響[38]。

目前認(rèn)為懸浮細(xì)胞中的活細(xì)胞應(yīng)不少于70%～75%，才能得到可靠的結(jié)果[39]，通常用苔盼藍(lán)染色法檢測活細(xì)胞百分?jǐn)?shù)。

2.2 凝膠包埋

常用低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠包埋細(xì)胞，在三層膠法中，還用正常熔點(diǎn)凝膠固定低熔點(diǎn)膠，防止在后繼的浸泡步驟中膠從載膠板上脫落。所以，低熔點(diǎn)膠的濃度至關(guān)重要。不同人外周淋巴細(xì)胞和淋巴母細(xì)胞系TK-6的結(jié)果表明，膠濃度在0.6%～0.8%比較合適，太低，膠不穩(wěn)定，太高，損害慧尾。膠濃度與慧尾長度呈明顯的線性關(guān)系。損傷細(xì)胞對膠濃度更敏感。膠不能反復(fù)熔化，應(yīng)該分裝保存[40]。OECD建議低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠為0.5%～1%，不建議低于0.45%(OECD 489)[27]。

2.3 細(xì)胞裂解

對包埋在低熔點(diǎn)膠中的完整細(xì)胞進(jìn)行裂解，常用細(xì)胞裂解液的通用配方是：10 mmol·L-1Tris-HCl，100 mmol·L-1Na2EDTA，2.5 mol·L-1NaCl，10% 二甲基亞砜(DMSO)，1% Triton X-100，pH 10，裂解條件是4 ℃、至少60 min。其中Tris-HCl是緩沖體系，維持穩(wěn)定的pH值。Na2EDTA是變性劑和穩(wěn)定劑。DMSO是DNA保護(hù)劑，防止自由基對DNA的損傷。Triton X-100是表面活性劑，破壞細(xì)胞，類似的有SDS(十二烷基硫酸鈉，一種強(qiáng)變性劑和蛋白溶解劑)和肌氨酸鈉(sodium carcosinate)，也有在裂解液中加入蛋白酶K和氯化鈣，如提高對口哨蛙(Eleutherodactylusjohnstonei)細(xì)胞的裂解能力[41-42]。

表1 OECD 489推薦的彗星實(shí)驗(yàn)陽性對照及其靶組織Table 1 Positive control substances and its target tissues in comet assay recommended by OECD 489

注： OECD 489為經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織在2014年9月26日發(fā)布的化學(xué)品試驗(yàn)導(dǎo)則：哺乳動(dòng)物體內(nèi)堿性彗星試驗(yàn)。

Note: OECD 489 has been published by OECD on 26th September 2014. It is a guideline for the testing of chemicals:invivomammalian alkaline comet assay.

2.4 堿性解旋

解旋液和電泳液是同一種溶液，OECD 489建議配方和條件是：1 mmol·L-1Na2EDTA，300 mmol·L-1NaOH，pH≥13，4 ℃至少解旋20 min，電泳條件是4 ℃，0.7 V·cm-1，20～40 min。DNA遷移與電泳時(shí)間呈線性相關(guān)。對人外周淋巴細(xì)胞和淋巴母細(xì)胞系TK-6，以電壓1.15 V·cm-1，電泳20 min為佳，低于0.49 V·cm-1，慧尾不能展開，大于1.48 V·cm-1，慧尾從慧核上斷離，人為增加損傷程度[40]，需要記住的常識是，同樣的電泳遷移距離時(shí)，單位電壓與時(shí)間的乘積是個(gè)常數(shù)。

2.5 細(xì)胞密度

彗星的數(shù)量或密度影響圖像分析與評價(jià)，因此細(xì)胞或彗星不能重疊，以免影響彗星計(jì)分。為便于統(tǒng)計(jì)分析，需要對至少50個(gè)細(xì)胞進(jìn)行圖象分析。而有效實(shí)驗(yàn)?zāi)芙o出定性判斷的最少細(xì)胞數(shù)為30個(gè)。

2.6 陽性對照

彗星實(shí)驗(yàn)必須設(shè)置陰性對照和陽性對照，保證實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的合理性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性和有效性。OECD 489推薦的哺乳動(dòng)物常用陽性對照，包括甲基磺酸乙酯(EMS)等，見表1。

這些陽性對照，可能也適用于非哺乳動(dòng)物，如海鱒(Salmotrutta)和北極嘉魚(Salvelinusalpinus)的精細(xì)胞暴露在甲基磺酸甲酯(MMS)中，可造成DNA損傷，并且后代的骨胳發(fā)育異常，表明這種損傷具有遺傳性[43]。三刺魚(Gasterosteusaculeatus)精子在體外受精前，體外暴露在MMS中，可造成后代的胚胎發(fā)育異常[44]。另外，4-硝基喹啉N-氧化物(4-Nitroquinoline N-oxide)是模式遺傳效應(yīng)毒物，會造成斑馬魚DNA損傷和產(chǎn)卵量下降[45-46]。

成功的彗星實(shí)驗(yàn)要考慮3個(gè)方面因素，一是細(xì)胞的類型如淋巴細(xì)胞、生殖細(xì)胞或細(xì)菌細(xì)胞、二是誘導(dǎo)物類型如X射線、伽馬射線、乙醇、乙醛、疾病、生活類型因素。三是方法學(xué)因素如電泳槽、載膠板、分析參數(shù)等。

3 典型應(yīng)用(Main application field)

用“comet assay”作關(guān)鍵詞在2016年的PubMed和Web of Science中搜索，可得近萬篇期刊文章。涉及的主要應(yīng)用領(lǐng)域包括：毒理學(xué)30%，遺傳學(xué)15%，環(huán)境生態(tài)科學(xué)11%和應(yīng)用微生物技術(shù)9%。彗星實(shí)驗(yàn)還有專門的交流網(wǎng)站http://www.cometassay.com/。

3.1 兩棲動(dòng)物彗星實(shí)驗(yàn)

綠蛙(Lithobatesclamitans)和非洲爪蟾(Xenopuslaevis)等的成體或幼體的紅細(xì)胞常用于體內(nèi)彗星實(shí)驗(yàn)，見表2。

測定的毒物效應(yīng)包括，除草劑[42]、殺蟲劑[47]、MMS[15]、EMS[15]、苯并芘[15]、硫化染料[48]、金屬[49]、石油化工產(chǎn)物[50]、持久性有機(jī)污染物(persistent organic pollutants, POPs)[51]、抗生素[41]、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)[41]、污染的湖水[52]、煤礦[53]、垃圾場[54]、污泥[55]、污水[56-57]、城市固體廢物的焚燒物[58]和電磁場的影響[59]等。

兩棲動(dòng)物彗星實(shí)驗(yàn)方案，差別較大。1997年之后的實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞裂解液中才開始含有洗滌劑(表面活性劑)如Triton X-100、DMSO、SDS、肌氨酸鈉、蛋白酶K和氯化鈣等，來提高對細(xì)胞的裂解能力。細(xì)胞裂解時(shí)間25 min至7 d。細(xì)胞裂解溫度是4 ℃，而2005年之前是室溫。低熔點(diǎn)瓊脂糖濃度通常為0.5%，范圍通常是0.4%～1.0%，濃度越高，慧尾越少[60]。解旋變性通常是pH>13條件下5～40 min，時(shí)間越長，慧尾越多[60]。電泳電壓是18～27 V，電流是300 mA，也有用V·cm-1表示的。這些實(shí)驗(yàn)方案的差異，限制了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可比性。

3.2 魚類彗星實(shí)驗(yàn)

最早的魚類彗星實(shí)驗(yàn)是用加拿大五大湖的棕鲴魚(brown bullhead，Ameiurusnebulosus)和普通鯉魚(common carp，Cyprinuscarpio)對湖中沉積物的暴露實(shí)驗(yàn)，提取它們的紅細(xì)胞進(jìn)行singh于1988年提出的堿性彗星實(shí)驗(yàn)[61]。魚的血細(xì)胞是最常用的彗星實(shí)驗(yàn)材料，因?yàn)橐椎?，易分離，而且所有魚的血液細(xì)胞都是有核細(xì)胞。而其他組織細(xì)胞如肝、腎、腮[62-64]、精細(xì)胞[65]也經(jīng)常用于彗星實(shí)驗(yàn)[65]。魚的酶切彗星實(shí)驗(yàn)首次運(yùn)用是在2003年[66]，涉及的細(xì)胞有：血細(xì)胞、肝細(xì)胞、腮細(xì)胞[67]和細(xì)胞系[68]等。

截止2017年，已經(jīng)有90多種魚用于彗星實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)類型有體內(nèi)實(shí)驗(yàn)(invivo)[69]、體外實(shí)驗(yàn)(invitro)[68]、離體實(shí)驗(yàn)(exvivo)[44]和原位實(shí)驗(yàn)(insite)[70]。涉及的毒物包括POPs[71]、金屬[64]、農(nóng)藥[72]、藥物[73]、內(nèi)分泌干擾物如四溴雙酚-A[74]、納米顆粒[75]、生物毒素[76]、核輻射[77]和紫外線[78]等。

魚類像兩棲類一樣，也沒有標(biāo)準(zhǔn)的彗星實(shí)驗(yàn)方案，見表3。但是，魚的室內(nèi)實(shí)驗(yàn)和野生魚的生物監(jiān)測實(shí)驗(yàn)中，要求使用標(biāo)準(zhǔn)的采樣方案[79]。

表3 常見魚類彗星實(shí)驗(yàn)條件Table 3 Summary of comet assay parameters on fish

注：nm表示原文未提到。

Note: nm stands for not mentioned.

注：CeO2-NP表示CeO2納米顆粒。

Note: CeO2-NP stands for CeO2Nano particles; DNAse stands for deoxyribonuclease; BCPAP stands for a papillary thyroid cancer-derived cell line.

3.3 蚯蚓彗星實(shí)驗(yàn)

蚯蚓的小細(xì)胞常用于彗星實(shí)驗(yàn)，小細(xì)胞來自蚯蚓的體腔液，是體腔液中含量最豐富的細(xì)胞，類似于脊椎動(dòng)物的白細(xì)胞。蚯蚓體腔細(xì)胞的收集方法，包括提取液法、穿刺法、電擊法和超聲波法等[33]。

有多種蚯蚓用于彗星實(shí)驗(yàn)，如Eiseniafetida[80]、Amynthasdiffringens[81]、Aporrectodeacaliginosa[82]、Dendrodrilusrubidus[81]、Lumbricusterrestris[83]和Microchaetusbenhami[81]等，其中E.fetida是最常用的品種，為OECD和美國環(huán)境保護(hù)局(EPA)推薦，E.fetida和A.caliginosa對污染物有相同的敏感性[82]，而D.rubidus對重金屬Cd最敏感，其次是E.fetida[81]，例見表4。

3.4 哺乳動(dòng)物精細(xì)胞彗星實(shí)驗(yàn)

哺乳動(dòng)物的彗星實(shí)驗(yàn)，人和鼠最常見，涉及的細(xì)胞主要是血細(xì)胞和淋巴細(xì)胞，其他還有心、肝、肺、腎、腦、骨髓等細(xì)胞，例見表5和表6。

常用改進(jìn)的彗星實(shí)驗(yàn)檢測精子的DNA損傷與不孕的關(guān)系[84]，叫做二維垂直慧尾彗星實(shí)驗(yàn)TT-comet (two-dimensional perpendicular tail comet assay, TT-comet)，適合區(qū)分單鏈斷裂和雙鏈斷裂的精細(xì)胞[85]。精細(xì)胞和體細(xì)胞對相同毒物的反應(yīng)差別很大，因?yàn)轶w細(xì)胞的異染色質(zhì)是組蛋白而精細(xì)胞的則是精蛋白[86]。因此，去除對照的DNA結(jié)合蛋白的裂解條件具有物種的特異性，不同物種的精細(xì)胞DNA的結(jié)構(gòu)不同，因而，不同物種的TT-comet條件各不相同，需要摸索。一般，去除蛋白的精細(xì)胞DNA先進(jìn)行中性電泳，產(chǎn)生雙鏈斷裂的慧尾，然后轉(zhuǎn)膠90度，進(jìn)行堿性電泳，產(chǎn)生單鏈斷裂的或堿不穩(wěn)定的慧尾。

4 存在的問題與注意點(diǎn)(Questions and defects)

(1)大部分已經(jīng)發(fā)表的文獻(xiàn)，彗星實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)缺少陽性對照，降低了實(shí)驗(yàn)的正確性和合理性?？蓞⒖糘ECD 489推薦的彗星實(shí)驗(yàn)陽性對照(見表1)。另外，文獻(xiàn)中提供的彗星實(shí)驗(yàn)圖片較少，只有統(tǒng)計(jì)圖表，這樣說服力不強(qiáng)，降低了文章的可靠性，在引用時(shí)需要注意。還需要了解的是，2016年以前的彗星實(shí)驗(yàn)，以低通量為主，一次實(shí)驗(yàn)的處理數(shù)和重復(fù)數(shù)設(shè)置都不是太多。

(2)彗星實(shí)驗(yàn)方案不統(tǒng)一，每種生物基本沒有標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)方案，限制了結(jié)果的可比性。不同物種，不同細(xì)胞類型使用同一種實(shí)驗(yàn)，可能導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗，例如，在蚯蚓體腔細(xì)胞的彗星實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞裂解液中的Triton-100濃度采用通常值1%，就不合適(未發(fā)表)，很難得到完美的實(shí)驗(yàn)圖象。

(3)DNA鏈的斷裂損傷類型因組織和細(xì)胞類型而異[87]。因此，不能用血細(xì)胞DNA損傷類型和程度來推斷其他細(xì)胞DNA的損傷。如，用彗星實(shí)驗(yàn)比較細(xì)鱗鯻(Theraponjarbua)的腮細(xì)胞、腎細(xì)胞和血細(xì)胞對氯化汞損傷的敏感性，結(jié)果表明腮細(xì)胞最敏感、腎細(xì)胞次之、血細(xì)胞最不敏感[88]。同樣，不能用不同類型的細(xì)胞進(jìn)行修復(fù)能力的相互推斷[60]，如劍尾魚(Xiphophorusspecies)腦部細(xì)胞對核苷酸切除修復(fù)能力大于腮部和肝部細(xì)胞[89]。

(4)注意細(xì)胞周期對彗星實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。細(xì)胞處于不同周期如S期或M期，進(jìn)行彗星實(shí)驗(yàn)，都能進(jìn)行損傷測定[90-91]，在堿性條件下S期的DNA遷移速度比中性條件下快，因?yàn)樵趬A性條件下S期的DNA呈復(fù)制叉狀，類似單鏈斷裂DNA，而在中性條件下呈復(fù)制泡狀[92]。

(5)運(yùn)用彗星實(shí)驗(yàn)結(jié)果評價(jià)毒物的DNA毒性時(shí)，還必須考慮非毒物相關(guān)因子，包括生物的和非生物因子對彗星實(shí)驗(yàn)的影響。例如，水中缺氧或氧過飽和時(shí)，都能增加鯉魚(Cyprinuscarpio)的DNA損傷，幅度約為正常氧濃度的20%[93]。激流中生活的白鮭(Leuciscuscephalus)DNA損傷會增加，暗示生活在污染激流中的魚面臨更為嚴(yán)重的DNA損傷風(fēng)險(xiǎn)[67]。實(shí)驗(yàn)生物的年齡、性別等對彗星實(shí)驗(yàn)結(jié)果也有影響，如成年法國比目魚(Limandalimanda)面對同樣的毒物，雄性DNA損傷比雌性高，幼魚則相反，成年魚比幼魚高[94]。此外，需要評估組織取樣時(shí)使用的麻醉劑對DNA可能造成損傷。但是，苯唑卡因(benzocaine)對羅非魚(Niletilapia)的彗星實(shí)驗(yàn)結(jié)果無影響[95]。