石聰，李世瑞，李跑，廖盧艷，蔣立文*

1(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科技學(xué)院，湖南 長沙，410128) 2(食品科學(xué)與生物技術(shù)湖南省重點實驗室 ，湖南 長沙，410128)

瀏陽豆豉是我國特色發(fā)酵大豆制品之一，低鹽或無鹽，是淡豆豉(SemenSojaepraeparatum)的典型代表之一，為藥食兩用發(fā)酵大豆制品。以黑豆作為原料，蒸熟后自然發(fā)酵7～15 d，加入一定比例的水適當(dāng)洗曲后堆積發(fā)酵，至產(chǎn)生特殊的香氣，曬干脫水后而成。目前包括瀏陽豆豉在內(nèi)的淡豆豉研究報告涉及到微生物的選育[1-4]、發(fā)酵工藝的選擇[5-8]、發(fā)酵過程品質(zhì)與淡豆豉炮制與藥效的關(guān)系[9-11]等，其中對功能因子大豆異黃酮變化的研究最多。

目前關(guān)于傳統(tǒng)發(fā)酵產(chǎn)品微生物群體演變規(guī)律及不同階段微生物作用研究是人們關(guān)注的熱點[12-16]。本研究對傳統(tǒng)發(fā)酵的瀏陽豆豉中幾個主要階段微生物變化，采用454高通量測序方法，研究其微生物變化，探討可能與品質(zhì)相關(guān)的優(yōu)勢微生物，為這種藥材或食材的質(zhì)量穩(wěn)定提供可靠的微生物信息，實現(xiàn)多菌種混合發(fā)酵的穩(wěn)態(tài)化發(fā)酵工藝，再將品質(zhì)與藥材種炮制指標(biāo)和食用時的色香味聯(lián)系起來，為發(fā)揚該產(chǎn)業(yè)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

來源于湖南瀏陽某豆豉廠，為春秋季節(jié)制作。具體工藝見文獻(xiàn)[17]。用于樣品測試的成熟曲，洗曲濾干后發(fā)酵3 d和15 d，分別編號為LY01、LY02、LY03，樣品在無菌條件下包裝，于-80 ℃冷凍保藏備用。

1.2 樣品處理方法

1.2.1 微生物總DNA的提取與純化

(1)使用OMEGA公司E.Z.N.A Soil DNA試劑盒抽提DNA。

(2)基因組DNA的鑒定：抽提的基因組DNA經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，DNA無明顯降解、濃度合適、無雜質(zhì)，方可進(jìn)入下一步試驗。

(3)PCR擴(kuò)增：按指定測序區(qū)域(細(xì)菌選用 V1-V3 區(qū)通用引物)，合成帶有“5’ 454 A、B接頭-特異引物3’”的融合引物。

PCR擴(kuò)增引物，正向引物為：27F: 5′-AGAGTTTGATCCTGGCT-CAG-3′；反向引物為：533R: 5 ′-TTACCGCGGCTGCTG-GCAC-3′。真菌選定ITS區(qū)，合成帶有“5′454 A、B接頭-特異引物3′”的融合引物，A為測序端，需加標(biāo)簽，B端引物可共用。以樣品總DNA為模板，真菌基因組DNA采用真菌通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCG G-3′)ITS4(5′-TCG-3′)ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR采用TransGen AP221-02: TransStart Fastpfu DNA Polymerase。20μL 反應(yīng)體系：5×Fastpfu Buffer 4 μL；2.5 Mm dNTPs 2 μL；正向引物(5 μmol/L) 0.4 μL/0.8 μL；反向引物(5 μmol/L) 0.4 μL/0.8 μL；FasterPfu Polymerase 0.4 μL； DNA模板 10 ng；補去離子水至20 μL PCR儀：ABI GeneAmp?9700型；細(xì)菌和真菌PCR擴(kuò)增程序為：95 ℃預(yù)變性2 min(95 ℃變性30 s；55 ℃退火30 s；72 ℃延伸30 s);25個循環(huán)，72 ℃延伸5 min。每個樣品3個重復(fù)，將統(tǒng)一樣品的PCR產(chǎn)物混合后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用 AxyPrepDNA 凝膠回收試劑盒(AXYGEN公司)切膠回收PCR產(chǎn)物，Tris_HCL洗脫；2%瓊脂糖電泳檢測。

(4)熒光定量：參照電泳初步定量結(jié)果，將PCR產(chǎn)物用QuantiFluor-ST藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)(Promega公司)進(jìn)行檢測定量，之后按照每個樣品的測序量要求，進(jìn)行相應(yīng)比例的混合。

(5)EmPCR：按照 Roche GS FLX Titanium emPCR Kits 的操作進(jìn)行。

(6)測序：上海美吉生物公司進(jìn)行測序。

1.2.2 生物信息分析[18-20]

OTU聚類：使用Qiime(vsesion 1.17 http://qiime.org/)軟件平臺對測序結(jié)果進(jìn)行修剪、篩選、匹配和分析等。

物種分類學(xué)分析：基于Qiime平臺(http://qiime.org/scripts/assign_taxonomy.html)，RDP Classifiere(version 2.2 http://sourceforge.net/projects/rdp-classifier)，采用RDP classifier 貝葉斯算法對97%相似水平的OTU代表序列進(jìn)行分類學(xué)分析，并在各個水平(kingdom，phylum，class，order，family，genus)統(tǒng)計每個樣品的群落組成。比對采用SILVA(version115 http://www.arb-silva.de)的核糖體數(shù)據(jù)庫，置信度閾值為0.7。

2 結(jié)果與討論

樣品采集完成后，經(jīng)過基因組DNA的鑒定，試驗采用Tm55 ℃、25個循環(huán)確認(rèn)PCR產(chǎn)物目的條帶大小正確、濃度合適，證明樣品合格后進(jìn)行相關(guān)的后續(xù)擴(kuò)增等程序。鑒定門(Phylum)、綱(Class)、目(Order)、科(Family)、屬(Genus)5個水平的群落組成。

表1 三個階段不同微生物群落水平結(jié)果Table 1 Microbial flora level in difference fermentation stage

2.1 瀏陽豆豉釀制主要階段真菌變化情況

前期相對較少的霉菌開始在表面繁殖，從門的水平開始有所增加，綱、目的種類增加，均有接近20%的無法分類，在屬的水平大量出現(xiàn)了曲霉、青霉、根霉、酵母菌等，出現(xiàn)12個屬，尚有接近18.07%無法分類，前期制曲成熟時根霉屬占90.93%，橫梗霉屬、曲霉屬、青霉屬排其后，經(jīng)過洗曲發(fā)酵3 d后大部分橫梗霉屬占優(yōu)，并出現(xiàn)假絲酵母，洗曲的工序微生物屬有增加，堆積發(fā)酵15 d后屬類大量增加，出現(xiàn)絲衣霉菌屬、嗜熱子囊菌屬、毛孢子菌屬、畢赤酵母屬、德巴利酵母屬等，這說明在后期發(fā)酵過程中時間越長，隨著發(fā)酵體系的營養(yǎng)越來越豐富，代謝溫度比較適宜，微生物種類越來越多，微生物的繁殖與產(chǎn)品品質(zhì)的關(guān)聯(lián)度值得關(guān)注。

2.2 瀏陽豆豉發(fā)酵過程中3個階段不同水平細(xì)菌的分布情況

根據(jù)瀏陽豆豉制作工藝及發(fā)酵特點，一般前期制曲為自然發(fā)酵，溫度隨季節(jié)不同進(jìn)行控制，在32 ℃發(fā)酵3～7 d不等；洗曲是瀏陽豆豉制作的關(guān)鍵工序，有減少產(chǎn)品苦味的作用；洗曲后濾干的堆積發(fā)酵是決定風(fēng)味品質(zhì)的必然階段，形成產(chǎn)品特殊風(fēng)味和藥用價值關(guān)鍵在于此。洗曲后堆積的產(chǎn)品品質(zhì)存在一定的差異性。

可以看出，制曲發(fā)酵成熟的曲料中微生物的門水平除還有0.93%的無法確認(rèn)外，主要包括厚壁菌門、擬桿菌門、放線細(xì)菌門、變形菌門、藍(lán)細(xì)菌門等。其中厚壁菌門占87.36%。綱水平桿菌占87.26%，具有絕對優(yōu)勢；依次還有放線細(xì)菌綱、變形菌綱、擬桿菌綱、產(chǎn)黃菌綱等共計10個綱水平(含有其他綱0.17%，未知分類0.94%)。除其他的具有0.82%外，未知的2.26%，目水平共計16種，主要包括桿菌目、乳桿菌目、微球菌目等?？频乃椒N類更多，達(dá)到25種，尚有其他科1.57%，未知3.59%，其主要科的比例按照含量依次為：桿菌科(62.49%)、腸球菌科(16.6%)、短桿菌科(6.65%)、金黃色葡萄球菌科(4.56%)、微球菌科(1.05%)、鏈球菌科(1.02%)等。具體到屬水平，從圖1可以看出，前期制曲完成后微生物屬種類很多，包括桿菌屬、腸球菌屬、金黃色葡萄球菌屬、短桿菌屬、乳球菌屬等，至少包括22個屬。

圖1 LY01細(xì)菌屬的水平分布餅圖Fig.1 The pie chart of LY01 bacterium abundance on genus level

從圖2可以看出瀏陽豆豉堆積發(fā)酵過程中不同微生物分類的水平差異。發(fā)酵3 d的微生物門、綱沒有發(fā)生根本變化，只是比例有所變化，但其目、科、屬的數(shù)量明顯增加，分別達(dá)到10、21、20。到目的水平與制曲成熟相比，目水平的分別是：乳桿菌目占77.82%，桿菌目為9.96%，微球菌目5.4%，腸細(xì)菌目1.98%，黃桿菌目1.17%。科的水平主要包括：腸球菌科為39.38%，明串珠菌科為21.68%，乳桿菌科14.64%，桿菌科7.36%，短桿菌科4.89%，金黃色葡萄球菌科為2.23%。

圖2 LY02細(xì)菌屬的水平分布餅圖Fig.2 The pie chart of LY02 bacterium abundance on genus level

結(jié)合圖2對比發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過洗曲后屬的水平發(fā)生很大變化。在屬水平上乳桿菌屬、芽孢桿菌屬、微球菌屬、腸桿菌屬等比例高，這說明在后期發(fā)酵中這些微生物在品質(zhì)與風(fēng)味中有很重要的作用[23]。

從分析得到結(jié)果和發(fā)酵15 d的細(xì)菌屬水平圖3可以看出，這個階段除無法分類和可能存在其他類別外，門、綱、目、科、屬水平分別達(dá)到6、10、18、28、27個。堆積發(fā)酵時間延長，門的種類增加2個，綱的水平中桿菌綱占86.15%，變形菌綱占接近6%，放線菌綱2.94%，鞘氨醇桿菌綱1.56%，黃桿菌綱1.39%。桿菌目占55.28%，乳桿菌目為30.49%，兩者占目水平的絕對優(yōu)勢。在科的水平上，鏈球菌科占24.39%，嗜熱放線菌科5.08%，腸膜明串珠菌科3.2%，還有大量的腸球菌科、乳桿菌科、腸桿菌科等，其比例均在1%以上。芽孢桿菌屬、乳球菌屬、魏斯氏菌屬、腸球菌、葡萄球菌等占比重很高，微生物種類的變化與發(fā)酵過程中微生物相互作用有關(guān)[23]。堆積發(fā)酵時間延長，細(xì)菌種類和比例有所變化，這種變化與體系發(fā)酵程度變化有關(guān)。一方面代謝不斷進(jìn)行，氨基酸態(tài)氮和酸度明顯發(fā)生變化，另外就是堆積發(fā)酵溫度變化明顯，但表面與固態(tài)基質(zhì)內(nèi)部差異較大，這種差異對瀏陽豆豉品質(zhì)會產(chǎn)生一定的影響。

圖3 LY03細(xì)菌屬的水平分布餅圖Fig.3 The pie chart of LY03 bacterium abundance on genus level

2.3 微生物分布

從試驗結(jié)果可知，真菌及本身根霉屬、曲霉屬、根毛霉、橫梗霉屬等類別，清洗前后差別很大，堆積發(fā)酵期間時間不同真菌差異很大，這和酵母菌大量出現(xiàn)有關(guān)[24]。而相對于細(xì)菌，芽孢桿菌在其中占據(jù)絕對優(yōu)勢，其他乳酸桿菌、球菌、腸球菌、乳球菌、鏈球菌、桿菌等在整個發(fā)酵過程中均存在，只是所占比例差異較大，這說明細(xì)菌在瀏陽豆豉風(fēng)味品質(zhì)形成過程中有重要影響[25]。

2.4 微生物多樣性聚類分析heatmap圖

從圖4和圖5看，聚類分析LY01和LY02基本接近，而LY03則與其他兩個樣品差距較大，說明堆積發(fā)酵時間越長，微生物的菌相差別較大，一方面堆積時間延長，酶的水解加劇，發(fā)酵體系溫度升高，其次由于一般是敞口發(fā)酵，溫度變化導(dǎo)致微生物本身耐熱情況不同而出現(xiàn)微生物的交替變化，三是表面發(fā)酵情況與深層發(fā)酵之間具有差異性。

圖4 真菌多樣性的聚類分析熱Fig.4 Heatmap under class level of fungi diversity

圖5 細(xì)菌多樣性的聚類分析熱圖Fig.5 Heatmap under class level of bacterium diversity

真菌差異大主要是前期以根霉、曲霉、青霉為主，但洗曲后酵母菌大量出現(xiàn)，而細(xì)菌種類呈現(xiàn)多樣化，包括乳桿菌、腸桿菌等，這將對質(zhì)量穩(wěn)定有重要影響，因此如果作為藥用必須考慮后發(fā)酵時間與藥效之間的關(guān)聯(lián)[26-27]。

2.6 樣品中細(xì)菌群落共享和獨有的OTUs的 VEEN分析

從圖6和圖7可以看出，對于細(xì)菌數(shù)量而言，LY01、LY02、LY03三個樣品的OTU總數(shù)分別為：781、846、934；真菌數(shù)量的OTU圖分別為：55、39、91。細(xì)菌有142個OTUS是共有的，真菌只有7個。隨著發(fā)酵時間延長，細(xì)菌數(shù)量大幅度增加，而真菌則在洗曲之后稍有下降后急劇增加，這與發(fā)酵程度有關(guān)。

圖6 樣品中細(xì)菌群落共享和獨有的OTUs的 VEEN分析Fig.6 Veendiagram representation of the shared and exclusive OTUs among samples of bacterium

圖7 樣品中真菌群落共享和獨有的OTUs的VEEN分析Fig.7 Veendiagram representation of the shared and exclusive OTUs among samples of fungi

2.7 微生物多樣性稀釋性曲線

使用97%相似度的OTU利用mothur軟件做稀疏性分析，利用R語言工具制作細(xì)菌變化曲線(圖8、圖9)。

圖8 樣品中細(xì)菌變化稀釋曲線Fig.8 Bacterium changes rarefaction curve of samples

圖9 樣品中真菌變化稀釋曲線Fig.9 Fungi changes rarefaction curve of samples

LY02無論是細(xì)菌還是真菌相對來說反映的樣品信息比較有限，細(xì)菌數(shù)量變化LY01、LY03有些類似，但豐度LY03高得多。相比之下真菌的豐度均不及細(xì)菌的20%，真菌的相對豐度則LY03比LY01要多得多，堆積發(fā)酵時間對品質(zhì)影響較大。

2.8 微生物樣品97%范圍內(nèi)細(xì)菌和真菌多樣性變化

2.8.1 不同發(fā)酵階段細(xì)菌多樣性變化

從表2結(jié)果來看，細(xì)菌的有效讀數(shù)數(shù)量較高，其中LY01相對較少，但從H和D值來看，微生物多樣性是隨著發(fā)酵時間延長，LY03的H值最大而D值最低，說明其多樣性比前兩者均大，這說明發(fā)酵時間控制非常重要。

表2 不同發(fā)酵階段細(xì)菌多樣性變化規(guī)律(97%)Table 1 Variation within a 97% range of the bacterium diversity of the different stages

2.8.2 不同發(fā)酵階段真菌多樣性變化

從數(shù)據(jù)顯示來看，真菌的有效讀數(shù)數(shù)量堆積發(fā)酵LY02最少，堆積發(fā)酵LY03比前發(fā)酵還要多，但從H和D值來看，微生物真菌多樣性是隨著發(fā)酵時間延長而增加，LY01、LY02、LY03的H值逐步增大而D值逐漸降低。

表3 不同發(fā)酵階段真菌多樣性變化規(guī)律(97%)Table 3 Variation within a 97% range of the fungi diversity of the different stages

3 結(jié)論

從采用454高通量測序的結(jié)果來看，豆豉發(fā)酵過程中的微生物無論是細(xì)菌還是真菌均顯示了多樣性，并且有益和有害微生物均出現(xiàn)在微生物類別中。既有我們所需要的根霉、曲霉、毛霉、芽孢桿菌、乳酸菌等對發(fā)酵有益的微生物，但也出現(xiàn)了青霉、曲霉中個別屬等，可能影響產(chǎn)品質(zhì)量和安全的微生物，這有待進(jìn)一步研究。

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