葉小漢 呂洪雪 吳錦波

523000 東莞市中醫(yī)院心內(nèi)科

基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)及其組織抑制因子(tissue inhibitor of matrix metalloproteinases，TIMP)是膠原代謝的重要調(diào)節(jié)因子[1]。中藥心康方功能宣肺平喘、降氣利水、益氣活血，能改善慢性心力衰竭(chronic heart failure，CHF)患者心功能、降低N末端B型利鈉肽原(N-terminal pro B-type natriuretic peptide，NT-proBNP)、增加6 min步行距離、提高生活質(zhì)量[2]；可降低心臟MMP-2、MMP-9、TIMP-1和TIMP-2的基因表達(dá)水平，降低膠原容積分?jǐn)?shù)(collagen volume fraction，CVF)，但其機(jī)制尚不清楚[3]。本研究通過復(fù)制大鼠心力衰竭模型，觀察中藥心康方對(duì)CHF大鼠膠原代謝的影響，進(jìn)一步探討中藥心康方的作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性6周齡[體重(240±15)g] Sprague Dawley(SD)大鼠60只，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(粵)2013-0020，動(dòng)物合格證號(hào)：NO.440059000。SPF級(jí)凈化空間，生長條件為12 h/12 h光照周期，溫度(22±3)℃，相對(duì)濕度40%～70%，自由攝食、飲水。

1.1.2 藥物與試劑 按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與人體表面積比例進(jìn)行藥物劑量換算，大鼠中藥劑量采用換算劑量的2倍。中藥心康方由葶藶子15 g、杏仁10 g、茯苓15 g、黃芪15 g、陳皮5 g、三菱10 g組成，中藥飲片購自東莞市藥材公司，由東莞市中醫(yī)院制成流浸膏，并濃縮至0.13g生藥/ml，-20℃保存。

卡托普利(中美上海施貴寶)；阿霉素(Medchemexpress LLC)；氯胺酮(福建古田藥業(yè))；地西泮(天津金耀藥業(yè))；二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)試劑盒(碧云天)；抗β-actin、Lamin B、Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor beta 1，TGF-β1)、核因子κB的抑制蛋白(inhibitor of nuclear factor kappa B，IκB)、p56、MMP-2、MMP-9、TIMP-1和TIMP-2抗體(Abcam)；增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光(enhanced chemiluminescence，ECL)顯色液(美國Millipore)；Bestar qPCR RT Kit(德國DBI)。

1.1.3 主要儀器 HP5500心臟超聲儀(美國惠普)；GDS7600凝膠掃描系統(tǒng)(英國UVP)；Agilent Stratagene PCR儀Mx3000P(美國安捷倫)。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物造模和分組[4]雄性SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，采用阿霉素腹腔注射法(用滅菌注射用水溶解成0.25 mg/ml溶液，每次注射劑量為2.5 mg/kg，2周內(nèi)分6次注射，總劑量15 mg/kg)建立大鼠心力衰竭模型。首次腹腔注射5周后超聲心動(dòng)圖檢測左心室短軸縮短率(fractional shortening，F(xiàn)S)，以心腔擴(kuò)大，F(xiàn)S<30%作為心力衰竭成模標(biāo)準(zhǔn)。從60只大鼠中隨機(jī)選取10只作為對(duì)照組，予腹腔注射10 ml/kg生理鹽水；其余50只大鼠用于造模，將造模成功的大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組、心康方組和卡托普利組，分別以蒸餾水(10 ml/kg)、心康方中藥浸膏(10 ml·kg-1·d-1)和卡托普利(13.5 mg·kg-1·d-1)灌胃，每天1次，連續(xù)35 d。

1.2.2 大鼠心功能和左室重構(gòu)指標(biāo)的檢測 分別于第6周(干預(yù)前)和第12周(干預(yù)后)采用腹腔注射氯胺酮(50 mg/kg)和地西泮(5 mg/kg)混合麻醉大鼠，超聲心動(dòng)圖測量左室舒張末期容積(left ventricular end-diastolic volume，LVEDV)、左室收縮末期容積(left ventricular end-systolic volume，LVESV)、心排血量(cardiac output，CO)、FS和左心室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fraction，LVEF)。并于第12周超聲心動(dòng)圖檢查后，立即注射2 mmol/L氯化鉀，使大鼠心臟停搏在舒張末期，迅速開胸離斷心臟，PBS沖洗干凈后，顯微解剖分離左心室，稱重，計(jì)算左心室質(zhì)量指數(shù)(left ventricular mass index，LVMI)。

1.2.3 Masson染色檢測心肌膠原沉積 取大鼠心室組織常規(guī)固定，石蠟包埋、切片；脫蠟，Wayer蘇木素染5 min；麗春紅酸性品紅液染5 min；1%磷鉬酸水溶液處理5 min；苯胺藍(lán)液復(fù)染1 min。應(yīng)用IPP 6.0病理圖像分析軟件分析各組膠原纖維表達(dá)，計(jì)算CVF(CVF=膠原面積/總面積)。

1.2.4 Western blot檢測心肌Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、TGF-β1、IκB、p56、MMP-2、MMP-9、TIMP-1和TIMP-2的表達(dá) 取心肌組織冰上裂解1 h，提取細(xì)胞內(nèi)蛋白，BCA法蛋白定量。取各組蛋白樣品進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜后用牛血清蛋白封閉，經(jīng)Ⅰ抗結(jié)合后洗膜，Ⅱ抗結(jié)合，洗膜后ECL顯色，軟件分析。以Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、TGF-β1、IκB、MMP-2、MMP-9、TIMP-1和TIMP-2的平均灰度值與相應(yīng)內(nèi)參照蛋白β-actin的平均灰度值的比值表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量，p56的內(nèi)參照蛋白為Lamin B。

1.2.5 RT-qPCR檢測心肌MMP-2、MMP-9、TIMP-1和TIMP-2的mRNA表達(dá) 心肌組織勻漿后，Trizol法抽提總RNA，Agilent Stratagene PCR儀Mx3000P進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。PCR反應(yīng)條件為反轉(zhuǎn)錄94℃滅活反轉(zhuǎn)錄酶和預(yù)變性2 min，94℃變性20 s，58℃退火20 s，72℃延伸20 s，PCR擴(kuò)增40循環(huán)。以β-actin作為內(nèi)參基因，采用2-△△Ct公式計(jì)算mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。引物設(shè)計(jì)及PCR反應(yīng)均由廣州維伯鑫生物科技有限公司完成。PCR引物見表1。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 一般情況

采用阿霉素腹腔注射法造模共50只，造模過程中有15只大鼠因出現(xiàn)重度心力衰竭和肝硬化腹水而死亡，死亡率為30.0%；FS不達(dá)標(biāo)5只，成模率為60.0%。30只造模成功大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分成3組：模型組、心康方組和卡托普利組，每組10只，在隨后的實(shí)驗(yàn)干預(yù)中，每組各有1只大鼠因灌胃不當(dāng)而死亡。CHF大鼠出現(xiàn)不同程度的食欲減退、精神較差、張口呼吸和乏力等癥狀。干預(yù)前，各組成模大鼠平均體重和FS差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05)；對(duì)照組大鼠平均體重和FS均高于各造模組(均為P<0.01)，見表2。

表1 RT-qPCR引物序列

表2 各組大鼠體重和FS比較

注：與對(duì)照組比較，aP<0.01

2.2 大鼠心功能和左室重構(gòu)指標(biāo)

干預(yù)后，模型組大鼠的FS、CO和LVEF顯著低于對(duì)照組，LVEDV、LVESV和LVMI顯著高于對(duì)照組(均為P<0.01)；心康方組和卡托普利組的FS、CO和LVEF顯著高于模型組(均為P<0.01)，LVEDV、LVESV和LVMI顯著低于模型組(均為P<0.01)，見表3。

2.3 大鼠心肌CVF和心肌Ⅰ型、Ⅲ型膠原的表達(dá)

表3 各組大鼠心功能和左室重構(gòu)指標(biāo)的比較

注：與對(duì)照組比較，aP<0.01；與模型組比較，bP<0.01

光鏡下觀察，Masson染色中膠原纖維呈藍(lán)白色，胞質(zhì)、肌纖維呈紅色，胞核藍(lán)褐色。與對(duì)照組(0.08%±0.02%)比較，模型組(0.27%±0.11%)CVF增加了237.50%；與模型組比較，心康方組(0.18%±0.04%)和卡托普利組(0.15%±0.09%)CVF分別降低了31.03%和44.44%(P<0.05或P<0.01)(圖1)。模型組Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原顯著高于對(duì)照組，心康方組和卡托普利組Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原顯著低于模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.01)。

2.4 大鼠心肌TGF-β1、IκB和p56的表達(dá)

模型組TGF-β1和p56顯著高于對(duì)照組，IκB顯著低于對(duì)照組；心康方組和卡托普利組TGF-β1和p56顯著低于模型組，IκB顯著高于模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)，見圖2。

2.5 大鼠心肌MMP-2、MMP-9、TIMP-1和TIMP-2 蛋白含量和mRNA的相對(duì)表達(dá)量

模型組MMP-2、MMP-9、TIMP-1和TIMP-2的蛋白含量和mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著高于對(duì)照組(P<0.01或P<0.05)；心康方組和卡托普利組MMP-2、 MMP-9、TIMP-1和TIMP-2 的蛋白含量和mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著低于模型組(P<0.01或P<0.05)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖3～6。各組MMP-2/TIMP-2蛋白比值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；模型組、心康方組和卡托普利組MMP-9/TIMP-1蛋白比值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，均顯著少于對(duì)照組(0.32±0.20、0.34±0.17和0.41±0.30比0.86±0.45，P<0.01或P<0.05)。

A：對(duì)照組；B：模型組；C：心康方組；D：卡托普利組圖1 各組大鼠心肌膠原組織Masson染色(×200)

與對(duì)照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05圖2 各組大鼠心?、裥湍z原、Ⅲ型膠原、TGF-β1、IκB和p56的相對(duì)表達(dá)

與對(duì)照組比較，aP<0.01；與模型組比較，bP<0.01圖3 大鼠心肌MMP-2蛋白和mRNA的相對(duì)表達(dá)量

與對(duì)照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05圖4 大鼠心肌MMP-9蛋白和mRNA的相對(duì)表達(dá)量

與對(duì)照組比較，aP<0.01；與模型組比較，bP<0.01圖5 大鼠心肌TIMP-1蛋白和mRNA的相對(duì)表達(dá)量

與對(duì)照組比較，aP<0.01；與模型組比較，bP<0.01圖6 大鼠心肌TIMP-2蛋白和mRNA的相對(duì)表達(dá)量

3 討論

本研究通過腹腔注射阿霉素建立CHF大鼠模型，Masson染色結(jié)果表明CHF大鼠發(fā)生心肌纖維化(myocardial fibrosis，MF)，而心康方組的纖維化程度顯著低于模型組。蛋白印跡試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)CHF大鼠心?、裥秃廷笮湍z原過度沉積，而心康方組和卡托普利組的膠原沉積顯著少于模型組，表明中藥心康方和卡托普利可以改善心肌膠原代謝，具有抗MF作用。

心肌組織的細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)是由Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白、纖連蛋白、層粘連蛋白、原纖維蛋白、彈性蛋白、蛋白聚糖和糖蛋白等物質(zhì)在心肌細(xì)胞附近形成的網(wǎng)架結(jié)構(gòu)[5]。膠原是心臟ECM中含量最多的物質(zhì)，其中85%是Ⅰ型膠原，11%為Ⅲ型膠原。心肌膠原合成與降解失衡，導(dǎo)致膠原比例改變及過度沉積而形成MF[6]。TGF-β1是與膠原代謝關(guān)系最密切的細(xì)胞因子[7]，可誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞分化為肌成纖維細(xì)胞，合成和分泌大量ECM(主要是Ⅰ型和Ⅲ型膠原)。肌成纖維細(xì)胞合成ECM的能力遠(yuǎn)大于成纖維細(xì)胞，是組織纖維化過程中產(chǎn)生過量ECM的主要來源細(xì)胞。肌成纖維細(xì)胞可遷移至損傷區(qū)域并迅速增殖，合成大量ECM，促進(jìn)ECM間的交聯(lián)，引起膠原的過度沉積，導(dǎo)致MF發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)中，CHF大鼠心肌TGF-β1表達(dá)水平顯著升高，膠原代謝紊亂，左室出現(xiàn)病理性重構(gòu)，提示ECM重構(gòu)；心康方組TGF-β1表達(dá)水平顯著低于模型組，提示膠原代謝得到改善，ECM重構(gòu)減輕。TGF-β1還可抑制MMPs分泌，刺激TIMPs表達(dá)，抑制膠原降解[7]。成纖維細(xì)胞產(chǎn)生MMPs和TIMPs，MMPs降解ECM，TIMPs抑制MMPs從而抑制ECM降解。其中，MMP-2和MMP-9能降解心肌膠原，TIMP-2能抑制MMP-2活性，TIMP-1能抑制MMP-9活性。本實(shí)驗(yàn)中，CHF大鼠心肌MMP-2、MMP-9、TIMP-1和TIMP-2的蛋白和mRNA表達(dá)水平均顯著升高，提示膠原降解加快，TIMPs加強(qiáng)對(duì)MMPs的抑制作用；心康方組MMPs和TIMPs的蛋白和mRNA表達(dá)水平均顯著低于模型組，提示膠原降解減慢，TIMPs對(duì)MMPs的抑制作用減輕；心康方組與模型組MMPs/TIMPs比值無顯著差異，可能與檢測時(shí)間點(diǎn)過晚有關(guān)：當(dāng)ECM重構(gòu)到達(dá)一定程度，MMPs與TIMPs形成新的短暫的動(dòng)態(tài)平衡，ECM降解與合成相對(duì)穩(wěn)定。

研究發(fā)現(xiàn)NF-κB可介導(dǎo)TGF-β1上調(diào)而促進(jìn)MF，抑制NF-κB的表達(dá)可下調(diào)TGF-β1的表達(dá)，從而減輕MF[1]；應(yīng)用該理論可以較好地解析我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。p65/p50是NF-κB的常見存在形式，IκB是其抑制因子；IκB可被磷酸化降解，p65磷酸化激活而實(shí)現(xiàn)NF-κB的功能。本實(shí)驗(yàn)中，CHF大鼠心肌p56顯著升高，IκB顯著降低，提示NF-κB介導(dǎo)TGF-β1上調(diào)而促進(jìn)MF；心康方組p56顯著低于模型組，IκB顯著高于模型組，提示中藥心康方能抑制NF-κB通路，抑制TGF-β1上調(diào)而減輕MF。另外，抑制成纖維細(xì)胞中NF-κB通路還可以減少Ⅰ型膠原累積，減輕MF[8]。作為陽性對(duì)照的卡托普利早已被證實(shí)具有抗MF作用，能降低TGF-β1水平[9-10]，與本研究結(jié)果一致。

MF是CHF左室重構(gòu)的主要表現(xiàn)，減輕MF可以抑制病理性左室重構(gòu)，改善心功能。膠原代謝紊亂導(dǎo)致MF，改善膠原代謝可以減輕MF。膠原的合成、分泌和降解都受到機(jī)體的嚴(yán)密調(diào)控。中藥心康方在阿霉素誘導(dǎo)的CHF大鼠模型中能夠抑制NF-κB和TGF-β1通路，通過調(diào)節(jié)MMPs、TIMPs、Ⅰ型和Ⅲ型膠原的表達(dá)而減少膠原沉積，減輕MF。TGF-β1通路在膠原代謝中的作用已經(jīng)比較明確，NF-κB在MF中的作用及其機(jī)制仍未達(dá)成共識(shí)，有待進(jìn)一步研究。

由于本實(shí)驗(yàn)動(dòng)物樣本量少，使用的是小動(dòng)物，只針對(duì)阿霉素誘導(dǎo)的特定HF模型，實(shí)驗(yàn)中藥的效應(yīng)及其具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步的研究來驗(yàn)證和解答。

利益沖突：無

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