陸娜娜

（合肥市濱湖醫(yī)院病理科，合肥 230601）

胃癌（gastric cancer）是人類最常見的消化道惡性腫瘤之一，在我國,其發(fā)病率呈逐年上升趨勢。免疫逃逸機(jī)制在胃癌發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用，其中，程序性死亡配體-1（programmed death ligand-1,PD-L1）是影響腫瘤生物行為的重要因素。粘蛋白1（mucin 1, MUC1）是粘蛋白家族成員中的一種I型跨膜蛋白，在腫瘤組織中異常表達(dá)。目前關(guān)于PD-L1和MUC1與胃癌之間的關(guān)系研究甚少，為此，本研究采用免疫組織化學(xué)S-P（streptavidin- peroxidase，鏈霉菌抗生物素-過氧化物酶）法檢測胃癌組織中PD-L1和MUC1的表達(dá)，分析其在胃癌生物學(xué)行為中的作用，以及兩者間的關(guān)系。為胃癌的臨床診治、預(yù)后評估提供有效理論依據(jù)。

材料與方法

1 標(biāo)本來源

收集合肥市濱湖醫(yī)院病理科2014年至今住院胃癌手術(shù)切除標(biāo)本120例，另取40例距癌灶邊緣5cm以上的正常胃粘膜組織作為對照。所有病例術(shù)前均未接受放療、化療及其他針對腫瘤的特殊治療，且術(shù)后經(jīng)病理證實(shí)。所有標(biāo)本經(jīng)10%中性福爾馬林液固定，石蠟包埋，常規(guī)切片。

2 主要試劑

兔抗人MUC1單克隆抗體（ab45167）購自Abcam公司，兔抗人PD-L1單克隆抗體（RMA-0732）、即用型快捷免疫組織化學(xué)檢測試劑盒及DAB顯色試劑盒均購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。

3 免疫組織化學(xué)染色

S-P法免疫組織化學(xué)染色參照試劑盒說明書操作，用已知陽性切片作為陽性對照，用PBS代替一抗作為陰性對照。

4 結(jié)果判斷

PD-L1免疫反應(yīng)產(chǎn)物定位于細(xì)胞膜，MUC1免疫反應(yīng)產(chǎn)物定位于細(xì)胞質(zhì)。采用半定量方法[1]按以下2種方式進(jìn)行評分：①按細(xì)胞染色強(qiáng)弱評分：0分不著色，1分淺黃色，2分棕黃色，3分棕褐色；②選取5個(gè)高倍視野（40×物鏡），計(jì)數(shù)陽性染色細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的百分比：0分0%～5%，1分6%～25%，2分26%～50%，3分51%～75%，4分76%～100%。按①與②乘積判斷結(jié)果：＜3為陰性（－），≥3為陽性（＋）。染色結(jié)果由兩位病理科醫(yī)師進(jìn)行診斷核實(shí)。

5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS13.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。各樣本資料差異的統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用X2檢驗(yàn)方法，Spearman相關(guān)分析檢驗(yàn)方法，P＜0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 PD-L1和MUC1在正常胃粘膜組織中的表達(dá)

免疫染色結(jié)果顯示，在40例正常胃黏膜組織中，PD-L1均呈免疫反應(yīng)陰性（圖1上排）， MUC1均呈免疫反應(yīng)陽性，陽性細(xì)胞分布在正常胃粘膜中，包括主細(xì)胞、壁細(xì)胞和粘液細(xì)胞（圖1下排）。

圖1 PD-L1（上排）和MUC1（下排）在正常胃粘膜組織的表達(dá)（S-P法）Fig.1 Expression of PD-L1 (upper row) and MUC1 (lower row) in the normal gastric mucosa (S-P method)

2 PD-L1和MUC1在胃癌組織中的表達(dá)及與臨床病理因素間的關(guān)系

在胃癌組織中，PD-L1免疫染色陽性率為32.5%（39/120），免疫反應(yīng)陽性產(chǎn)物定位于腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞膜（圖2）；MUC1免疫反應(yīng)陽性率為65%（78/120)，免疫反應(yīng)陽性產(chǎn)物定位于腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)（圖3）。腫瘤直徑大于5cm組PD-L1和MUC1陽性表達(dá)率分別為48.9%（21/43）和76.7%（33/43），均顯著高于腫瘤直徑小于5cm組的23.4%（18/77）和58.4%（45/77）。浸潤深度T3-T4組PD-L1和MUC1陽性表達(dá)率分別為40.3%（29/72）和75%（54/72），均顯著高于T1-T2組的20.8%（10/48）和50%（24/48）。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性組PD-L1和MUC1陽性表達(dá)率分別為40.6%（28/69）和73.9%（51/69），均顯著高于陰性組的21.6%（11/51）和52.9%（27/51）。PD-L1和MUC1表達(dá)與患者年齡、性別、腫瘤分化程度及TNM分期均無關(guān)（表1）。

圖2 PD-L1在胃癌組織中腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞膜上表達(dá)（S-P法）。比例尺：上排，200μm；下排，50μmFig.2 Expression of PD-L1 on the membrane of gastric carcinoma cells (S-P method). Scale bars∶ 200μm in the upper row and 50μm in the lower row

3 胃癌組織中PD-L1表達(dá)與MUC1表達(dá)呈正相關(guān)

在120例胃癌中，PD-L1和MUC1表達(dá)均陽性36例，均陰性39例，前者陽性而后者陰性3例，前者陰性而后者陽性42例；PD-L1和MUC1在胃癌組織中的表達(dá)呈正相關(guān)（表2）。

討 論

程序性死亡配體-1（PD-L1）是一種重要的免疫抑制因子，也被稱為CD274，是由290個(gè)氨基酸組成的跨膜糖蛋白，屬于B7家族成員[2]。PD-L1除了表達(dá)于胎盤、扁桃體以及肺和肝中小部分的巨噬樣細(xì)胞外[3]，在人體正常組織細(xì)胞表面幾乎不表達(dá)。PD-L1是程序性死亡因子（Programmed death 1，PD-1）的配體之一，它們共同組成的信號通路能調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境，抑制T細(xì)胞增殖和活化，導(dǎo)致腫瘤免疫失活和免疫逃逸[4,5]，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。PD-L1在多種腫瘤中如非小細(xì)胞肺癌[6]、惡性黑色素瘤[7]、乳腺癌[8]、結(jié)腸癌[9]等均呈現(xiàn)高表達(dá)。研究顯示，PD-L1 在正常胃組織中幾乎不表達(dá)，而在胃癌組織中表達(dá)水平明顯上調(diào)[10-12]。但是在胃癌組織中的表達(dá)陽性率及其與臨床病理因素間的關(guān)系，國內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道尚存在一定差異。我們的結(jié)果顯示，在胃癌組織中，PD-L1的表達(dá)與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及浸潤深度有關(guān)，與患者年齡、性別、腫瘤分化程度及TNM分期無關(guān)。

圖3 MUC1在胃癌組織中腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)表達(dá)（S-P法）。比例尺：上排，200μm；下排50μmFig.3 Expression of MUC1 in the cytoplasm of gastric carcinoma cells (S-P method). Scale bars∶ 200μm in the upper row and 50μm in the lower row

表1 胃癌組織中PD-L1和MUC1表達(dá)與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系Tab.1 The relationship between expression and clinicopathological manifestations of PD-L1 and MUC1 in gastric carcinoma

MUC1是由muc1基因編碼的一種高分子量糖蛋白（120～225 ku），廣泛分布于呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)等分泌型上皮細(xì)胞管腔表面，與家族其他成員共同組成細(xì)胞黏膜，保護(hù)機(jī)體免受外界細(xì)菌、病毒的侵害[13-15]。MUC1基因定位于1q21-24位點(diǎn)上，幾乎所有的人類黏膜都分泌MUC1，且它多表達(dá)于上皮細(xì)胞近腔面，其在多種腫瘤組織中異常表達(dá)，表現(xiàn)為量的增加和結(jié)構(gòu)改變，其畸形糖基化或糖基化不全，使MUC1暴露出新的蛋白或新的糖抗原[16]。研究顯示，過度表達(dá)的MUC1可賦予腫瘤生長與轉(zhuǎn)移性質(zhì)，使腫瘤侵襲性增加[17]。MUC1表達(dá)上調(diào)會導(dǎo)致 E-鈣muc表達(dá)水平的下調(diào)，使腫瘤相互間的黏附力下降，促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移的發(fā)生[18]。MUC1在胃癌[19]、前列腺癌[20]、乳腺癌[21]、胰腺癌[22]等多種腫瘤組織中均有表達(dá)，且表達(dá)水平上調(diào)與腫瘤的生長、浸潤和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。MUC1在腫瘤組織中的異常表達(dá)，使其成為一種潛在的腫瘤生物學(xué)標(biāo)志物。我們的結(jié)果顯示PD-L1蛋白與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及浸潤深度有關(guān)，與患者年齡、性別、腫瘤分化程度及TNM分期無關(guān)。

表2 胃癌組織中PD-L1和MUC1蛋白表達(dá)之間的關(guān)系Tab.2 Correlation between PD-L1 and MUC1 expression in gastric carcinoma tissues

本研究結(jié)果還顯示胃癌組織中PD-L1和MUC1表達(dá)呈正相關(guān)，說明二者在胃癌發(fā)生、發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移過程中可能存在協(xié)同作用，但其具體機(jī)制尚不清楚，國外有文獻(xiàn)報(bào)道顯示PD-L1和MUC1在急性髓細(xì)胞白血病（AML）中存在相關(guān)性，研究通過MUC1特異性shRNA或CRISPR/ Cas9基因編輯抑制MUC1-C表達(dá)后可導(dǎo)致PD-L1表達(dá)的幾乎消失，提示MUC1-C是microRNA表達(dá)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，而且是促進(jìn)PD-L1表達(dá)的關(guān)鍵機(jī)制，可導(dǎo)致AML細(xì)胞的免疫抑制特性[23]。Bouillez等研究發(fā)現(xiàn)在非小細(xì)胞肺癌中PD-L1整合MUC1蛋白進(jìn)行免疫抑制，MUC1促進(jìn)腫瘤核因子-κB（NF-κB）信號通道活化，活化的NF-κB促進(jìn)了PD-L1的表達(dá)[24]。但國內(nèi)在這方面還未見相關(guān)報(bào)道，我們的研究樣本數(shù)比較少，可以采取大樣本、不同實(shí)驗(yàn)方法來進(jìn)一步驗(yàn)證相關(guān)蛋白在癌癥形成中的作用。

綜上所述，PD-L1和MUC1在胃癌的生物學(xué)進(jìn)展中發(fā)揮重要作用，并且二者具有協(xié)同作用，聯(lián)合檢測可為其提供重要的參考指標(biāo)，更有利于判斷患者的預(yù)后。