伍亮，趙秋平， 吳穎，陳圓圓，李靜，張昊濱，張志強(qiáng)*

（1安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院動(dòng)物醫(yī)學(xué)系，2安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院水產(chǎn)養(yǎng)殖學(xué)系，合肥 230036）

嗜銀細(xì)胞屬于內(nèi)分泌細(xì)胞類，是消化道內(nèi)分泌細(xì)胞的總稱，見(jiàn)于無(wú)脊椎動(dòng)物[1]和多種脊椎動(dòng)物類群[2,3]，主要分泌5-羥色胺等物質(zhì)[4]，參與腸黏膜從隱窩至絨毛的激素信號(hào)調(diào)節(jié)過(guò)程[5]。與其他脊椎動(dòng)物相似，兩棲動(dòng)物的消化道嗜銀細(xì)胞也可分為開(kāi)放型細(xì)胞和閉合型細(xì)胞，能執(zhí)行內(nèi)、外分泌，以及旁分泌等多種生理功能[6]，其分布密度具有物種特異性[6]，亦受冬眠狀態(tài)[7]或禁食[8]等因素的影響。目前，對(duì)兩棲動(dòng)物消化道內(nèi)分泌細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征和分布密度規(guī)律的增齡變化研究，主要集中于變態(tài)前后[9-11]，對(duì)登陸后的增齡變化研究很少。研究發(fā)現(xiàn)，生后小鼠發(fā)育至50日齡時(shí)，十二指腸、回腸和盲腸內(nèi)的嗜銀細(xì)胞的密度高峰分別出現(xiàn)于20、20和5日齡，且腸道各段的分布密度隨日齡的變化模式不同[12]?；ū丑蛤埽≒seudepidalea raddei）是我國(guó)北方地區(qū)常見(jiàn)的無(wú)尾兩棲類動(dòng)物，對(duì)其成體消化道內(nèi)分泌細(xì)胞已有一些報(bào)道。例如，成體花背蟾蜍胃腸道嗜銀細(xì)胞的分布密度高峰為十二指腸和胃幽門部，由空腸至回腸逐漸減少[13]，5-羥色胺細(xì)胞胃幽門部密度最高，直腸最低[14]。本文采用Grimelius銀染法[15]，以幼體、亞成體和成體花背蟾蜍為研究對(duì)象，對(duì)其消化道嗜銀細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征和分布密度的增齡變化特點(diǎn)進(jìn)行比較，旨在豐富兩棲動(dòng)物發(fā)育生物學(xué)、比較組織學(xué)和比較內(nèi)分泌學(xué)的基礎(chǔ)資料，為深入理解花背蟾蜍變態(tài)后的消化生理特征提供形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)。

材料和方法

1 實(shí)驗(yàn)材料

2017年8月上旬，在內(nèi)蒙古錫林郭勒盟太仆寺旗宏大水庫(kù)（115.28°E、41.90°N）捕捉處于不同年齡的花背蟾蜍，其中幼蟾[體重：（2.587 ± 0.230）g；體長(zhǎng)：（3.2 ± 0.1）cm]、亞成體蟾[體重：（13.076± 1.316）g；體長(zhǎng)：（5.5 ± 0.2）cm]和成蟾[體重：（28.166 ± 1.495）g；體長(zhǎng)：（7.0 ± 0.2）cm]各 8只，用雙毀髓法處死動(dòng)物，解剖取出食管、賁門、胃底、幽門、十二指腸、空腸、回腸和直腸等各段，每段截取0.3～1.0cm長(zhǎng)的組織塊，用0.7%的生理鹽水沖洗組織塊，投入不含冰醋酸的Bouin’s液固定18～24h，70%乙醇保存組織塊約1個(gè)月，之后從80%乙醇開(kāi)始常規(guī)脫水至透明，石蠟包埋，切片厚5μm。

2 Grimelius嗜銀細(xì)胞染色法

采用Grimelius嗜銀細(xì)胞染色法進(jìn)行銀染，并結(jié)合微波技術(shù)加以改進(jìn)[15]。簡(jiǎn)述如下：常規(guī)石蠟切片脫蠟至水。將切片置于1%的硝酸銀水溶液（稱取硝酸銀2g，加蒸餾水180ml和0.1mol/L醋酸鈉緩沖液20ml）中，置于微波爐中，58～60℃加熱5min，之后經(jīng)58～60℃蒸餾水洗后，將水洗后的切片轉(zhuǎn)入已60℃預(yù)熱0.5h的還原液（5%亞硫酸鈉水溶液與1%對(duì)苯二酚水溶液，用時(shí)等量混合）中，繼續(xù)在溫度為58～60℃的微波爐中加熱5min，染色后的標(biāo)本經(jīng)自來(lái)水沖洗3min后，再經(jīng)蒸餾水水洗5min，終止還原反應(yīng)，常規(guī)梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片，于37℃恒溫箱中烘干后，鏡檢觀察。

3 嗜銀細(xì)胞計(jì)數(shù)與拍照

在Motic-BA 210型顯微鏡40×物鏡下觀察、計(jì)數(shù)、拍照。每只動(dòng)物消化道的每個(gè)部位隨機(jī)選取1張切片，每張切片隨機(jī)計(jì)數(shù)3個(gè)視野，以3個(gè)視野的平均值表示該只動(dòng)物該部位嗜銀細(xì)胞的分布密度，以8只動(dòng)物的平均值表示該年齡組該部位嗜銀細(xì)胞的分布密度。

4 統(tǒng)計(jì)分析

用SPSS 19.0 for Windows進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。經(jīng)Kolmogorov-Simirnov檢驗(yàn)，所有數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布。以雙因素方差分析（Two wayANOVA）（年齡×消化道部位）統(tǒng)計(jì)不同年齡組消化道不同部位嗜銀細(xì)胞分布密度的年齡和部位差異。以單因素方差分析（One wayANOVA）及多重比較（multiple comparisons）post hoctest統(tǒng)計(jì)同一年齡組消化道不同部位嗜銀細(xì)胞分布密度的差異。文中數(shù)據(jù)均以平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)誤（Mean ± SE）表示，P＜0.05 為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著。

結(jié) 果

1 消化道嗜銀細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征的增齡變化

光鏡下，經(jīng)Grimelius法結(jié)合微波技術(shù)染色后的嗜銀細(xì)胞，其細(xì)胞質(zhì)呈黑褐色，細(xì)胞核無(wú)色，切片背景為黃色，反差強(qiáng)，易辨認(rèn)（圖1）。

閉合型和開(kāi)放型細(xì)胞都主要分布于粘膜上皮和腺體中。閉合型嗜銀細(xì)胞呈圓形或橢圓形，幼蟾、亞成體蟾和成蟾的食管（圖1A—C）較多，幽門居中（圖1D—F），直腸較少（圖1G—I）；開(kāi)放型嗜銀細(xì)胞呈錐體形、梭形、毛筆頭狀、逗號(hào)狀、短棒狀或長(zhǎng)棒狀，主要分布于幼蟾、亞成體蟾和成蟾的胃底（圖1J）、胃底（圖1K）和回腸（圖1L），偶見(jiàn)于空腸（圖1M）、直腸（圖1N）和十二指腸（圖1O）。

圖 1 花背蟾蜍消化道嗜銀細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征的增齡變化。A，幼蟾食管圓形的嗜銀細(xì)胞；B，亞成體蟾食管橢圓形嗜銀細(xì)胞；C，成蟾食管圓形嗜銀細(xì)胞；D，幼蟾幽門橢圓形嗜銀細(xì)胞；E，亞成體蟾幽門圓形嗜銀細(xì)胞；F，成蟾幽門圓形嗜銀細(xì)胞；G，幼蟾直腸圓形嗜銀細(xì)胞；H，亞成體蟾直腸圓形嗜銀細(xì)胞；I，成蟾直腸橢圓形嗜銀細(xì)胞；J，幼蟾胃底短棒狀嗜銀細(xì)胞；K，亞成體蟾胃底毛筆頭狀嗜銀細(xì)胞；L，成蟾回腸毛筆頭狀嗜銀細(xì)胞；M，幼蟾空腸短棒狀嗜銀細(xì)胞；N，亞成體蟾直腸長(zhǎng)棒狀嗜銀細(xì)胞；O，成蟾十二指腸長(zhǎng)棒狀嗜銀細(xì)胞。EP，上皮； SG，胃腺；箭頭，嗜銀細(xì)胞；比例尺，15μmFig.1 Age-related changes of morphological features of argyrophil cells along the digestive tract of Pseudepidalea raddei. A, round shaped argyrophil cells in the esophagus of juvenile toads; B, ellipse shaped argyrophil cells in the esophagus of subadult toads; C, round shaped argyrophil cells in the esophagus of adult toads; D, ellipse shaped argyrophil cells in the pylorus of juvenile toads; E, round shaped argyrophil cells in the pylorus of subadult toads; F, round shaped argyrophil cells in the pylorus of adult toads; G, round shaped argyrophil cells in the rectum of juvenile toads; H, round shaped argyrophil cells in the rectum of subadult toads; I, ellipse shaped argyrophil cells in the rectum of adult toads; J, short rod shaped argyrophil cells in the fundus of juvenile toads; K, brush head shaped argyrophil cells in the fundus of subadult toads; L, brush head shaped argyrophil cells in the ileum of adult toads; M, short rod shaped argyrophil cells in the jejunum of juvenile toads; N, long rod shaped argyrophil cells in the rectum of subadult toads;O, long rod shaped argyrophil cells in the duodenum of adult toads. EP, epithelium; SG, stomach gland; arrows, argyrophil cells; scale bar, 15μm

2 年齡和消化道部位對(duì)嗜銀細(xì)胞分布密度的影響

花背蟾蜍消化道嗜銀細(xì)胞的分布密度既有年齡差異（F2,164= 23.079,P＜0.01），也有部位差異（F7,164= 5.256,P＜0.01），但年齡和部位無(wú)交互作用（F14,164= 0.971,P= 0.485）。

成蟾和亞成體蟾賁門（F2,21= 3.639,P＜0.05）、胃底（F2,21= 11.305,P＜0.001）和空腸（F2,21= 14.856,P＜0.001） 的分布密度都高于幼體；成蟾與亞成體蟾回腸的分布密度接近，但成蟾高于幼蟾（F2,21=7.508,P＜0.01）；食管（F2,21= 2.487,P＞0.05）、幽門（F2,21= 3.149,P＞0.05）和直腸（F2,21= 2.716,P＞0.05） 的分布密度都隨年齡增加而升高，但組間差異均不顯著（表1）。

幼蟾食管的分布密度顯著高于賁門和空腸（F7,56= 3.939,P=0.01），但其他各部位間均無(wú)顯著差異；亞成體蟾（F7,56= 1.680,P＞0.05）和成蟾（F7,56= 1.763,P＞0.05）都在食管最高，直腸最低，但消化道各段之間均無(wú)顯著差異（表1）。

表1 花背蟾蜍消化道嗜銀細(xì)胞分布密度的增齡變化和部位差異（單位：細(xì)胞個(gè)數(shù)/400×視野)Tab.1 Age-related changes and portion differences of distribution densities of argyrophil cells along the digestive tract in Pseudepidalea raddei (unit: cells/400×fields)

討 論

花背蟾蜍消化道嗜銀細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征無(wú)年齡差異，但賁門、胃底、空腸和回腸段的分布密度隨年齡增加而升高，不同年齡組的分布密度高峰都見(jiàn)于食管，但模式不同，這可能與幼蟾、亞成體蟾和成蟾的吞食習(xí)性及對(duì)食物的機(jī)械消化作用和消化吸收能力的增齡變化有關(guān)。

1 嗜銀細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征的增齡變化

花背蟾蜍不同年齡組消化道各段都有嗜銀細(xì)胞分布，形態(tài)學(xué)上分為閉合型和開(kāi)放型兩種細(xì)胞類型，這與已有的成體兩棲動(dòng)物的報(bào)道一致[6]。然而，成體兩棲動(dòng)物消化道嗜銀細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征也有物種間的差異。例如，北方狹口蛙（Kaloula borealis）消化道各段均以閉合型細(xì)胞為主，多呈圓形[16]，而中國(guó)林蛙（Rana chensinensis）[17]主要呈錐體形和梭形，以開(kāi)放型細(xì)胞為主，花背蟾蜍[13]和中華蟾蜍（Bufo gargarizans）[18]的胃腸道嗜銀細(xì)胞兼具多種形態(tài)。嗜銀細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征多變，這可能與所切部位有關(guān)，也可能與消化道特定部位執(zhí)行的生理功能有關(guān)[6]。一般認(rèn)為，閉合型細(xì)胞無(wú)胞突，主要功能為感受局部組織內(nèi)環(huán)境的變化和腸腔內(nèi)容物壓力的刺激，執(zhí)行內(nèi)分泌的功能，而開(kāi)放型細(xì)胞有胞突伸向管腔或鄰近細(xì)胞，可能執(zhí)行外分泌和旁分泌的功能[6]。經(jīng)冬眠或禁食處理，黑龍江林蛙[7]、黑斑側(cè)褶蛙（Pelophylax nigromaculata）[19]和東方蠑螈（Cynops orientalis）[8]消化道嗜銀細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征均無(wú)明顯改變，說(shuō)明嗜銀細(xì)胞可能主要依賴數(shù)量的增減而非形態(tài)學(xué)的調(diào)整來(lái)應(yīng)對(duì)食物資源的短缺。不同年齡組花背蟾蜍消化道嗜銀細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征未見(jiàn)明顯差異，說(shuō)明幼蟾登陸后就已建立與亞成體和成體形態(tài)結(jié)構(gòu)相似的內(nèi)分泌細(xì)胞分布模式，這有助于幼蟾適應(yīng)多變的陸地生活環(huán)境。

2 消化道同一部位嗜銀細(xì)胞分布密度的增齡變化

分布于內(nèi)蒙古太仆寺旗的成體和亞成體花背蟾蜍主要捕食危害農(nóng)作物及草原的各類昆蟲(chóng)，幼蟾則以體積更小的昆蟲(chóng)幼蟲(chóng)為食?；ū丑蛤艿奈钢饕獔?zhí)行機(jī)械消化的作用，而空腸和回腸主要執(zhí)行吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的功能，成蟾與亞成體蟾這些部位嗜銀細(xì)胞的分布密度接近，但成蟾都高于幼蟾，這與隨年齡增加吞食的食物逐漸增大，以及消化道消化吸收功能的逐漸完善有關(guān)。對(duì)30～46期極北鯢（Salamandrella keyserlingii）的研究表明，胃、小腸和食管中的嗜銀細(xì)胞分別見(jiàn)于第41、42和43期[11]。小鼠出生后，腸道內(nèi)已有嗜銀細(xì)胞分布；50日齡前，十二指腸、回腸和盲腸的密度高峰分別見(jiàn)于20、20和5日齡，且腸道各段分布密度的變化模式不同[12]。亞成體蟾攝食量大、生長(zhǎng)快速，嗜銀細(xì)胞的分布密度也隨之大幅度增加。嗜銀細(xì)胞是內(nèi)分泌細(xì)胞的總稱，能分泌5-羥色胺等生物活性物質(zhì)，而5-羥色胺細(xì)胞與物種的系統(tǒng)發(fā)生過(guò)程有關(guān)[20]；兩棲動(dòng)物變態(tài)發(fā)育過(guò)程消化道5-羥色胺細(xì)胞的表達(dá)模式具有物種特異性，中華蟾蜍最早見(jiàn)于孵出期的消化道中段[9]。

3 同一年齡組消化道嗜銀細(xì)胞分布密度的部位差異

嗜銀細(xì)胞廣泛分布于兩棲動(dòng)物的消化道中，但分布密度和分布模式隨物種而不同。亞成體和成體花背蟾蜍消化道嗜銀細(xì)胞的分布密度都在食管最高，直腸最低，但未見(jiàn)明顯的部位差異。亞成體和成體花背蟾蜍主要取食各類昆蟲(chóng)，直腸粗大，常充滿食物殘?jiān)?，?nèi)分泌細(xì)胞數(shù)量的下降可能與直腸較弱的蠕動(dòng)功能相關(guān)。此前，對(duì)成體花背蟾蜍胃腸道嗜銀細(xì)胞的研究表明，十二指腸和胃幽門部分布密度最高，由十二指腸至回腸呈遞減趨勢(shì)[13]，而埃及蟾蜍（Bufo regularis）的直腸則無(wú)嗜銀細(xì)胞分布[4]；北方狹口蛙[18]、中國(guó)林蛙[19]的消化道嗜銀細(xì)胞密度高峰分別為胃底和食管、胃底，密度低谷分別為空腸、食管和直腸?；ū丑蛤芟朗茹y細(xì)胞的分布密度幼蟾食管最高，顯著高于賁門和空腸，這可能與其吞食食物的習(xí)性、感知食物刺激和促進(jìn)食物下行有關(guān)。賁門嗜銀細(xì)胞數(shù)量顯著降低，不利于較大體積的食物通過(guò)，而幼蟾腸道各段的分界并不明顯，從十二指腸至空腸嗜銀細(xì)胞的分布密度下降，至回腸和直腸又有所回升，說(shuō)明腸道吸收功能主要在十二指腸處完成，回腸和直腸可能執(zhí)行吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和排出食物殘?jiān)碾p重功能。

總之，組織化學(xué)水平上，花背蟾蜍消化道嗜銀細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征不隨年齡而改變，但分布模式多樣，主要依賴內(nèi)分泌細(xì)胞數(shù)量的增加來(lái)適應(yīng)消化食物和吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的能力的增齡變化。