胥虹貝，母松，朱艷含，朱君，周雪靈，羅勇*

（1重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，重慶400016；2貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院肛腸外科，貴州550004）

在缺血性腦血管病治療中，如何提高缺血半暗帶內(nèi)血流，挽救瀕死神經(jīng)元一直是缺血性腦血管病的治療難點。缺血性腦損傷發(fā)生后，骨髓內(nèi)皮祖細胞（endothelial progenitor cells，EPCs）可在多種細胞因子，如缺氧誘導因子-1（hypoxia inducible factor-1，HIF-1）、基質(zhì)細胞衍生因子-1α（stromal cell-derived factor-1α，SDF-1α）和趨化因子受體4（C-XC chemokine receptor type 4，CXCR4）等誘導下從骨髓動員至外周血，并歸巢至腦缺血區(qū)參與血管再生[1-4]。磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B/內(nèi)皮型一氧化氮合酶（phosphatidylinositol -3 kinase/protein kinase B/endothelial nitric oxide synthase，PI3K/AKT/eNOS）是與EPCs增殖、遷移、歸巢相關的代表性信號轉(zhuǎn)導通路[1,5,6]。本課題組前期研究表明，電針可加速局灶腦缺血/再灌注大鼠骨髓EPCs動員至外周血，上調(diào)骨髓和外周血EPCs數(shù)量[1,7-9]，但其具體機制尚不十分明確。本研究旨在通過觀察電針及PI3K特異性拮抗劑LY294002干預后，大鼠骨髓和外周血CD34+EPCs數(shù)量變化情況和大腦皮質(zhì)缺血區(qū)內(nèi)CD34+微血管再生情況，以期深入探討電針促進局灶腦缺血/再灌注后腦內(nèi)血管再生的可能機制。

材料與方法

1 實驗動物分組

192只SPF級成年雄性SD大鼠（250-300g），由重慶醫(yī)科大學動物中心[動物資格證：SCXK（渝）2018-0003]提供。大鼠隨機分為假手術組（Sham）、缺血組（I/R）、缺血+電針組（I/RE）和缺血+電針+LY294002組（I/REL）。腦缺血90min后，根據(jù)再灌注時間不同將各組大鼠分為再灌注24h、48h和7d 三個亞組。

2 主要試劑和儀器

小鼠抗PE-CD34多克隆抗體（Santa Cruz Biotechnology公司，美國）、兔抗CD34多克隆抗體（CST公司，美國）、FITC標記的山羊抗兔熒光二抗（Proteintech，美國）、紅細胞裂解液（碧云天，中國）、LY294002（Sigma，美國）、p-AKT（磷酸化AKT）和總AKT ELISA試劑盒（ab126433，Abcam，美國）、eNOS ELISA試劑盒（ab230938，Abcam），G6850型電針治療儀（購自北京精工儀器廠），流式細胞儀（FACS vantage SE，BD公司，美國），激光掃描共聚焦顯微鏡（尼康，日本）。

3 局灶腦缺血/再灌注模型

采用改良線栓法[10]結合羅勇等[11]的方法，制備SD大鼠右側(cè)大腦中動脈缺血/再灌注模型（transient middle cerebral artery occlusion/reperfusion，tMCAO）。大鼠術前禁食一晚，不禁飲。3.5%水合氯醛腹腔注射（1mg/100g）麻醉大鼠后，將大鼠仰臥位固定于操作臺，除頸部毛發(fā)，行頸正中縱行切口，鈍性分離頸部肌肉，充分暴露右側(cè)頸總動脈、頸外動脈和頸內(nèi)動脈顱外段，結扎頸外動脈遠端，沿頸內(nèi)動脈分離翼顎動脈，結扎起點端。在頸外動脈殘端剪一斜行切口，緩慢插入提前準備好的頭端圓潤、直徑為0.25～0.27mm的線栓，當線栓頭端距頸總動脈分叉處約18～20mm處可感到明顯阻力時，表明線栓頭端已達大腦中動脈起始端。栓塞90min后將線栓拔出至頸外動脈殘端實現(xiàn)再灌注。待大鼠完全清醒后，采用Longa 5分法[10]進行神經(jīng)功能評分，評分為2～3分者視為造模成功，入選實驗。Sham組在造模過程中，插入的線栓距頸總動脈分叉處約10mm即可，其余操作同上。因各種原因所致各組大鼠不足預設數(shù)量，均按隨機抽樣原則補齊實驗動物。

4 電針治療和PI3K/AKT通路抑制處理

參照中國針灸學會實驗針灸委員會制定的實驗動物穴位圖譜，選取大鼠“百會”穴（GV20）及左側(cè)“四關”穴（合谷 LI4/太沖 LR3）為電針穴位，利用直徑為0.38mm，長度為1寸的華佗牌不銹鋼銀針于“百會”穴處斜刺入頭皮1mm，直刺“四關”穴2mm，針刺“百會”穴及“四關”穴通電刺激。連接電針治療儀，刺激參數(shù)為：頻率2/20 Hz，疏密波型，強度以大鼠肢體輕微震顫為宜。I/RE和I/REL組首次電針刺激于再灌注后1h進行，刺激時間20min/次，每天治療1次，最長7d。I/REL組動物在造模成功后立即腹腔注射和PI3K/AKT通路抑制劑LY-294002。LY294002溶解于二甲亞砜，終濃度為0.1mg/ml，計量為0.3mg/kg/d[12]。

5 流式細胞術檢測

3.5%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠后，用含肝素鈉的抗凝管取腹主動脈血約2ml備用。后用含2%胎牛血清的IMDM培養(yǎng)基沖洗出大鼠脛骨和股骨的骨髓細胞，吹打混勻后，采用70μm細胞篩過目，離心后重懸細胞，采用1% PBS調(diào)整細胞數(shù)為1×106左右備用[1]。取骨髓和外周血細胞懸液各100μl，各加2μl PE-CD34抗體，4℃避光孵育20min，后加 ml紅細胞裂解液，4℃避光孵育10min，4℃ 1500r/min離心5min，棄上清，加入2ml PBS重懸細胞，4℃1500r/min 離心5min，最后用100μl PBS重懸細胞，流式細胞儀上機檢測。

6 酶聯(lián)接免疫吸附劑測定（ELISA）

將清洗干凈的玻璃勻漿管行高溫高壓滅菌備用，加入1ml蛋白裂解液RIPA和10μl PMSF，在各指定時間點分別提取各組大鼠股骨和脛骨新鮮骨髓，放入勻漿管中充分勻漿至組織溶解，將組織勻漿液移入離心管，于4℃條件下12000rpm/min離心10min，取上清備用。按照ELISA操作步驟按照說明書分別檢測各樣本p-AKT、AKT、eNOS含量。

7 CD34+ 微血管密度的免疫熒光檢測

將各組大鼠腦組織冰凍切片（厚度為10μm）于-80℃冰箱取出，室溫放置10min，PBS沖洗5min，加入5% Trition 于37 ℃孵育30min，PBS洗5min共3次，后用5% 山羊血清于37℃封閉1h，甩干血清，兔抗CD34一抗（1∶50）孵育，4℃過夜。第二天，37℃復溫1h，后用FITC標記的山羊抗兔二抗于37℃孵育1h。激光掃描共聚焦顯微鏡觀察、拍照和計數(shù)。CD34+微血管密度判定方法：在20倍（物鏡）視野下計數(shù)血管直徑＜20μm或單個細胞陽性，但和周圍細胞分界清楚視為一個新生血管，微血管數(shù)(個/HP)為每個視野下的血管數(shù)。

8 統(tǒng)計學分析

數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標準差表示，應用SPSS19.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)，采用單因素方差分析，兩組間比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05具有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 LY294002抑制電針對腦缺血再灌注大鼠骨髓和外周血中CD34+ EPCs數(shù)量的增加

流式細胞術檢測顯示，腦缺血再灌注后24h和48h，大鼠骨髓和外周血中CD34+EPCs數(shù)量較Sham組明顯增多，再灌注后第7d，CD34+EPCs數(shù)量高于Sham組，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。缺血再灌注后進行EA處理，骨髓和外周血中CD34+EPCs數(shù)量在各個觀察時間點均較未進行電針處理的缺血再灌注大鼠均明顯增多，而用LY294002阻斷PI3K/AKT通路后，電針處理不再增加缺血再灌注大鼠骨髓和外周血CD34+EPCs數(shù)量（圖1）。

2 LY294002抑制電針對腦缺血再灌注大鼠骨髓p-AKT和eNOS含量的增加

ELISA檢測顯示，腦缺血再灌注后24h、48h和72h，大鼠骨髓p-AKT和eNOS含量較Sham組明顯增多；缺血再灌注后進行EA處理，骨髓p-AKT和eNOS含量在各個觀察時間點均較未進行電針處理的缺血再灌注大鼠均明顯增多，而用LY294002阻斷PI3K/AKT通路后，電針處理不再增加缺血再灌注大鼠骨髓p-AKT和eNOS。不同組別在缺血再灌注后各個時間點總AKT蛋白含量差異無統(tǒng)計學意義。

圖1 電針對腦缺血再灌注大鼠骨髓及外周血CD34+ EPCs數(shù)量的影響。A1，骨髓CD34+ EPCs代表性流式細胞術檢測結果；A2，骨髓CD34+EPCs數(shù)量統(tǒng)計分析；B1，外周血CD34+ EPCs代表性流式細胞術檢測結果； B2，外周血CD34+ EPCs數(shù)量的統(tǒng)計分析；*，P＜0.01 vs Sham組；#，0.01＜P＜0.05 vs I/R組；&，0.01＜P＜0.05 vs I/REL組；n=6Fig.1 Effect of electronacupuncture on the number of CD34+ EPCs in the bone marrow and peripheral blood of the rats with cerebral ischemia/reperfusion. A1, representative flow cytometry results of CD34+ EPCs in the rat bone marrow; A2, statistical analysis for the number of CD34+ EPCs in the rat bone marrow; B1, representative flow cytometry results of CD34+ EPCs in the rat peripheral blood; B2, statistical analysis for the number of CD34+EPCs in rat peripheral blood; *, P＜0.01 vs Sham group; #, 0.01＜P＜0.05 vs I/R group; &, 0.01＜P＜0.05 vs I/REL group; n=6

圖2 LY294002和電針對腦缺血再灌注大鼠骨髓p-AKT 和eNOS含量的影響。A，ELISA檢測骨髓pAKT含量的統(tǒng)計學分析；B，ELISA檢測骨髓總AKT含量的統(tǒng)計學分析比較；C，ELISA檢測骨髓eNOS含量的統(tǒng)計學分析；*，P＜0.01 vs Sham組；#，0.01＜P＜0.05 vs I/R組；&，P＜0.01 vs I/REL組；n=4Fig.2 Effect of LY294002 and electroacupuncture on the content of p-AKT, AKT and eNOS in the bone marrow of the rats with cerebral ischemia/reperfusion. A, statistical analysis for the content of pAKT detected by ELISA in the bone marrow; B, statistical analysis for the content of total AKT detected by ELISA in the bone marrow; C, statistical analysis for the content of eNOS detected by ELISA in the bone marrow; *, P＜0.01 vs Sham group; #, 0.01＜P＜0.05 vs I/R group; &, P＜0.01 vs I/REL group; n=4

3 LY294002抑制電針對腦缺血再灌注大鼠缺血區(qū)大腦皮質(zhì)CD34+微血管密度的增加

免疫熒光共聚焦結果顯示，再灌注后24h，大腦皮質(zhì)缺血區(qū)CD34+的新生血管以單個細胞為主，管腔較小，再灌注后7d缺血區(qū)新生血管密度增加，多種管徑大小的血管并存。腦缺血再灌注后24h、48h和7d，大鼠大腦皮質(zhì)缺血區(qū)CD34+MVD較Sham組明顯增多。缺血再灌注后進行EA處理，大腦皮質(zhì)缺血區(qū)CD34+MVD在各個觀察時間點均較未進行電針處理的缺血再灌注大鼠均明顯增多，而用LY294002阻斷PI3K/AKT通路后，電針處理不再增加缺血再灌注大鼠大腦皮質(zhì)缺血區(qū)CD34+MVD。

圖3 LY294002和電針對腦缺血再灌注大鼠缺血區(qū)大腦皮質(zhì)CD34+ 微血管密度的影響。A，大腦皮質(zhì)CD34+微血管密度的免疫熒光檢測；B，CD34+微血管密度的統(tǒng)計分析；*，P＜0.01 vs Sham組；#，0.01＜P＜0.05 vs I/R組；&，P＜0.01 vs I/REL組；n=6Fig.3 Effect of LY294002 and electroacupuncture on the CD34+ microvessel density in the ischemia cerebral cortex of the rats with cerebral ischemia/reperfusion. A, immuno fluorescent detection for CD34+ microvessel density in the cerebral cortex; B, statistical analysis for the CD34+ microvessel density; *, P＜0.01 vs Sham group; #, 0.01＜P＜0.05 vs I/R group; &, P＜0.01 vs I/REL group; n=4

討 論

修復受損內(nèi)皮細胞、促進腦血管再生一直是缺血性腦卒中的治療難題。近年來， EPCs以其強大的促血管再生潛能成為缺血性腦卒中治療的研究熱點。EPCs是一類主要來源于骨髓，具有游走性，并能定向分化為成熟內(nèi)皮細胞特性的未成熟內(nèi)皮細胞[13]。缺血性腦卒中后患者外周血EPCs水平與患者腦梗死面積及預后明顯相關[14,15]。近年來對腦缺血后EPCs在腦血管再生中的作用研究多采用細胞移植手段，研究發(fā)現(xiàn)移植的EPCs可定向歸巢至腦缺血區(qū)參與血管再生[16,17]。本課題組前期從整體水平出發(fā)，對局灶腦缺血/再灌注大鼠脛骨骨髓腔注射可被EPCs特異性攝取的Dil標記的乙酰化低密度脂蛋白（DIL-acLDL），追蹤活體內(nèi)骨髓EPCs的運行軌跡，于再灌注后第1-7d均在大鼠外周血檢測出DIL-acLDL+CD34+EPCs，直觀證實了腦缺血損傷后機體可動員自身內(nèi)源性骨髓EPCs至外周血參與血管再生[18]。然而生理條件下，機體骨髓和外周血EPCs數(shù)量相當有限[19]，盡管腦缺血后腦內(nèi)血管生成機制立即被啟動，但機體的自我修復能力有限，遠不足以代償原有血供。因此，在缺血性腦損傷修復過程中，探索如何促進骨髓EPCs動員到外周血，歸巢到腦內(nèi)，促進腦內(nèi)血管再生至關重要。

大量研究表明，電針治療可有效上調(diào)局灶腦缺血/再灌注大鼠骨髓和外周血EPCs數(shù)量。由于EPCs具有許多細胞表面標記物，如CD34、CD133、CD144、CD31、Vwf、VEGFR2、Tie2和c-kit/CD117等，在EPCs增殖分化為成熟內(nèi)皮細胞過程中，EPCs可呈現(xiàn)多種動態(tài)細胞表面標記組合，至今尚無特異性鑒定EPCs的方法。因此，在研究電針對缺血性腦卒中大鼠骨髓及外周血EPCs數(shù)量時，不同研究所選取的標記物有所不同。王秀志等[20]發(fā)現(xiàn)，電針可增加局灶腦缺血/再灌注大鼠外周血VEGFR2+PECAM-1+EPCs數(shù)量，上調(diào)腦缺血皮質(zhì)VEGFR-2、PECAM-1的表達，促進缺血區(qū)腦血管形成。趙瑛等[21]研究表明，電針可通過上調(diào)局灶腦缺血/再灌注大鼠外周血CD31+VEGFR2+EPCs數(shù)量、上調(diào)外周血VEGF的表達從而促進血管再生，推測電針動員大鼠內(nèi)源性EPCs的機制可能與VEGF表達上調(diào)有關。Xie等[1]研究表明，電針治療可上調(diào)局灶腦缺血/再灌注大鼠外周血和骨髓CD34+VEGFR2+EPCs數(shù)量，該作用與電針治療增加大鼠骨髓、外周血和大腦缺血皮質(zhì)SDF-1α表達，促進SDF-1α濃度梯度的形成，增加SDF-1α濃度梯度差值并延長作用時間有關。此外，電針亦可上調(diào)缺血性腦卒中大鼠骨髓及外周血VEGFR2+EPCs、CD34+EPCs數(shù)量。由于CD34是一直存在于不同時期EPCs表面的標記物，對鑒定EPCs具有敏感性、特異性和可靠性，是科研及臨床研究與應用中較好的標記物等[22,23]，故本研究選取CD34作為EPCs表面標記物。本研究結果表明，電針可上調(diào)局灶腦缺血/再灌注大鼠骨髓和外周血CD34+EPCs數(shù)量，其中骨髓內(nèi)CD34+EPCs數(shù)量于再灌注后24h達到高峰，后隨再灌注時間的延長逐漸減少，而外周血中CD34+EPCs數(shù)量于再灌注后24h開始增高，48h時升至最高，后逐漸減少，骨髓CD34+EPCs數(shù)量逐漸減少，而外周血CD34+EPCs數(shù)量逐漸升高，但再灌注后48h，外周血CD34+EPCs數(shù)量隨再灌注時間延長而呈遞減趨勢，推測該結果與CD34+EPCs在機體內(nèi)先由骨髓內(nèi)動員至外周血，之后又歸巢到腦缺血區(qū)有關。

研究表明，PI3K/AKT是具有代表性的與EPCs增殖、遷移、歸巢相關的信號轉(zhuǎn)導通路[4-6]。在各種病生理條件刺激下，機體骨髓PI3K/AKT信號途徑被激活，AKT磷酸化增多，活化的AKT可誘導eNOS合成，使一氧化氮（NO）合成增多，NO促進基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）硝基化，活化的MMP-9使EPCs易于脫離骨髓微環(huán)境，參與缺血區(qū)血管生成[24-26]。本團隊前期研究表明，電針治療可通過PI3K/AKT信號促進腦缺血后腦內(nèi)血管再生[8,27]。Ying等[24]發(fā)現(xiàn)采用LY294002阻斷PI3K作用后，EPCs的細胞活力降低，EPCs促血管再生的能力明顯減弱。Wang等[25]研究發(fā)現(xiàn)，當PI3K作用被wortmannin阻斷后，骨髓EPCs的遷移能力顯著降低。此外，研究表明缺乏eNOS的小鼠，VEGF誘導的骨髓EPCs的動員能力明顯減弱[26]，提示PI3K/AKT信號途徑在促進骨髓EPCs動員及血管再生中具有重要作用。由于目前關于骨髓PI3K/AKT/eNOS信號途徑在電針上調(diào)骨髓及外周血EPCs數(shù)量中的作用尚不十分明確，故本研究通過采用藥物干預，探討電針對骨髓EPCs的動員作用是否是通過對PI3K/AKT的調(diào)控來實現(xiàn)的。本研究結果表明，腦缺血可誘導骨髓pAKT和eNOS蛋白表達增多，且pAKT和eNOS蛋白表達隨再灌注時間延長逐漸增多，而總AKT蛋白含量不變，提示腦缺血損傷可誘導機體骨髓內(nèi)源性PI3K/AKT/eNOS信號途徑的激活。根據(jù)本研究結果，電針治療使得骨髓PI3K/AKT/eNOS信號途徑被進一步激活，同時電針可促進骨髓EPCs動員至外周血，這提示我們兩者之間是否具有某種關聯(lián)呢？為進一步證實電針上調(diào)骨髓、外周血EPCs是否是通過進一步促進骨髓PI3K/AKT信號途徑激活完成，本研究采用腹腔注射LY294002特異性阻斷PI3K作用的方式，探討電針促進骨髓EPCs動員的可能機制。研究表明，采用0.3mg/kg劑量的LY294002腹腔注射，可以有效抑制SD大鼠體內(nèi)PI3K/AKT信號通路，故本研究亦采用該劑量[12]。本研究結果表明，腹腔注射LY294002后，電針未能促進AKT蛋白磷酸化，且未能明顯上調(diào)eNOS蛋白表達。同時，電針促進骨髓CD34+EPCs動員至外周血的作用被明顯削弱，表現(xiàn)為LY294002處理可抑制電針對EPCs再生能力的增加，提示電針可通過動員骨髓內(nèi)EPCs至外周血的作用是通過其促進骨髓PI3K/AKT信號通路完成的。研究表明，歸巢至缺血區(qū)的EPCs可通過參與缺血組織的血管重建和損傷血管的再內(nèi)皮化發(fā)揮促血管再生的作用。由于CD34廣泛分布于毛細血管內(nèi)皮細胞及其前體細胞，在成熟血管內(nèi)皮中的表達很低[28]，采用CD34作為細胞表面標記計數(shù)微血管密度，具有較高的特異性、敏感性和可重復性[29]。因此本研究采用CD34作為微血管的標記物。本研究發(fā)現(xiàn)，當阻斷PI3K/AKT通路后，電針治療未能提高大腦皮質(zhì)缺血區(qū)CD34標記的微血管密度，表明電針治療促進腦內(nèi)血管再生的作用被明顯抑制，而這一結果可能與電針促進骨髓EPCs動員至外周血的效應被抑制有關。

本研究在既往研究的基礎上，采用腹腔注射LY294002特異性阻斷PI3K作用，抑制AKT磷酸化，同時研究不同時間點大腦皮質(zhì)缺血區(qū)內(nèi)腦內(nèi)血管再生情況。我們發(fā)現(xiàn)電針上調(diào)局灶腦缺血/再灌注大鼠骨髓和外周血EPCs數(shù)量以及促進大腦皮質(zhì)缺血區(qū)血管再生的效應在阻斷PI3K/AKT信號通路后明顯減弱，直接證實了電針可通過PI3K/AKT介導骨髓EPCs動員至外周血，為電針在臨床上治療缺血性腦卒中提供了一定的理論依據(jù)。