王 端，賀 莉，張 婕，趙小艷，熊曉藩，賀文香，張海清，陳艷妮,

(1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西 咸陽 712000；2.西安市兒童醫(yī)院，陜西 西安 710000；3.西安交通大學(xué)，陜西 西安 710000)

抽動障礙(tic disorders,TD)是一種常于兒童時期起病，以不自主、反復(fù)、快速、無目的一個部位或多部位肌肉運(yùn)動性抽動或發(fā)聲性抽動為主要臨床表現(xiàn)[1]，并可伴有注意力不集中、多動、強(qiáng)迫性動作或其他精神行為癥狀的慢性神經(jīng)精神疾病[2]。本病可歸屬于中醫(yī)學(xué)“慢驚風(fēng)”、“瘛瘲”、“肝風(fēng)”等范疇。關(guān)于抽動癥狀的描述最早可追溯到遠(yuǎn)古時代，但關(guān)于抽動障礙的病因及發(fā)病機(jī)制至今仍不清楚，治療藥物也因副作用明顯而僅限于當(dāng)抽動癥狀影響患兒或家長生活或?qū)W習(xí)時才予使用。目前認(rèn)為TD具有明顯的遺傳傾向，但卻無法以常染色體顯性、隱性或性聯(lián)遺傳方式來解釋[3]，故多認(rèn)為TD是遺傳因素與環(huán)境因素相互作用的結(jié)果。蛋白組學(xué)技術(shù)作為后基因時代的一種重要方法，可提供疾病病理過程中豐富的生物學(xué)信息，有助于進(jìn)一步揭示TD的發(fā)病機(jī)制及探尋治療靶點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)采用磁珠結(jié)合、基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜儀聯(lián)用技術(shù)(MALDI-TOF-MS)，對TD最常見證型氣郁化火證、脾虛痰聚證患兒及正常兒童血清蛋白組進(jìn)行比較，得出差異血清蛋白，從蛋白質(zhì)水平揭示兒童TD的發(fā)病機(jī)制及不同中醫(yī)證型間的微觀物質(zhì)表達(dá)。

1對象與方法

1.1研究對象

所有研究對象均來源于2017年4至9月西安市兒童醫(yī)院兒?？崎T診，包括TD患兒60例(氣郁化火證34例、脾虛痰聚證26例)及同時期體檢無特殊疾病的健康兒童30例，分別作為TD組和健康對照組。本研究經(jīng)西安市兒童醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有入組兒童監(jiān)護(hù)人均簽署知情同意書。各組年齡、性別比較均無統(tǒng)計學(xué)差異，見表1。

組別例數(shù)(n) 性別 男女年齡(歲)健康對照組3026(86.67)4(13.33)7.36±2.11TD組6052(86.67)8(13.33)7.46±2.23 脾虛痰聚證21(80.77)5(19.23)7.71±2.45 氣郁化火證31(91.18)3(8.82)7.26±2.06χ2/t1.1420.112P0.7030.947

1.2納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：TD組均符合美國《精神疾病診斷與統(tǒng)計手冊》第5版TD診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]及《中醫(yī)兒科學(xué)》第9版TD氣郁化火證或脾虛痰聚證的證型標(biāo)準(zhǔn)[5]；18歲以下兒童，不限男女；無其它神經(jīng)精神類疾??；未服用過多巴胺受體阻滯劑、選擇性單胺能阻滯劑、多巴胺自身受體激動劑、中樞性α受體激動劑、選擇性5-羥色胺再攝取抑制劑等影響神經(jīng)遞質(zhì)的藥物。排除標(biāo)準(zhǔn)：同時患有其它神經(jīng)精神類疾病的兒童；有服用多巴胺受體阻滯劑、選擇性單胺能阻滯劑、多巴胺自身受體激動劑、中樞性α受體激動劑、選擇性5-羥色胺再攝取抑制劑等影響神經(jīng)遞質(zhì)的藥物史的兒童；多種中醫(yī)證型夾雜的患兒。

1.3材料及方法

1.3.1主要儀器及試劑

磁珠試劑盒：Profiling Kit 100 MB-WCX(貨號8223983)、基質(zhì)2-氰基-4羥基肉桂酸(a-Cyano-4-hydroxycinnamicacid，HCCA)、磁珠分離器、AnchorChipTM質(zhì)譜板、蛋白質(zhì)芯片飛行時間質(zhì)譜儀autoflex III smartbeam均購買自德國Bruker公司；采集軟件：flexControl 3.3；標(biāo)峰軟件：flexAnalysis；統(tǒng)計軟件：Clinpro Tools。

1.3.2標(biāo)本采集及處理

采集肘靜脈血3mL于乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-k2)管中，搖勻，室溫下靜置2h，10℃、3 300r/min離心10min，取上層血清于EP管中，編號，保存于-20℃冰箱備檢。

1.3.3蛋白質(zhì)檢測

樣本處理：-20℃取出血清置于冰上融化。磁珠處理：①4℃冷藏儲存室取出WCX磁珠懸浮液，完全混勻1min；②取7μL磁珠置于200μL樣品管中，并加入10μL磁珠結(jié)合緩沖液(binding buffer，BB)，吹打20次混勻，再加入5μL樣本，吹打10次混勻，室溫靜置5min；③將樣品管放入磁珠分離器，使磁珠貼壁2min，液體澄清，棄上清液；④向樣品管中加入100μL洗脫液(wash buffer,WB)，在磁珠分離器中來回移動10次，靜置1min，棄上清液，共洗3次；⑤加入5μL洗脫液(elution buffer,EB)吹打20次混勻后使磁珠貼壁2min，轉(zhuǎn)移上清液至新管；⑥加入5μL穩(wěn)定液(stabilization buffer,SB)，混勻。點(diǎn)樣：吸取1μL的處理樣本至直徑600μL的AnchorChipTM質(zhì)譜板上，放置于室溫下，待干燥后吸取1μL 0.3g/L濃度HCCA溶液至滴有處理樣本的質(zhì)譜板孔中，置于室溫下干燥。上機(jī)：啟動autoflex III smartbeam布魯克質(zhì)譜儀，放入質(zhì)譜板，校正機(jī)器。應(yīng)用flexControl 3.3采集軟件，每個樣本孔采集3次，以驗(yàn)證穩(wěn)定性。應(yīng)用flexAnalysis 3.3標(biāo)峰軟件及ClinproTools統(tǒng)計軟件對蛋白波進(jìn)行分析，選擇差異峰標(biāo)準(zhǔn)P<0.05，差異倍數(shù)>1.9，受試者工作特征曲線下面積(AUC)>0.7。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法

2結(jié)果

2.1TD組與健康對照組血清蛋白比較

本研究60例TD組患兒與30例健康對照組共檢測蛋白峰64個，分析后發(fā)現(xiàn)，有5個不存在差異表達(dá)，有59個存在差異表達(dá)(P<0.05)，其中有8個蛋白峰存在顯著表達(dá)差異(P<0.01)，其中最大差異蛋白峰相對分子質(zhì)量(Mr)為6 642.05，差異倍數(shù)為3.24倍，最小差異蛋白峰Mr為2 293.11，差異倍數(shù)為1.98倍，見表2。

表 2 TD組與健康對照組差異蛋白峰

Table 2 Different protein peaks in TD group and healthy control group

2.2 TD氣郁化火證與脾虛痰聚證血清蛋白比較

本組患兒中，TD氣郁化火證與脾虛痰聚證血清蛋白比較，共檢測蛋白峰65個，有58個存在差異表達(dá)(P<0.05)，其中有2個顯著差異蛋白峰，見表3。

表3 氣郁化火證與脾虛痰聚證差異蛋白峰

Table 3 Different protein peaks in cases of syndrome of qi depression transforming into fire and cases of spleen deficiency leading to phlegm syndrome

3討論

3.1 TD與蛋白組學(xué)

TD是以抽動為主要臨床表現(xiàn)的神經(jīng)精神疾病，因其慢性、波動性、多發(fā)性的特點(diǎn)[1]使患兒家長倍受困擾，其中的Tourette綜合征(TS)更因常共患其他神經(jīng)精神疾病而使患者生活質(zhì)量較健康兒童低[6]。目前對于該病的生化研究主要集中于對腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)的研究，病因及發(fā)病機(jī)制并不明確，臨床診斷主要依靠描述性診斷并排除其他疾病，缺乏特異性診斷指標(biāo)，臨床用藥也因副作用而表現(xiàn)出局限性[7]。蛋白組學(xué)技術(shù)的興起及逐漸成熟提供了新的思路及方法，已在很多疾病領(lǐng)域有所突破，是臨床醫(yī)學(xué)中成熟的診斷工具，但在TD方面的研究還很少。本研究通過蛋白組學(xué)技術(shù)初步研究了TD患兒與健康兒童及氣郁化火證與脾虛痰聚證TD患兒的血清蛋白質(zhì)表達(dá)情況，比較出差異蛋白峰。將所得差異峰分子量輸入uniprot數(shù)據(jù)庫，共檢索得到3個與神經(jīng)精神疾病最相關(guān)的蛋白，分別為鋅指蛋白神經(jīng)源分化因子4、γ-氨基丁酸受體亞基α-2、神經(jīng)源煙堿乙酰膽堿受體亞基α-5。

3.2 TD與健康兒童差異表達(dá)蛋白

3.2.1 TD與鋅指蛋白神經(jīng)源分化因子4

鋅指蛋白神經(jīng)源分化因子4(Zinc finger protein neuro-d4 )是由Buchman等于1992年克隆出的新基因neuro-d4編碼的一種新型鋅指蛋白。鋅指蛋白廣泛存在，在基因的表達(dá)調(diào)控中起重要作用，一些鋅指蛋白在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育中起作用[8]。Buchman等還發(fā)現(xiàn)與編碼其它鋅指蛋白的基因不同，neuro-d4特異性表達(dá)于神經(jīng)系統(tǒng)，而且似乎僅限于某些特定的神經(jīng)元中，原位雜交與印跡雜交結(jié)果均顯示：在周圍神經(jīng)系統(tǒng)(背根神經(jīng)節(jié))以及在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的不同區(qū)域(在大腦皮層、海馬、多個腦干核和小腦)中檢測到neuro-d4 mRNA。雖然，既往關(guān)于TD的研究中，并沒有發(fā)現(xiàn)與鋅指蛋白神經(jīng)源分化因子4有關(guān)的直接證據(jù)，但該蛋白與神經(jīng)系統(tǒng)的密切關(guān)系使研究人員很難相信其與TD間沒有聯(lián)系。而且，Buchman等的研究還發(fā)現(xiàn)編碼該蛋白的基因在成年鼠表達(dá)水平要低于胚胎末期及新生兒期，即生后逐漸下降，TD好發(fā)于兒童及青少年，較少見于成人，這也進(jìn)一步驗(yàn)證了鋅指蛋白神經(jīng)源分化因子4與TD的關(guān)系。但因本研究中研究對象年齡較為集中，不能形成明顯的年齡分層，故無法從該實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步驗(yàn)證此說法。

3.2.2 TD與γ-氨基丁酸受體亞基α-2

γ-氨基丁酸受體亞基α-2(Gamma-amino￣butyric acid receptor subunit alpha-2)為γ-氨基丁酸受體的三級結(jié)構(gòu)，γ-氨基丁酸(GABA)為腦內(nèi)主要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，GABA能神經(jīng)通路則為抑制性通路。研究表明TD兒童GABA能系統(tǒng)活動減弱，如Mondrup等于1985年研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用氟柳雙胺(一種新型GABA受體激動劑)治療TD患兒，患兒不自主運(yùn)動有明顯減少。但與該蛋白分子量6 455相近的6 443.34蛋白峰在TD組中表達(dá)升高，與該理論不符，故本研究中所得差異蛋白并非γ-氨基丁酸受體亞基α-2。

3.2.3 TD與神經(jīng)源煙堿乙酰膽堿受體亞基α-5

神經(jīng)源煙堿乙酰膽堿受體亞基α-5(neuronal nicotinic acetylcholine receptor, alpha5 subunit ，nAChRα-5，又稱神經(jīng)源煙堿受體亞基α-5)為組成煙堿乙酰膽堿受體的一個亞基，煙堿-膽堿能神經(jīng)通路廣泛存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，并對中樞神經(jīng)系統(tǒng)起著非常重要的調(diào)節(jié)作用。研究表明煙堿受體與多種神經(jīng)性疾病相關(guān)[9]。近年來得益于神經(jīng)影像學(xué)的發(fā)展，大量研究已證實(shí)TD患兒中樞神經(jīng)系統(tǒng)存在解剖及功能異常，如Miller等[10]于2010年報道，TD患兒存在海馬、胼胝體、丘腦的發(fā)育異常；李秀麗等[11]于2010年通過彌散張量成像原理發(fā)現(xiàn)TD基底神經(jīng)節(jié)功能活動異常，并且與抽動的嚴(yán)重程度相關(guān)。而McPhillips 等(1988年)報道nAChR的激活與大腦各功能區(qū)域的發(fā)育成熟密切相關(guān)，故我們推測nAChRα-5可能通過影響神經(jīng)系統(tǒng)的成熟而導(dǎo)致TD。還有學(xué)者指出，nAChR可能對腦發(fā)育過程中谷氨酸(GLU)信號系統(tǒng)的發(fā)育成熟有重要影響[12]。GLU為哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)的主要內(nèi)源性神經(jīng)興奮物質(zhì)，GLU的主要受體之一使君子酸受體(AMPA)的數(shù)量決定突觸后神經(jīng)元的興奮程度，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中突觸傳遞的主要影響因素。唐洪麗等于2002年通過高效液相色譜法測定TD患兒血漿GLU的水平發(fā)現(xiàn)明顯高于正常對照組，且與TD所致的部分心理行為相關(guān)。故nAChRα-5也可能通過影響GLU信號系統(tǒng)而在TD的發(fā)生中發(fā)揮作用。TD與乙酰膽堿系統(tǒng)的關(guān)系尚未完全闡明，Quik等[13]報道指出，nAChR激動劑尼古丁減輕了抽動穢語障礙的運(yùn)動障礙癥狀，但Sarah等(2010年)則認(rèn)為TD是由多巴胺系統(tǒng)與膽堿能系統(tǒng)失衡所致，即膽堿能系統(tǒng)減弱。兩種觀點(diǎn)相反，若本研究所得差異蛋白峰后續(xù)經(jīng)鑒定確為nAChRα-5，則對進(jìn)一步研究TD與膽堿能系統(tǒng)的關(guān)系有一定的指導(dǎo)意義。

3.3 TD氣郁化火證與脾虛痰聚證差異表達(dá)蛋白

氣郁化火證與脾虛痰聚證TD患兒血清蛋白有2個差異蛋白峰，Mr為873.73、6 642.04，兩者均在脾虛痰聚證組高表達(dá)。同上，6 642.04蛋白峰所檢索出的蛋白為nAChRα-5。膽堿能系統(tǒng)與脾虛證之間的關(guān)系已被既往研究多次證實(shí)：陸佰榮等(2002年)運(yùn)用免疫組化法探討膽堿能神經(jīng)與中醫(yī)脾虛證之間的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)脾虛大鼠模型組免疫反應(yīng)明顯增強(qiáng)；吳慧等[14]則直接將膽堿酯酶作為判斷生、熟白術(shù)之枳術(shù)丸對脾虛食積證模型鼠的作用比較。本研究中6 642.04蛋白峰ROC曲線下面積為0.746，具有較強(qiáng)的臨床診斷能力，但本研究所發(fā)現(xiàn)的中醫(yī)兩種證型間的差異蛋白峰較少，差異倍數(shù)也不及健康對照組與TD組間大，猜測可能與病例收集過程中中醫(yī)證型主要靠臨床醫(yī)生經(jīng)驗(yàn)判斷，有一定的主觀性有關(guān)。6 642.04蛋白峰在TD患兒組高表達(dá)，同時又是中醫(yī)兩種證型之間的差異蛋白，故推測該蛋白不僅可能成為診斷TD的潛在指標(biāo)，還可能成為區(qū)分兩種證型的潛在生物學(xué)標(biāo)志物。對于改變以前僅靠臨床醫(yī)生個人經(jīng)驗(yàn)區(qū)分證型，建立簡潔、高效、客觀、可重復(fù)的中西醫(yī)結(jié)合辨證體系有重要意義。

目前對于TD及其中醫(yī)相關(guān)證型蛋白組學(xué)研究較少，由于本研究尚處于初步研究階段，只發(fā)現(xiàn)了一些差異表達(dá)蛋白峰，尚未對差異蛋白進(jìn)行鑒定及進(jìn)一步研究。該研究所發(fā)現(xiàn)的差異蛋白可能對TD發(fā)病機(jī)制研究、發(fā)現(xiàn)特異性診斷指標(biāo)及靶向治療藥物的開發(fā)有一定的作用，并可能會為中醫(yī)不同證型發(fā)病機(jī)制進(jìn)行闡釋、形成新的中西醫(yī)結(jié)合辨證體系、進(jìn)一步建立中醫(yī)診斷模型有一定幫助，因此關(guān)于兒童TD蛋白組學(xué)仍需進(jìn)一步研究。

[1]劉智勝.兒童抽動障礙[M].2版,北京:人民衛(wèi)生出版社,2015:3-4,50-53.

[2]Amiri S,Fakhari A,Golmirzaei J,etal.Tourette’s syndrome, chronic tics, and comorbid attention deficit/hyperactivity disorder in elementary students[J].Arch Iran Med,2012,15(2):76-78.

[3]王旸,劉金同.抽動障礙的遺傳學(xué)研究[J].山東精神醫(yī)學(xué),2006,19(1):69-72.

[4]American Psychiatric Association.Diagnostic and statistical manual of mental disorders (DSM-5)[M].5th ed.Arlington:American Psychiatric Pub,2013:81.

[5]汪受傳,虞堅(jiān)爾.中醫(yī)兒科學(xué)[M].9版,北京:中國中醫(yī)藥出版社,2012:175.

[6]Rizzo R,Gulisano M,Pellico A,etal.Tourette syndrome and comorbid conditions: a spectrum of different severities and complexities[J].J Child Neurol,2014,29(10):1383-1389.

[7]房夏玲,高文娟,陳寧,等.抽動障礙患兒及父母心理干預(yù)的臨床研究[J].中國婦幼健康研究,2016,27(3):329-331.

[8]Matsushita F,Kameyama T,Kadokawa Y,etal.Spatiotemporal expression pattern of Myt/NZF family zinc finger transcription factors during mouse nervous system development[J].Dev Dyn,2014,243(4):588-600.

[9]Foucault-Fruchard L,Antier D.Therapeutic potential of α7 nicotinic receptor agonists to regulate neuroinflammation in neurodegenerative diseases[J]. Neural Regen Res,2017,12(9):1418-1421.

[10]Miller A M,Bansal R,Hao X,etal.Enlargement of thalamic nuclei in Tourette syndrome[J].Arch Gen Psychiatry,2010,67(9):955-964.

[11]李秀麗,孫錦華,李飛,等.彌散張量成像技術(shù)研究抽動穢語綜合征患兒基底節(jié)及丘腦微小結(jié)構(gòu)異常[J].四川大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版),2010,41(2):284-287.

[12]段晶晶.煙堿對發(fā)育過程中海馬神經(jīng)元AMPA和NMDA受體的調(diào)制作用[D].廣州:中山大學(xué),2010.

[13]Quik M,Zhang D H,Perez X A,etal.Role for the nicotinic cholinergic system in movement disorders; therapeutic implications[J].Pharmacol Ther,2014,144(1):50-59.

[14]吳慧,趙文龍,單國順,等.生、熟白術(shù)之枳術(shù)丸對脾虛食積模型鼠作用的比較研究[J].中成藥,2013,35(10):2093-2097.