蔣邱逃 孫華杰

（1四川省成都市武侯區(qū)疾病預(yù)防控制中心 四川 成都 610041）（2深圳市龍華區(qū)疾病預(yù)防控制中心 廣東 深圳 518000）

1.前言

傳統(tǒng)PCR需要分離染色，定量不準(zhǔn)，因此在退火、延伸過(guò)程中對(duì)核酸中EB含量進(jìn)行檢測(cè)，從而對(duì)目標(biāo)基因精確定量。此方法為非特異性的，僅能反映核酸總量。于是在接下來(lái)的幾年中，研發(fā)出了實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，比原技術(shù)有了質(zhì)的飛躍，使得DNA定量更高效，分析更準(zhǔn)確，靈敏性更高。

因此對(duì)諾如病毒進(jìn)行相應(yīng)的檢測(cè)尤為必要，主要檢測(cè)方式有逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(即RT-PCR)以及酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(即ELISA)。又因?yàn)樵摬《静荒荏w外培養(yǎng)，相關(guān)動(dòng)物模型匱乏，變異型較多，為檢測(cè)增加了難度。

2.實(shí)驗(yàn)方法

2.1 材料與方法

2.1.1 樣品采集 191份糞便樣本采集自山東省青島市（可改），臨床病例表現(xiàn)為腹瀉、腹痛、嘔吐, 部分患者出現(xiàn)寒戰(zhàn)、發(fā)熱。樣品用PBS配制成20%糞便懸液，保存于-80℃。

2.1.2 試劑儀器 TIANamp Virus RNA Kit購(gòu)自TIANGEN公司，PrimeScript RT Reagent Kit購(gòu)自TaKaRa公司。

2.2 引物與探針

引物及探針設(shè)計(jì)如表1所示，由上海生工生物有限公司合成。

表1 引物探針及序列

2.3 RNA提取

按照TIANamp Virus RNA Kit提取試劑盒步驟進(jìn)行。4000r/min離心20min后，取上清，用于下一步實(shí)驗(yàn)。提取后用PrimeScript RT Reagent Kit試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。

2.4 常規(guī)RT-PCR

2.4.1反應(yīng)條件 優(yōu)化篩選最佳條件，總體系為25μl，其中PCR Buffer為2.5μl，Tag酶0.5U，上、下游引物都為1.25μl，dNTP為3.0μl，cDNA為3.0μl，用無(wú)菌水補(bǔ)足。步驟為94℃預(yù)變性3min，94℃變性30s，54℃退火30s，72℃延伸30s，循環(huán)數(shù)為40。

2.4.2靈敏度、特異性檢測(cè) 對(duì)靈敏度進(jìn)行檢測(cè)，利用分光光度計(jì)進(jìn)行定量實(shí)驗(yàn)，梯度稀釋后分別對(duì)1-105copies/μl的兩種病毒進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)。對(duì)星狀病毒、腺病毒等進(jìn)行檢測(cè)，分析其特異性。

2.5 熒光定量RT-PCR

2.5.1反應(yīng)條件 同樣選取最佳反應(yīng)條件，總體系為20μl，其中2Premix Ex Taq 為10μl，50Rox Reference DyeⅡ?yàn)?.4μl，上、下游引物都為1.6μl，探針為0.8μl，模板cDNA為2.0μl。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性30s，95℃變性5s，60℃退火34s，循環(huán)數(shù)為40。最終在60℃條件下檢測(cè)熒光。

2.5.2標(biāo)準(zhǔn)曲線 用含有GⅠ、GⅡ型諾如病毒目的擴(kuò)增片段的質(zhì)粒來(lái)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。在紫外分光光度計(jì)下檢測(cè)吸光度，并轉(zhuǎn)換為copies數(shù)量。梯度稀釋質(zhì)粒，分別進(jìn)行PCR檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后對(duì)收集到的CT值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。

2.5.3靈敏度、特異性、重復(fù)性檢測(cè) 對(duì)靈敏度進(jìn)行檢測(cè)，利用分光光度計(jì)進(jìn)行定量實(shí)驗(yàn)，梯度稀釋后分別對(duì)1～105copies/μl的兩種病毒進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)。對(duì)星狀病毒、腺病毒等進(jìn)行檢測(cè)，分析其特異性。對(duì)不同濃度病毒進(jìn)行分析，每個(gè)濃度重復(fù)5次，計(jì)算平均值，標(biāo)準(zhǔn)差等。

3.結(jié)果及分析討論

3.1 結(jié)果

3.1.1常規(guī)RT-PCR 對(duì)GⅠ、GⅡ型諾如病毒的靈敏性及特異性檢測(cè)中，發(fā)現(xiàn)從103-105copies/μl均可檢測(cè)出條帶，最低檢出限為103copies/μl。而對(duì)星狀病毒、腺病毒以及腸道病毒等均無(wú)交叉反應(yīng)，GⅠ、GⅡ型諾如病毒之間也無(wú)交叉反應(yīng)。以上實(shí)驗(yàn)證明該方法具有良好的靈敏性及較高的特異性。

標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示，均呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系。圖1中左圖A，R2=0.996，右圖B，R2=0.998，擴(kuò)增效率分別為101.336%、103.558%。

圖1 GⅠ、GⅡ型諾如病毒標(biāo)準(zhǔn)曲線

3.1.2熒光定量RT-PCR 對(duì)GⅠ、GⅡ型諾如病毒的靈敏性檢測(cè)中，發(fā)現(xiàn)從102-105copies/μl均有較好的擴(kuò)增曲線，最低檢出限為102copies/μl。在特異性檢測(cè)中，星狀病毒、腺病毒以及腸道病毒等沒(méi)有信號(hào)，而GⅠ、GⅡ型諾如病毒均有相應(yīng)的熒光信號(hào)，且GⅠ、GⅡ型諾如病毒之間也無(wú)交叉反應(yīng)。這也證明了本實(shí)驗(yàn)中設(shè)計(jì)的引物和探針特異性較好。

對(duì)熒光定量RT-PCR的重復(fù)性實(shí)驗(yàn)中，分別對(duì)GⅠ、GⅡ型諾如病毒稀釋10倍，進(jìn)行批內(nèi)、批間重復(fù)試驗(yàn)，結(jié)果如表2所示，標(biāo)準(zhǔn)差范圍為0.10～0.59，變異系數(shù)范圍為0.43%～2.84%，可見(jiàn)批內(nèi)、批間重復(fù)性良好。

表2 GⅠ、GⅡ型諾如病毒重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

3.1.3 臨床樣品檢測(cè)分析 對(duì)191份臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)，其中常規(guī)RT-PCR陽(yáng)性樣本數(shù)為142，檢出率為74.34%，而用熒光定量RT-PCR的陽(yáng)性樣本為163，檢出率有所提高，為85.34%，兩種方法檢出率有顯著差異（P＜0.05）。如表3所示。

表3 兩種檢測(cè)方法對(duì)比

3.2 討論

NV家族病毒種類多，變異多，又缺少相應(yīng)的動(dòng)物模型，早期研究只能用電鏡檢測(cè)，但此法靈敏度很低，且技術(shù)要求高，過(guò)程復(fù)雜。隨著分子技術(shù)的不斷發(fā)展，新技術(shù)方法不斷被研發(fā)、運(yùn)用，RT-PCR、ELISA等已被廣泛運(yùn)用，使得諾如病毒的檢測(cè)方法更為高效、特異。ELISA較電鏡法更為靈敏，但檢出率較低，且假陽(yáng)性較多，RT-PCR法則更加快速準(zhǔn)確，繼承了ELISA的高靈敏性，又降低了假陽(yáng)性概率，因此廣泛運(yùn)用于諾如病毒的檢測(cè)中。諾如病毒感染引發(fā)的疾病發(fā)病、傳播較快，會(huì)在短時(shí)間內(nèi)爆發(fā)，因此需要在較短時(shí)間內(nèi)盡快檢測(cè)數(shù)量巨大的臨床樣本，利用熒光定量RT-PCR可以達(dá)到這一目的?？蓪?duì)人體造成危害的GⅠ、GⅡ型諾如病毒分別有14、17個(gè)亞型，而設(shè)計(jì)出適合的引物和探針尤為重要。對(duì)常規(guī)RT-PCR檢測(cè)諾如病毒的引物對(duì)比發(fā)現(xiàn)，Kojima等對(duì)衣殼蛋白保守區(qū)的引物設(shè)計(jì)GⅠ-SKF/GⅠ-SKR及Ⅱ型的相關(guān)設(shè)計(jì)，較為理想，而之前的實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR引物和探針設(shè)計(jì)主要是針對(duì) ORF1的聚合酶區(qū)段和ORF2的殼蛋白區(qū)段。Kageyama設(shè)計(jì)的引物和探針是針對(duì)NV RNA 的 ORF1-ORF2 交界處的N/S結(jié)構(gòu)域設(shè)計(jì)的，適合用于 NV 的檢測(cè)與分型，敏感性及特異性較好，靈敏度也較高，可達(dá)99%。

本文中采用常規(guī)RT-PCR與熒光定量RT-PCR均可較好的檢測(cè)出GⅠ、GⅡ型諾如病毒，且特異性較好。其中，熒光定量RT-PCR檢出限比常規(guī)RT-PCR提高約10倍。本文中采用的方法與基于Allglo探針的一步法效率沒(méi)有明顯差別。而比二步法的靈敏度高10倍。對(duì)191份臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)的最終結(jié)果顯示，常規(guī)RT-PCR陽(yáng)性樣本數(shù)為142，檢出率為74.34%，熒光定量RT-PCR的陽(yáng)性樣本為163，檢出率為85.34%，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析后發(fā)現(xiàn)，兩種方法檢出率有顯著差異（P＜0.05）。同時(shí)對(duì)陽(yáng)性樣本進(jìn)行測(cè)序分析，結(jié)果顯示都為諾如病毒，證明RT-PCR法較為可靠。但對(duì)數(shù)量較多的臨床樣本來(lái)說(shuō)，熒光定量RT-PCR敏感性更高，特異性更強(qiáng)，檢測(cè)速度更快，同時(shí)可以完全閉管，極大的避免了假陽(yáng)性概率，使得高通量測(cè)序變的可行，熒光探針也使該法更有效，省去了酶切分析、探針雜交驗(yàn)證等步驟，建議優(yōu)先使用。

[1]劉巍,隆文杰,石玲玲,等.應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR技術(shù)快速檢測(cè)基因Ⅱ型諾如病毒[J].應(yīng)用預(yù)防醫(yī)學(xué),2007,13(3):129-132.

[2]夏體嬌,金敏,陳照立,等.熒光定量RT-PCR檢測(cè)諾如病毒基因Ⅱ型方法的建立和評(píng)估[J].解放軍預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志,2013,31(3):200-203.