謝 勇，王 洋，李佩萍，馮 斌，范玉喜，王長青，徐東明

(1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所，中草藥物質(zhì)基礎(chǔ)與資源利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193；2.晉中市林業(yè)局，山西 晉中 030600；3.晉中市榆次區(qū)林業(yè)局，山西 晉中 030600)

麗豆(Calophaca)為蝶形花科、麗豆屬灌木或小灌木植物，《中國植物志》記載我國境內(nèi)的麗豆有3種：麗豆(CalophacasinicaRehd)、華麗豆(CalophacachinensisBoriss)和新疆麗豆(CalophacasoongoricaKar. et Kir)。華麗豆和新疆麗豆分布于新疆西部，麗豆分布于山西省和內(nèi)蒙古自治區(qū)。麗豆具有深根性、耐旱、耐寒、耐瘠薄等優(yōu)點(diǎn)，有較強(qiáng)的水土保持功能，在生態(tài)環(huán)境改良方面有很好的應(yīng)用前景。

我國境內(nèi)天然分布的麗豆屬植物十分稀少，華麗豆和新疆麗豆已被列入珍稀瀕危植物保護(hù)名錄。山西省內(nèi)麗豆天然分布于太原市龍山、天龍山、古交，晉中市烏金山，呂梁市交城、離石等地海拔900 m～1 700 m的山谷陰處或山坡草地、灌叢中。麗豆天然分布區(qū)域狹小，加之部分地區(qū)為旅游風(fēng)景區(qū)，人為干擾因素多，造成種群數(shù)量稀少，也呈現(xiàn)極度瀕危之勢。

瀕危物種的保護(hù)和利用是保護(hù)生物多樣性和資源可持續(xù)開發(fā)最重要的任務(wù)之一。其中，至關(guān)重要的步驟就是正確鑒定和區(qū)分物種。DNA條形碼物種鑒定技術(shù)是近期發(fā)展起來的基于DNA分子序列的物種鑒定技術(shù)。植物物種的DNA條形碼物種鑒定體系是基于核糖體DNA第二內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS2)主體條形碼序列，以葉綠體psbA-trnH為輔助序列建立的，該技術(shù)可以避免傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定中主觀因素的干擾等。為了確保麗豆的引種基源，筆者對太原天龍山、晉中烏金山、甘肅慶城采集到麗豆進(jìn)行了基于DNA條形碼的物種鑒定研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料

麗豆干種子，采于甘肅慶城、晉中烏金山和太原天龍山。

1.1.2 儀器

伯樂產(chǎn)核酸電泳儀，湘儀產(chǎn)高速離心機(jī)，杭州奧盛儀器有限公司產(chǎn)恒溫恒濕培養(yǎng)箱，上海越平科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)電子天平(量程0.1 mg～100.0 mg)，美國產(chǎn)Abi prism 310型DNA測序儀，MG384型PCR擴(kuò)增儀。

1.1.3 試劑

Genstar公司產(chǎn)DNA提取試劑盒、DNA片段回收試劑盒，全式金生物技術(shù)公司產(chǎn)DNA擴(kuò)增試劑2×supermix，北京化工廠產(chǎn)分析純試劑三氯甲烷、無水乙醇、正丁醇和異戊醇，雙蒸水由本實(shí)驗(yàn)室制備。DNA擴(kuò)增引物，由北京擎科生物科技有限公司合成，序列如下：

IS2F：5′-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3′，

IS3R：5′-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3′，

psbAF：5′-GTTATGCATGAACGTAATGCTC-3′，

trnHR：5′-CGCGCATGGTGGATTCACAATCC-3′.

1.2 方法

1.2.1 麗豆DNA的提取

干種子內(nèi)無葉綠體存在，為了保證psbA-trnH條形碼DNA被順利擴(kuò)增，將每種產(chǎn)地的麗豆種子隨機(jī)抽取20粒，用水浸泡置于恒溫恒濕培養(yǎng)箱內(nèi)，設(shè)定溫度25 ℃，相對濕度70%，待胚根和胚葉萌出后改種土壤中。室溫下培育，待植株長成后取葉片提取總DNA.從每種產(chǎn)地麗豆的植株上隨機(jī)采取鮮嫩葉片約5 g，加入液氮充分磨碎，之后稱取100 mg麗豆葉片粉末于1.5 mL離心管中，待溫度回升至室溫后按照DNA提取試劑盒操作流程提取DNA.具體操作如下：加入600 μL DNA提取液于離心管中，輕微搖晃，使樣品散開。65 ℃恒溫30 min，使DNA盡可能游離，加入300 μL三氯甲烷∶異戊醇(24∶1)溶液，震蕩10 s，10 000 g離心10 min，取上清液。按體積比1∶1加入預(yù)冷的無水乙醇，-20 ℃恒溫20 mim.13 000 g離心10 min，棄上清液。加入500 μL 70%的乙醇，13 000 g離心5 min，棄上清液。在37 ℃恒溫箱內(nèi)使乙醇充分揮發(fā)，加入40 μL PB溶液，分裝于-20 ℃冰箱中保存。

1.2.2 PCR擴(kuò)增

以提取的DNA為PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)?zāi)０澹謩e擴(kuò)增ITS2和psbA-trnH條形碼DNA.擴(kuò)增反應(yīng)配方如下：DNA溶液1 μL，正反引物各1 μL，2×supermix 12.5 μL，用雙蒸水9.5 μL制備成25 μL的反應(yīng)體系。

ITS2的擴(kuò)增條件：① 94 ℃ 5 min；② 94 ℃ 30 s；③ 56 ℃ 30 s；④ 72 ℃ 45 s；⑤ 72 ℃ 10 min；④→② 步實(shí)施35個循環(huán)。

psbA-trnH擴(kuò)增條件：① 94 ℃ 5 min；② 94 ℃ 1 min；③ 55 ℃ 1 min；④ 72 ℃ 1 min；⑤ 72 ℃ 7 min；④→② 步實(shí)施40個循環(huán)。

1.2.3 DNA回收和堿基序列測試

PCR產(chǎn)物采用1%瓊脂糖凝膠電泳分析，擴(kuò)增片段分子量時加入DL5000 DNA Maker為對照，100 V恒定電壓下實(shí)施電泳40 min，凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照。在紫外燈下快速切膠，從膠塊回收DNA片段的操作按照DNA片段回收試劑盒所述規(guī)程進(jìn)行。獲得條形碼DNA后使用Abi prism 310型DNA測序儀，以PCR擴(kuò)增引物作為測序引物，依照Sanger測序法對獲得的每種來源的麗豆的ITS2和psbA-trnH進(jìn)行雙向測序。獲得的堿基序列信息拼裝后用BLAST軟件對比測定DNA序列。

2 結(jié)果分析

2.1 條形碼DNA的擴(kuò)增結(jié)果

送檢樣品中，甘肅慶城麗豆萌發(fā)率為35%，太原天龍山麗豆萌發(fā)率為16%，晉中烏金山麗豆萌發(fā)率為5%.總的來看，這些產(chǎn)地的麗豆自然萌發(fā)率均較低。以3種麗豆植株葉提取的DNA為模板，PCR擴(kuò)增ITS2和psbA-trnH的PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果如第23頁圖1所示。

圖1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖

由圖1可以看出，psbA-trnH和ITS2片段含有的堿基數(shù)約400 bp.從獲得的結(jié)果來看，每種樣品中的psbA-trnH和ITS2擴(kuò)增成功。

2.2 3種產(chǎn)地麗豆的ITS2和psbA-trnH堿基序列

將每種樣品的條形碼DNA切膠回收后，用擴(kuò)增引物實(shí)施雙向測序，獲得每種產(chǎn)地麗豆的ITS2和psbA-trnH的5’→3’序列和3’→5’序列。將每種條形碼DNA的5’→3’序列和3’→5’序列進(jìn)行拼裝，去除兩端的引物序列，得到3種不同產(chǎn)地麗豆的條形碼DNA序列。用BLAST軟件對比測定每種產(chǎn)地麗豆的ITS2序列和psbA-trnH序列，確定是否存在序列差異。Esprit軟件展示的序列對比結(jié)果如圖2，圖3所示。

圖2 Esprit軟件展示的ITS2堿基序列對比

圖3 Esprit軟件展示的psbA-trnH堿基序列對比

由圖2，圖3可以看出，甘肅慶城(Q)、太原天龍山(T)和晉中烏金山(W)麗豆的ITS2序列和psbA-trnH序列完全相同?？梢宰C明這3種產(chǎn)地的麗豆是同一物種。DNA序列測試數(shù)據(jù)也顯示無外源性DNA污染。3種麗豆的ITS2序列和psbA-trnH序列如表1所示，可以作為基于DNA條形碼技術(shù)的麗豆物種鑒定的參照系。

將表1中的ITS2序列與美國NCBI的DNA序列數(shù)據(jù)庫進(jìn)行對比，結(jié)果見第24頁圖4.將表1中psbA-trnH序列與美國NCBI的DNA序列數(shù)據(jù)庫進(jìn)行對比，結(jié)果見第24頁圖5.

由圖4，圖5可以看出，山西麗豆的ITS2序列和麗豆種Caragana_densa的ITS2序列(Sequence ID:KF530297.1)相似度最大，達(dá)99%.山西麗豆psbA-trnH序列與麗豆種Caragana_korshinskii(Sequence ID:KX289923.1)，麗豆種Caragana_microphylla來源的psbA-trnH序列(Sequence ID:KX289922.1)相似度大于98%.因此，表1中的ITS2序列和psbA-trnH

表1 3種產(chǎn)地麗豆ITS2序列和psbA-trnH序列

序列是已登錄麗豆種以外物種的DNA條形碼序列。根據(jù)《中國植物志》記載的山西麗豆植物分類學(xué)物種為CalophacasinicaRehd，本項(xiàng)研究測定的ITS2序列和psbA-trnH序列是CalophacasinicaRehd的DNA條形碼序列。

圖4 麗豆ITS2序列與美國NCBI DNA序列數(shù)據(jù)庫對比

圖5 麗豆psbA-trnH序列與美國NCBI DNA序列數(shù)據(jù)庫對比

3 討論

DNA條形碼是指生物體內(nèi)能夠代表該物種的，標(biāo)準(zhǔn)的、有足夠變異的、易擴(kuò)增且相對較短的DNA片段，測定既有物種的DNA條形碼序列可以建立數(shù)據(jù)庫和鑒定平臺，通過生物信息學(xué)分析方法比對DNA序列數(shù)據(jù)，從而實(shí)現(xiàn)物種的精準(zhǔn)鑒定。其前提是要有已經(jīng)被精準(zhǔn)鑒定的物種DNA條形碼作為對照，才能獲得準(zhǔn)確的鑒定結(jié)果。我國分布于新疆的麗豆來源ITS2序列和psbA-trnH序列已被測定，而山西省和內(nèi)蒙古自治區(qū)的麗豆沒有進(jìn)行ITS2序列和psbA-trnH序列測定建立鑒定平臺。山西野生麗豆的植物分類學(xué)物種為CalophacasinicaRehd，是傳統(tǒng)植物物種鑒定的結(jié)論，從植株、種子等外形來看，作為鑒定樣本的麗豆物種應(yīng)為CalophacasinicaRehd，可以認(rèn)為本項(xiàng)研究測定的ITS2序列和psbA-trnH序列可以作為基于DNA條形碼技術(shù)鑒定物種是否為CalophacasinicaRehd的對照序列，補(bǔ)充了中國天然分布麗豆的DNA條形碼物種鑒定的標(biāo)準(zhǔn)序列。