姚浩軻， 方亞坤， 周 配， 劉宇鵬， 張海燕

(河南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河南開封 475004)

通信作者：張海燕，博士，副教授，主要從事生物工程研究。E-mail：zhanghy150@sina.com。

隨著各方面技術(shù)的發(fā)展，生物柴油作為可替代的能源已經(jīng)開始應(yīng)用于生活的各個(gè)方面，然而在生物柴油生產(chǎn)的過(guò)程中會(huì)有10%左右的副產(chǎn)物甘油[1]。甘油是含有多個(gè)羥基的三碳化合物，是甘油三酯的骨架成分。甘油在很多方面具有重要的用途，例如化妝方面甘油可以作為保濕劑，在食品和藥品方面可以作為添加劑。同時(shí)，甘油在涂料、汽車、煙草和紡織方面也具有重要的作用[2]。然而由于生物柴油的大量生產(chǎn)致使甘油的價(jià)格出現(xiàn)很大的波動(dòng)，這也使得許多化學(xué)和生物方面的研究者須要付出更多的努力來(lái)探索將甘油轉(zhuǎn)化成具有更高價(jià)值的化學(xué)物質(zhì)[3-4]，其中氧化甘油生產(chǎn)甘油酸(2，3-二羥基丙酸)就是一條重要的途徑。甘油酸是一種三碳有機(jī)酸，作為一種化學(xué)成分存在于自然界的大部分植物體內(nèi)，同時(shí)在人體內(nèi)也存在甘油酸的衍生物。甘油酸在食品和醫(yī)藥行業(yè)具有重要的作用[5]，例如，作為添加劑添加在食品中可以改善食品的口感；由于甘油酸的生物可降解性優(yōu)于其他高聚物，因此可以用于藥物的運(yùn)輸載體；并且D-甘油酸能使人體內(nèi)胃部細(xì)胞在受到乙醇刺激后增強(qiáng)活力，從而促進(jìn)乙醇分解代謝，因此可以作為解酒藥的成分[6]。

據(jù)報(bào)道，甘油酸和甘油酸衍生物也具有重要的生物學(xué)活性[7]。例如在狗體內(nèi)的甘油酸具有增加膽固醇活性和使肝興奮的功能，甘油酸衍生出的酯類低聚物具有抗胰蛋白酶活性[8]。因此，采用微生物轉(zhuǎn)化甘油來(lái)生產(chǎn)甘油酸既可充分利用生物柴油生產(chǎn)過(guò)程中的廢棄物，同時(shí)又具有很大的市場(chǎng)潛力。本研究采用微生物轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化甘油生產(chǎn)甘油酸，該方法具有環(huán)境溫和、產(chǎn)量高、方法簡(jiǎn)便、產(chǎn)物具有立體選擇性等優(yōu)點(diǎn)。本研究對(duì)甘油酸發(fā)酵培養(yǎng)基成分進(jìn)行單因素試驗(yàn)，然后利用正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)來(lái)確定最佳的培養(yǎng)基成分。

1 材料與方法

1.1 菌株與培養(yǎng)基

1.1.1 菌株 葡萄糖酸桿菌(Gluconobacterjaponicus)CGMCC12425，由筆者所在實(shí)驗(yàn)室從腐爛的水果中分離獲得，現(xiàn)保存于中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心。

1.1.2 培養(yǎng)基 (1)種子培養(yǎng)基：葡萄糖0.5%、蛋白胨0.5%、酵母粉0.5%、MgSO4·7H2O 0.1%，pH值6.5～7.0。(2)初始發(fā)酵培養(yǎng)基：甘油15.00%、蛋白胨0.90%、酵母粉0.10%、K2HPO40.01%、KH2PO40.09%、MgSO4·7H2O 0.10%、CaCO32.00%，pH值6.5～7.0。(3)優(yōu)化后發(fā)酵培養(yǎng)基：甘油14.087 0%、蛋白胨 0.959 0%、硫酸錳0.051 2%、KH2PO40.090 0%、K2HPO40.010 0%、CaCO32.000%，pH值6.5～7.0。上述培養(yǎng)基中種子培養(yǎng)基是在115 ℃下滅菌 30 min，發(fā)酵培養(yǎng)基在121 ℃下滅菌30 min。每個(gè)試驗(yàn)作3個(gè)平行樣，取平均值并計(jì)算誤差。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)條件 種子培養(yǎng)條件：30 ℃、200 r/min，裝液量30 mL/250 mL，恒溫?fù)u床培養(yǎng)24 h。發(fā)酵培養(yǎng)條件：30 ℃、220 r/min，裝液量30 mL/250 mL，恒溫?fù)u床培養(yǎng)3 d，每個(gè)試驗(yàn)作3個(gè)平行樣，取平均值并計(jì)算誤差。

1.2.2 檢測(cè)方法 采用HPLC法測(cè)定發(fā)酵液中甘油酸、二羥基丙酮、甘油的含量[9-10]。檢測(cè)條件：1515泵、2489紫外檢測(cè)器(檢測(cè)波長(zhǎng) 210 nm)、2414示差檢測(cè)器、1500柱溫箱、2707自動(dòng)進(jìn)樣器。色譜柱型號(hào)Aminex HPX-87H色譜柱(300 mm×7.8 mm，9 μm)；柱溫60 ℃；流動(dòng)相5 mmol/L H2SO4和20%乙腈；流速0.3 mL/min；進(jìn)樣量20 μL。

1.2.3 響應(yīng)面分析 使用SAS 8.0軟件進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同pH值對(duì)發(fā)酵結(jié)果的影響

甘油酸是一種三碳有機(jī)酸，在發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生甘油酸會(huì)導(dǎo)致發(fā)酵液的pH值偏低，從而影響菌體的生長(zhǎng)及酶活性，進(jìn)而影響甘油酸的產(chǎn)生。本試驗(yàn)采用在發(fā)酵液中添加碳酸鈣和堿式碳酸鎂來(lái)調(diào)節(jié)發(fā)酵液中的pH值，使pH值的范圍控制在5.0左右，對(duì)照組不作任何處理。碳酸鈣和堿式碳酸鎂的添加量為20 g/L，按照“1.2.1”節(jié)的培養(yǎng)方式進(jìn)行培養(yǎng)，按照“1.2.2”節(jié)對(duì)發(fā)酵結(jié)果進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖1所示。

從圖1可以看出，與對(duì)照組相比當(dāng)發(fā)酵液中添加堿式碳酸鎂時(shí)甘油酸和二羥基丙酮(DHA)幾乎不產(chǎn)生，然而當(dāng)添加碳酸鈣來(lái)調(diào)節(jié)發(fā)酵液的pH值時(shí)，發(fā)現(xiàn)甘油酸產(chǎn)量增加，此時(shí)甘油酸的產(chǎn)量可達(dá)37.62 g/L，說(shuō)明在試驗(yàn)過(guò)程中添加碳酸鈣可以促進(jìn)產(chǎn)物的產(chǎn)生。因此，在以下試驗(yàn)中選擇碳酸鈣調(diào)節(jié)發(fā)酵液的pH值。

2.2 不同超始甘油濃度對(duì)發(fā)酵結(jié)果的影響

高的甘油濃度會(huì)抑制菌體的生長(zhǎng)，但同時(shí)也可以抑制副產(chǎn)物DHA的產(chǎn)生。本試驗(yàn)探索不同起始甘油濃度對(duì)發(fā)酵結(jié)果的影響，選出最佳的甘油濃度。試驗(yàn)過(guò)程中選取的起始甘油濃度梯度為50、100、150、200、250 g/L，發(fā)酵培養(yǎng)基的其他成分保持不變，按照“1.2.1”節(jié)的培養(yǎng)方式進(jìn)行培養(yǎng)，按照“1.2.2”節(jié)對(duì)發(fā)酵結(jié)果進(jìn)行檢測(cè)，試驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。

從圖2可以看出，隨著起始甘油濃度的增加，甘油酸產(chǎn)量先增加后減少，在起始甘油濃度為150 g/L時(shí)甘油酸的產(chǎn)量達(dá)到最大，此時(shí)甘油酸的產(chǎn)量為42.33 g/L。并且此時(shí)副產(chǎn)物DHA的產(chǎn)量也相對(duì)較小，當(dāng)甘油濃度超過(guò)150 g/L后甘油酸的產(chǎn)量開始下降，達(dá)到250 g/L時(shí)甘油酸幾乎不再產(chǎn)生，可能是由于較高的甘油濃度在抑制副產(chǎn)物產(chǎn)生時(shí)更抑制了菌體的生長(zhǎng)。因此，選擇150 g/L起始甘油濃度為最佳的濃度。

2.3 不同氮源種類對(duì)發(fā)酵結(jié)果的影響

本研究分別選取牛肉膏、蛋白胨、酵母粉、玉米漿、酵母膏、硫酸銨、硝酸鈉和尿素為氮源，以酵母粉和蛋白胨混合氮源為對(duì)照組，保持發(fā)酵培養(yǎng)基中含氮量一致，其他成分不變，按照“1.2.1”節(jié)的培養(yǎng)方式進(jìn)行培養(yǎng)，按照“1.2.2”節(jié)對(duì)發(fā)酵結(jié)果進(jìn)行檢測(cè)，試驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。

從圖3可以看出，與有機(jī)氮源相比添加無(wú)機(jī)氮源會(huì)更有利于產(chǎn)物的產(chǎn)生，主要因?yàn)榫w對(duì)無(wú)機(jī)氮源的利用較差，在僅含有無(wú)機(jī)氮源的培養(yǎng)基中菌體幾乎不生長(zhǎng)(數(shù)據(jù)未列出)。然而與對(duì)照組相比在保證氮含量一致的情況下添加蛋白胨更利于產(chǎn)物甘油酸的產(chǎn)生，同時(shí)與對(duì)照相比副產(chǎn)物的產(chǎn)量也有所下降，此時(shí)甘油酸的產(chǎn)量最高，可以達(dá)到43.53 g/L。說(shuō)明蛋白胨更易于被菌體利用，更易于產(chǎn)物的產(chǎn)生。

2.4 不同金屬離子對(duì)發(fā)酵結(jié)果的影響

金屬離子可以影響不同酶的活性，從而影響產(chǎn)物的產(chǎn)生，本試驗(yàn)分別選取硫酸鋅、硫酸鐵、硫酸亞鐵、硫酸錳、硫酸銅、硫酸鎂為金屬離子，以不添加金屬離子的空白發(fā)酵液為對(duì)照組，金屬離子的添加量為1 g/L，其他成分保持不變，按照 “1.2.1” 節(jié)的培養(yǎng)方式進(jìn)行培養(yǎng)，按照“1.2.2”節(jié)對(duì)發(fā)酵結(jié)果進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖4所示。

從圖4可以看出，當(dāng)添加金屬離子時(shí)某些金屬離子會(huì)促進(jìn)產(chǎn)物的產(chǎn)生，其中Mn2+可以促進(jìn)產(chǎn)物甘油酸的產(chǎn)生。可能是由于Mn2+更易于提高醇脫氫酶和醛脫氫酶的活性。此時(shí)甘油酸的產(chǎn)量最高，可以達(dá)到45.25 g/L。

2.5 響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基

通過(guò)單因素及正交試驗(yàn)(數(shù)據(jù)未列出)發(fā)現(xiàn)，甘油、蛋白胨、硫酸錳濃度對(duì)甘油酸的產(chǎn)量有明顯影響，為研究這些因素之間的相互作用，設(shè)計(jì)響應(yīng)面分析試驗(yàn)，考察甘油、蛋白胨漿、硫酸錳濃度對(duì)甘油酸發(fā)酵的影響，優(yōu)選3個(gè)主要因素的適宜濃度范圍。以甘油、蛋白胨、硫酸錳濃度3個(gè)因素為自變量，以甘油酸濃度為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)3個(gè)因素3個(gè)水平試驗(yàn)，培養(yǎng)基其他因素不變，培養(yǎng)基濃度及編碼設(shè)置見表1。

表1 響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基試驗(yàn)因素和水平

采用Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)，分別進(jìn)行15組試驗(yàn)，結(jié)果見表2。用Design-Expert 8.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行多元回歸分析，主要分析結(jié)果見表3。由表3可看出，X1、X12、X22、X2X3、X32影響顯著(P<0.05)，其他二次項(xiàng)及交互項(xiàng)的影響并不顯著(P>0.05)。經(jīng)過(guò)回歸擬合后，各因子對(duì)響應(yīng)值的影響可以用回歸方程表示為Y=50.780 0-4.330 0X1-0.787 5X2+0.675 0X3-11.533 8X12-1.027 5X1X2+0.907 5X1X3-3.143 8X22+2.257 5X2X3-4.118 8X32。式中：Y表示甘油酸含量(g/L)。

表2 響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基試驗(yàn)方案與結(jié)果

表3 回歸方程的方差分析

該擬合方程的回歸系數(shù)高達(dá)0.992 9，說(shuō)明該模型適用于甘油酸產(chǎn)量高低的理論預(yù)測(cè)。根據(jù)上述回歸方程描繪出響應(yīng)面分析圖及等高線圖(圖5)以確認(rèn)甘油、蛋白胨、硫酸錳濃度對(duì)甘油酸含量的影響。隨著甘油、蛋白胨、硫酸錳濃度的增加，甘油酸的產(chǎn)量也增加，達(dá)到一定值后甘油酸的產(chǎn)量不再增加，因此可以找出3種濃度的最佳組合。3種因素對(duì)甘油酸產(chǎn)量影響的順序分別為甘油濃度>蛋白胨濃度>硫酸錳濃度。

利用SAS軟件進(jìn)行脊嶺分析，進(jìn)一步研究3個(gè)因素的最佳濃度。通過(guò)分析可得出，回歸模型存在最大值點(diǎn)，此時(shí)甘油酸的產(chǎn)量最高，可達(dá)51.22 g/L。3個(gè)因素的取值分別為甘油濃度：140.870 g/L；蛋白胨濃度：9.590 g/L；硫酸錳濃度：0.512 g/L。

按照響應(yīng)面優(yōu)化后的培養(yǎng)基組合進(jìn)行重復(fù)驗(yàn)證試驗(yàn)，試驗(yàn)進(jìn)行5個(gè)平行樣，最后得到的甘油酸的平均產(chǎn)量為 51.360 g/L，比優(yōu)化前(37.620 g/L)提高36.52%，與響應(yīng)面預(yù)測(cè)的極值基本符合。

3 結(jié)論

目前，國(guó)外甘油酸微生物法生產(chǎn)的報(bào)道較多的菌株普遍是葡糖桿菌屬的菌株，例如弗拉多葡萄糖酸桿菌(G.frateurii)、弱氧化葡萄糖酸桿菌(G.suboxydans)、氧化葡萄糖酸桿菌 (G.oxydans)等， 然而國(guó)內(nèi)尚未有微生物法生產(chǎn)甘油

酸的報(bào)道，本試驗(yàn)利用篩選出的新菌株日本葡萄糖酸桿菌CGMCC12425氧化甘油生產(chǎn)甘油酸。通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)確定對(duì)發(fā)酵影響相對(duì)較大的因素，然后利用響應(yīng)面分析法確定發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳配方為：甘油140.870 g/L、蛋白胨9.590 g/L、硫酸錳 0.512 g/L、KH2PO40.900 g/L、K2HPO40.100 g/L、CaCO320.000 g/L、pH值6.5～7.0，優(yōu)化后比優(yōu)化前甘油酸的產(chǎn)量增加36.52%。

參考文獻(xiàn)：

[1]Habe H，F(xiàn)ukuoka T，KitamotoD，et al. Biotransformation of glycerol toD-glyceric acid byAcetobactertropicalis[J]. Applied Microbiology and Biotechnology，2009，81(6)：1033-1039.

[2]Habe H，F(xiàn)ukuoka T，Kitamoto D，et al. Biotechnological production ofD-glyceric acid and its application[J]. Applied Microbiology and Biotechnology，2009，84(3)：445-452.

[3]Habe H，Shimada Y，Yakushi T，et al. Microbial production of glyceric acid，an organic acid that can be mass produced from glycerol[J]. Applied and Environmental Microbiology，2009，75(24)：7760-7766.

[4]Sato S，Morita T，Kitamoto D，et al. Change in product selectivity during the production of glyceric acid from glycerol byGluconobacterstrains in the presence of methanol[J]. AMB Express，2013，3(1)：20-26.

[5]Habe H，Shimada Y，F(xiàn)ukuoka T，et al. Production of glyceric acid byGluconobactersp. NBRC3259 using raw glycerol[J]. Bioscience，Biotechnology，and Biochemistry，2009，73(8)：1799-1805.

[6]Habe H，Sato S，F(xiàn)ukuoka T，et al. Effect of glyceric acid calcium salt on the viability of ethanol-dosed gastric cells[J]. Journal of Oleo Science，2011，60(11)：585-590.

[7]Sato S，Morita T，F(xiàn)ukuoka T，et al. Microbial resolution ofDL-glyceric acid forL-glyceric acid production with newly isolated bacterial strains[J]. Journal of Bioscience and Bioengineering，2015，119(5)：554-557.

[8]Habe H，F(xiàn)ukuoka T，Sato S，et al. Synthesis and evaluation of dioleoyl glyceric acids showing antitrypsin activity[J]. Journal of Oleo Science，2011，60(6)：327-331.

[9]劉宇鵬，鄭 璞，孫志浩，等. 采用離子排斥色譜法分析發(fā)酵液中的琥珀酸等代謝產(chǎn)物[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè)，2006，32(12)：119-123.

[10]方亞坤，靳魁奇，劉宇鵬，等. 離子排斥色譜法分析發(fā)酵液中甘油酸等代謝產(chǎn)物[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè)，2015，41(7)：171-174.