劉樹文，時功平

(貴州師范學院化學與生命科學學院，貴州貴陽 550018)

葛仙米(NostocsphaeroidesKützing)生長于水稻田中，生長期為11月至次年5月，在世界范圍內(nèi)其分布稀少，產(chǎn)量甚微(7.5 kg/hm2左右)，除湖北省鶴峰縣走馬鎮(zhèn)有約667 hm2分布外，在非洲僅有約0.73 hm2的葛仙米分布量[1]。葛仙米是我國傳統(tǒng)出口的一種珍貴野生的食藥兩用固氮藍藻，其營養(yǎng)價值豐富，食用歷史悠久[1]。另外，其蛋白含量較高，含有豐富的人體必需的各種氨基酸、脂肪酸、維生素及礦質(zhì)元素，并且含有具有各種藥用價值的多糖、色素等，此外，葛仙米還含有超氧化物歧化酶等生理活性物質(zhì)[2-3]。因此，葛仙米在保健食品、食品添加劑、動物飼料、醫(yī)藥、美容以及精細化加工品等領域具有廣闊的開發(fā)應用前景[1，4]。

陸生植物主要通過氣孔吸收利用空氣中的CO2進行光合作用。CO2、HCO3-和CO32-在水體中能夠通過如下反應進行相互轉(zhuǎn)化：CO2+OH-HCO3-，HCO3-+OH-CO32-+H2O[5]。水體中溶解的CO2濃度遠不能滿足藻類的需求，水生藍藻除了能夠直接吸收利用溶解在水體中的CO2以外，還可以通過二氧化碳濃縮機制(CO2concentrating mechanism，簡稱CCM)吸收利用水體中的HCO3-[6]。藍藻可通過細胞膜上的多種HCO3-轉(zhuǎn)運蛋白將溶解在水體中的HCO3-轉(zhuǎn)運至胞內(nèi)，胞內(nèi)的碳酸酐酶(carbonic anhydrase，簡稱CA)可催化HCO3-形成CO2，并且在核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶(ribulose bisphosphate carboxylase oxygenase，簡稱RubisCO)的作用下將CO2固定生成3-磷酸甘油酸后參與細胞的各種代謝途徑[6]。

王思瑩的研究表明，銅綠微囊藻可以直接或間接利用水體中的碳酸氫鹽作為無機碳進行光合作用，無機碳濃度能影響銅綠微囊藻的生長以及對氮磷的利用[7]。繆曉玲等對海洋浮游藻無機碳利用機制的研究表明，在其指數(shù)期和靜止期海洋浮游藻對無機碳的利用途徑不同，指數(shù)期通過HCO3-直接吸收途徑，靜止期則是通過CO2吸收途徑[8]。張君枝等研究了水體無機碳濃度升高對藍綠藻生長、種群競爭的影響，結(jié)果表明，高濃度CO2促進藻細胞結(jié)構中蛋白核的增大和藻細胞個體的增殖，細胞體積較小的藻類對CO2濃度的響應更明顯[9]。劉繼勇研究表明，食用藍藻葛仙米能夠直接利用HCO3-進行光合作用，通氣培養(yǎng)的葛仙米具有多種CO2、HCO3-轉(zhuǎn)運子，Na+依賴型HCO3-轉(zhuǎn)運是葛仙米最主要的獲取無機碳的方式[10]。劉然等研究了不同濃度的NaHCO3、CO2對海洋單細胞微藻粉核油球藻(PinguiococcuspyrenoidosusCCMP 2078)生長的影響，結(jié)果表明，適當提高NaHCO3、CO2濃度均能顯著促進粉核油球藻的生長[11]。鄭洪立等研究表明，海洋小球藻(ChlorellavulgarisLICME001)能利用Na2CO3、NaHCO3和CO2產(chǎn)油，產(chǎn)油量隨著3種形式無機碳濃度的增加先升高后降低，且Na2CO3、NaHCO3較CO2更有利于小球藻積累不飽和脂肪酸[12]。

目前，葛仙米的人工養(yǎng)殖已經(jīng)取得較大進展，但國內(nèi)外對葛仙米的研究相對較少，對其開發(fā)利用也沒有像小球藻(Chlorella)、螺旋藻(Spirulina)和鹽藻(Dunaliella)那樣已經(jīng)實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化[13]。葛仙米以其資源稀少、營養(yǎng)價值豐富、獨特的生物活性和藥理作用引起人們廣泛的關注。葛仙米的人工養(yǎng)殖技術于2003年通過湖北省科技廳組織的科技成果鑒定，為早日實現(xiàn)葛仙米商業(yè)化培養(yǎng)奠定了堅實的基礎[14]。但是目前因為葛仙米的人工培養(yǎng)技術還存在產(chǎn)量較低等問題，還沒有實現(xiàn)大規(guī)模的工廠化養(yǎng)殖[13]。Chen等研究了磷對葛仙米生長和光合作用的影響[15]，文靖研究了鈣對葛仙米生理生化特性的影響[16]。本試驗比較研究了人工養(yǎng)殖的葛仙米在以CO2、Na2CO3單獨提供碳源以及兩者同時提供碳源(CO2+Na2CO3)的培養(yǎng)條件下葛仙米的生理響應差異，以期尋找最適合葛仙米生長的無機碳形式，為葛仙米的人工養(yǎng)殖提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2015年4月，從貴州省岑鞏縣凱本鄉(xiāng)沈家灣村水稻田中采集得到新鮮野生葛仙米球形群體。在實驗室內(nèi)將葛仙米球形體用無菌蒸餾水沖洗干凈，再用75%乙醇溶液浸泡30 s，去除雜藻，然后用無菌BG110(無氮的BG11培養(yǎng)基)培養(yǎng)液清洗3次，再放入與葛仙米群體質(zhì)量相同的培養(yǎng)液，用玻璃勻漿器勻漿成絲狀藻漿。將絲狀藻漿用BG110培養(yǎng)液稀釋，在溫度約為23 ℃、光照度約為1 000 lx的條件下通入空氣進行培養(yǎng)。經(jīng)過15 d培養(yǎng)后得到無雜菌、雜藻的貴州野生葛仙米藻種。

1.2 培養(yǎng)條件

配制BG110培養(yǎng)基(含0.02 g/L Na2CO3，不含NaNO3)以及不含Na2CO3的BG110培養(yǎng)基(不含NaNO3)，BG110培養(yǎng)基和不含Na2CO3的BG110培養(yǎng)基用0.5 molL NaOH、HCl將pH值調(diào)至7.0。將配制好的培養(yǎng)基在121 ℃、1.05 kg/cm2下滅菌30 min。藻種經(jīng)過勻漿后分別接種到9個經(jīng)過高壓滅菌的500 mL錐形瓶中，其中6瓶加入BG110培養(yǎng)基，另外3瓶加入不含Na2CO3的BG110培養(yǎng)基，每瓶藻液的總體積為400 mL。將試驗分為3個組進行培養(yǎng)，用空氣泵通入經(jīng) 0.22 μm 濾膜過濾的無菌空氣，通氣量為300 mL/min。第1組由空氣中的CO2和培養(yǎng)液中的Na2CO3同時提供碳源，第2組由空氣中的CO2單獨提供碳源(BG110不含Na2CO3)，第3組由Na2CO3單獨提供碳源(采用高濃度的NaOH溶液及飽和的澄清石灰水組成的CO2過濾裝置將空氣中的CO2去除)。每組設置3個重復，培養(yǎng)溫度為26 ℃，用30 W日光燈進行光照，光照度通過照度計測定，培養(yǎng)光照度為1 500 lx，每組設3個重復，經(jīng)過8 d光照培養(yǎng)后取3個組的藻樣測定各項生理指標。

1.3 比生長速率的測定

從9個錐形瓶中各取藻液20 mL，離心30 min，倒掉上清液，加入3 mL 95%乙醇，振蕩，放入4 ℃冰箱中24 h。4 000 r/min 離心30 min后取上清液，用分光光度計測定D665 nm和D649 nm。葉綠素a(chlorophyll a，簡稱Chla)含量依據(jù)下列公式計算[17]：CChl a=13.95D665 nm-6.88D649 nm。比生長速率(μ)依據(jù)下列公式計算：μ=(lnX1-lnX2)/(T2-T1)。式中：X1、X2分別是T1(初始)、T2(第8天)時的葉綠素a含量。

1.4 各種光合色素含量的測定

從各組葛仙米培養(yǎng)瓶中各取20 mL藻液，4 000 r/min離心30 min，倒掉上清液，加入4 mL 95%乙醇，于4 ℃冰箱中放置24 h，于4 000 r/min離心30 min，取上清液，用分光光度計分別在波長665、649、470 nm下測定其吸光度。葉綠素a和類胡蘿卜素(carotenoids，簡稱Car)含量(葛仙米是藍藻，因此不含葉綠素b)依據(jù)下列公式計算[17]：CChla=13.95D665 nm-6.88D649 nm；CCar=1 000D470 nm-2.05CChla-114.8CChlb。

從各組葛仙米培養(yǎng)瓶中各取20 mL藻液，4 000 r/min離心30 min，去上清，各加入4 mL 0.1 mol/L pH值7.0的磷酸緩沖液，冰浴勻漿90次，于4 000 r/min離心30 min。取上清，用分光光度計分別測定上清液在562、615、652 nm波長下的吸光度D562nm、D615 nm、D652 nm。藻藍蛋白(phycocyanin，簡稱PC)、別藻藍蛋白(allophyxoxyanin，簡稱APC)和藻紅蛋白(phycoerythrin，簡稱PE)的含量根據(jù)Siegelman等的方法計算[18]：CPC(mg/mL)=(D615 nm-0.474D652 nm)/5.34；CAPC(mg/mL)=(D652 nm-0.208D615 nm)/5.09；CPE(mg/mL)=(D562 nm-2.41CPC-0.849CAPC)/9.62。

1.5 蛋白質(zhì)含量的測定

從各組葛仙米培養(yǎng)瓶中各取20 mL藻液，于4 000 r/min離心30 min，去上清，各加入4 mL 0.1 mol/L pH值7.0的磷酸緩沖液，冰浴勻漿90次，于4 000 r/min離心30 min。上清液中蛋白質(zhì)含量依據(jù)考馬斯量藍法測定[17]。

1.6 可溶性糖含量的測定

從各組葛仙米培養(yǎng)瓶中各取20 mL藻液，于4 000 r/min離心30 min，去上清，各加入4 mL蒸餾水，冰浴勻漿90次，4 000 r/min 離心30 min。上清液中可溶性糖含量依據(jù)蒽酮試劑法測定[17]。

1.7 統(tǒng)計分析

本研究主要用軟件Origin 8.0作圖，用STATISTICA?7.0進行統(tǒng)計分析處理。用單因素方差分析(ANOVA)和Tukey顯著性檢驗(HSD)來分析不同處理間的顯著性水平。正態(tài)分布和方差同質(zhì)性分析分別采用Lilliefors檢驗和Levene檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同形式無機碳培養(yǎng)條件下葛仙米的生長情況

圖1表明，葛仙米分別在含有CO2+Na2CO3、CO2、Na2CO3不同形式的無機碳培養(yǎng)基中培養(yǎng)8 d后，以葉綠素濃度表示的生物量分別增加到初始值的7.4、6.4、3.6倍。表1表明，分別用CO2、Na2CO3提供碳源時，葛仙米的比生長速率分別降低到CO2、Na2CO3同時提供碳源時的93.2%、57.4%。以CO2和Na2CO3同時作為碳源時，葛仙米培養(yǎng)2～8 d的生物量(以葉綠素a含量表示)分別高于以Na2CO3或CO2單獨作為碳源時葛仙米的生物量(圖1)，其比生長速率也顯著高于以Na2CO3或CO2單獨作為碳源時葛仙米的比生長速率(Tukey’s HSD，P<0.05)(表1)。以CO2單獨作為碳源時，葛仙米培養(yǎng)2～8 d的生物量分別高于以Na2CO3單獨作為碳源時葛仙米的生物量(圖1)，其比生長速率也顯著高于Na2CO3單獨作為碳源時葛仙米的比生長速率(Tukey’s HSD，P<0.05)(表1)。

表1 不同形式無機碳培養(yǎng)條件下葛仙米的比生長速率

注：同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下表同。

2.2 不同形式無機碳培養(yǎng)條件下葛仙米各種光合色素含量的變化

在不同形式的無機碳培養(yǎng)條件下，葛仙米的PC、APC、PE含量以及Chla、Car含量分別見表2和表3?？梢钥闯?，以CO2單獨提供碳源時，葛仙米的PC、APC、PE、Chla、Car含量分別降低到CO2、Na2CO3同時提供碳源時的63.01%、38.66%、78.99%、79.89%、90.98%。以Na2CO3單獨提供碳源時，葛仙米的PC、APC、PE、Chla、Car含量分別降低到CO2、Na2CO3同時提供碳源時的50.87%、26.80%、41.89%、50.68%、53.45%。以CO2單獨作為碳源時，葛仙米的各種光合色素含量顯著高于以Na2CO3單獨作為碳源時葛仙米的各種光合色素含量(Tukey’s HSD，P<0.05)。可以看出，不同形式無機碳對葛仙米的藻紅蛋白影響最大，對葛仙米的葉綠素、類胡蘿卜素影響較小。

表2 不同形式無機碳源培養(yǎng)條件下葛仙米的PC、APC、PE含量

表3 不同形式無機碳源培養(yǎng)條件下葛仙米的Chla和Car含量

2.3 不同形式無機碳培養(yǎng)條件下葛仙米可溶性蛋白含量的變化

圖2為蛋白質(zhì)含量標準曲線，其直線方程為y=0.006x+0.043(r2=0.979)。根據(jù)直線方程計算得到不同形式無機碳源培養(yǎng)下葛仙米可溶性蛋白含量，由圖3可以看出，當CO2、Na2CO3同時作為碳源時，葛仙米的可溶性蛋白含量最高(Tukey’sHSD，P<0.05)。當葛仙米的培養(yǎng)分別以CO2、

Na2CO3單獨提供碳源時，葛仙米的可溶性蛋白含量分別降低到兩者同時提供碳源時的62.5%、55.6%(Tukey’s HSD，P<0.05)。以CO2單獨作為碳源培養(yǎng)時，葛仙米的可溶性蛋白含量顯著高于以Na2CO3單獨作為碳源時葛仙米的可溶性蛋白含量(Tukey’s HSD，P<0.05)。

2.4 不同形式無機碳培養(yǎng)條件下葛仙米可溶性糖含量的變化

圖4為可溶性糖標準曲線，其直線方程為y=0.005x-0.018(r2=0.989)。根據(jù)直線方程計算得到不同形式的無機碳源培養(yǎng)下葛仙米可溶性糖含量如圖5所示。當以CO2和Na2CO3同時作為碳源時，葛仙米的可溶性糖含量最高(Tukey’s HSD，P<0.05)。當葛仙米的培養(yǎng)分別以CO2、Na2CO3單獨提供碳源時，葛仙米的可溶性糖含量均分別降低到兩者同時提供碳源時的71.4%、47.6%(Tukey’s HSD，P<0.05)。以CO2單獨作為碳源時，葛仙米的可溶性糖含量顯著高于以Na2CO3單獨作為碳源時葛仙米的可溶性糖含量(Tukey’s HSD，P<0.05)。

3 討論與結(jié)論

以CO2單獨作為碳源時，葛仙米的以葉綠素含量表示的生物量、比生長速率以及葉綠素、類胡蘿卜素、藻紅蛋白、藻藍蛋白、別藻藍蛋白、可溶性糖及可溶性蛋白含量大都顯著高于以Na2CO3單獨作為碳源時葛仙米的上述各項生理指標(Tukey’s HSD，P<0.05)。因此可見，CO2是葛仙米優(yōu)先利用的無機碳形式。CO32-在培養(yǎng)液中需要通過水解作用轉(zhuǎn)化為HCO3-而被葛仙米作為碳源吸收利用，而培養(yǎng)液中溶解的CO2可以被藻細胞直接吸收利用[6]。根據(jù)藻類的CO2濃縮機制，由于CO2的轉(zhuǎn)運不消耗能力，因此在多種碳源中藻類更傾向于吸收水中的溶解 CO2[19]。水體中溶解的CO2升高，減少了藻細胞對HCO3-的轉(zhuǎn)運，節(jié)省了更多的能量，更有利于藻細胞的生長[9]。郭琪等研究表明，提高CO2濃度較大程度地提高了柵藻的碳固定速率和油脂積累[20]。今后我們將進一步探討不同濃度的CO2對葛仙米的生理影響，探討增加葛仙米產(chǎn)量的更加優(yōu)化的培養(yǎng)條件。

雖然以Na2CO3單獨作為碳源時，對葛仙米的生長促進作用較小，但在含有Na2CO3的BG110培養(yǎng)液中通入含有CO2的空氣，能最大程度地促進葛仙米的生長。CO32-在培養(yǎng)液中不僅能通過水解轉(zhuǎn)化為HCO3-而被葛仙米作為碳源吸收利用，而且具有調(diào)節(jié)培養(yǎng)液pH值的作用。在一定范圍內(nèi)，培養(yǎng)液的pH值越高，CO2的利用率也越高[14]。不同藻類有不同的最適pH值[21]，藻類在吸收利用水體中溶解的無機碳時，會造成水體中pH值升高，過高的pH值會影響葛仙米藻細胞對鐵等微量元素的吸收利用，繼而影響藻細胞的生長[22]。向含有Na2CO3的培養(yǎng)液中通入含有CO2的空氣，能使培養(yǎng)液過高的pH值適當降低[14]。由于不同的無機碳形式對培養(yǎng)液pH值的影響不同，pH值也會影響葛仙米藻細胞對無機碳的利用。因此本研究在配制培養(yǎng)液時用0.5 mol/L NaOH和HCl將各種培養(yǎng)液的初始pH值調(diào)至7.0[12]。但葛仙米藻細胞在生長過程中pH值會不斷變化，今后應該進一步研究固定pH值下各種形式無機碳對葛仙米生長的影響。

與CO2和Na2CO3同時提供碳源時相比，CO2或Na2CO3單獨提供碳源時，葛仙米的以葉綠素含量表示的生物量、比生長速率以及葉綠素、類胡蘿卜素、藻紅蛋白、藻藍蛋白、別藻藍蛋白、可溶性糖、可溶性蛋白含量均有不同程度的降低(Tukey’s HSD，P<0.05)。因此在葛仙米的人工養(yǎng)殖過程中，除了應該在培養(yǎng)液中加入Na2CO3作為葛仙米的碳源，同時應該通入含有CO2的空氣，才能使葛仙米保持最佳生長狀態(tài)，提高葛仙米的產(chǎn)量和品質(zhì)。

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