畢志香， 朱亞露， 趙 陽， 張?jiān)i， 于曉明， 揭鴻英， 何家惠， 于 漾

(江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院國(guó)家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心，江蘇南京 210014)

通信作者：于 漾，碩士，助理研究員，主要從事禽用疫苗研究。E-mail：yangyu1719223@163.com。

2015年3月中旬，山東省某地區(qū)連片家禽專業(yè)養(yǎng)殖戶飼養(yǎng)的817肉雞及青腳麻雞先后發(fā)病并陸續(xù)死亡，主要表現(xiàn)呼吸道癥狀，有的拉黃、綠稀糞，減食，精神萎頓，發(fā)病率達(dá)60%～70%，病死率達(dá)15%～30%，使用多種抗生素治療效果不明顯。5家專業(yè)戶送檢病死雞共60余只。對(duì)所有發(fā)病雞均解剖，觀察病理變化，并采集病變臟器，肝、肺、腎、法氏囊及氣管等，通過流行病學(xué)調(diào)查及實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)等方法進(jìn)行診斷，現(xiàn)將確診為H9亞型禽流感與大腸桿菌混合感染診斷結(jié)果報(bào)告如下。

1 發(fā)病情況

本次發(fā)病雞為山東省某鄉(xiāng)鎮(zhèn)多個(gè)個(gè)體養(yǎng)殖戶飼養(yǎng)的817肉雞和青腳麻雞，5個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)飼養(yǎng)規(guī)模均為8 500只左右，24～38日齡雞發(fā)病嚴(yán)重。臨床表現(xiàn)為精神沉郁、打堆、羽毛蓬松、縮頸垂翅、打盹、食量減少、咳嗽、張口呼吸、排糞異常，發(fā)病率60%～70%，病死率達(dá)15%～30%。經(jīng)常規(guī)抗生素和抗病毒藥治療均無明顯效果。

2 免疫程序

本鄉(xiāng)鎮(zhèn)的養(yǎng)雞合作社使用統(tǒng)一的免疫程序?yàn)?日齡：ND-IB 點(diǎn)眼滴鼻；14日齡：IBDV活苗免疫；21日齡：ND弱毒疫苗點(diǎn)眼滴鼻。

3 解剖病理變化

共解剖病死雞60只，剖檢病變?yōu)槔w維素性心包炎、肝周炎(38/60)；氣囊渾濁、增厚(12/60)；氣管內(nèi)有較多黏液(40/60)，氣管和支氣管交匯處有白色干酪樣栓塞物(40/60)；肌胃和腺胃交界處有出血(20/60)，腺胃粘膜潰瘍、脫落(20/60)；脾臟壞死(10/60)；法氏囊萎縮(45/60)；腎臟腫大(40/60)。

4 實(shí)驗(yàn)室診斷

4.1 細(xì)菌分離和藥敏試驗(yàn)

4.1.1 細(xì)菌分離和培養(yǎng)特性觀察 無菌采取病死雞的肝臟組織，劃線接種到普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂和麥康凱瓊脂上，37 ℃培養(yǎng)24 h，可見在普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)成突起、濕潤(rùn)、乳白色圓形菌落，麥康凱瓊脂上形成光滑、濕潤(rùn)、圓形、紅色菌落；挑取紅色菌落經(jīng)革蘭氏染色鏡檢，可見兩端鈍圓的紅色短小桿菌。對(duì)菌落進(jìn)行純化培養(yǎng)后進(jìn)一步做生化試驗(yàn)，結(jié)果顯示分離菌能迅速發(fā)酵乳糖、葡萄糖、甘露醇，產(chǎn)酸產(chǎn)氣，產(chǎn)生靛基質(zhì)等，符合大腸桿菌的生化特征。

4.1.2 藥敏試驗(yàn) 選取麥康凱瓊脂上長(zhǎng)出的紅色菌落，均勻劃線于麥康凱平板，再放置相應(yīng)的藥敏試紙，37 ℃培養(yǎng)，24 h后觀察測(cè)量抑菌圈的大小并記錄結(jié)果。判定標(biāo)準(zhǔn)采用美國(guó)臨床檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)(NCCLS)標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果對(duì)頭孢喹肟鈉高度敏感；對(duì)頭孢噻吩鈉、丁胺卡那霉素輕度敏感；對(duì)阿莫西林、氟苯尼考、恩諾沙星、強(qiáng)力霉素、氨芐青霉素不敏感(表1)。

4.2 病毒分離

4.2.1 雞胚接種 分別將5個(gè)養(yǎng)殖戶的病死雞的肺臟、氣管用剪刀剪成1 cm3左右大小，按1 ∶5(體積比)比例加入無菌PBS溶液，用研缽磨成糊狀后，再加入終濃度為2 000 U/mL雙抗溶液，混勻后置于4 ℃冰箱作用2 h后，反復(fù)凍融3次，12 000 r/min離心10 min，取上清再用0.22 μm的一次性濾器過濾，取濾液尿囊腔和尿囊膜接種10日齡SPF雞胚，0.2 mL/胚，每個(gè)樣品接種5枚。雞胚接種后棄去24 h非特異性死亡胚，大部分雞胚在72～96 h死亡，收獲死亡胚，收集其尿囊液，取出死胚發(fā)現(xiàn)胚體全身彌漫性出血，而尿囊膜沒有

表1 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

注：高度敏感標(biāo)記為“+++”；中度敏感標(biāo)記為“++”；輕度敏感標(biāo)記為“+”；不敏感標(biāo)記為“-”。

增厚等病理變化。

4.2.2 尿囊液的血凝價(jià)測(cè)定 按現(xiàn)行獸藥典中的方法進(jìn)行微量血凝試驗(yàn)。取上述各組死亡雞胚的尿囊液，逐組檢測(cè)其血凝價(jià)，結(jié)果血凝價(jià)均為7log2～9log2。

4.2.3 尿囊液的特異性檢測(cè) 按現(xiàn)行獸藥典中的方法進(jìn)行微量血凝抑制試驗(yàn)。將5家養(yǎng)殖戶病死雞病料接種雞胚后收獲的尿囊液，分別與H5、H7和H9亞型禽流感、雞新城疫、雞減蛋綜合癥標(biāo)準(zhǔn)陽性血清進(jìn)行紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)。結(jié)果顯示，所有樣品均與H5和H7亞型禽流感、雞新城疫、雞減蛋綜合癥標(biāo)準(zhǔn)陽性血清呈陰性反應(yīng)，僅與H9亞型禽流感血清呈陽性反應(yīng)，HI抑制效價(jià)為8log2～9log2。

4.2.4 分子生物學(xué)鑒定 用RT-PCR法，分別對(duì)5個(gè)養(yǎng)殖戶病死雞病料接種雞胚收獲的尿囊液進(jìn)行H5N1、H9N2、新城疫、傳染性支氣管炎4種病原核酸檢測(cè)，結(jié)果顯示，H5N1、新城疫、傳染性支氣管炎病原為陰性，H9亞型禽流感病原為陽性，均擴(kuò)增出700 bp的目的片段(圖1)。將擴(kuò)增的5株H9亞型禽流感病毒的HA基因進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果5株病毒的核酸序列完全相同，與國(guó)內(nèi)2014年、2015年公布的H9N2流行毒株同源性高于98.8%且處于進(jìn)化樹的同一分支上(圖1、圖2、圖3)。

4.2.5 IBD瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn) 將發(fā)病雞萎縮的法氏囊組織按 1 ∶3 (體積比)的比例加入無菌PBS溶液研磨成糊狀、凍融3次，8 000 r/min 離心10 min。取上清，用瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)檢測(cè)法氏囊組織中是否含有法氏囊病毒，結(jié)果瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)均為陰性。

5 結(jié)論

根據(jù)流行病學(xué)情況調(diào)查、臨床癥狀和病理變化觀察以及實(shí)驗(yàn)室診斷，分析判定該片養(yǎng)殖戶雞群為H9亞型禽流感和大腸桿菌混合感染。

6 防治措施

6.1 防疫

及時(shí)調(diào)整免疫程序，在7日齡新城疫、傳染性支氣管炎二聯(lián)弱毒疫苗點(diǎn)眼滴鼻免疫的同時(shí)，增加新城疫、H9亞型禽流感、傳染性法氏囊三聯(lián)滅活疫苗皮下注射免疫。免疫程序調(diào)整后28 d，對(duì)雞群采血，檢測(cè)ND、H9和IBD抗體水平。由表2可知，在調(diào)整免疫程序后，ND、H9疫苗的抗體水平明顯上升，所有雞的H9抗體效價(jià)平均為7.6log2，ND抗體效價(jià)平均為6.6log2。而IBD瓊擴(kuò)抗體效價(jià)平均為2.7log2。

表2 ND、H9 HI抗體水平及IBD瓊擴(kuò)抗體水平

6.2 治療

整個(gè)雞群在飼料中添加高度敏感藥物頭孢喹肟鈉，按每噸飼料500 g拌料，并在飼料中添加高質(zhì)量的電解多維。

6.3 清場(chǎng)與消毒

對(duì)已發(fā)病的雞場(chǎng)適時(shí)全部清場(chǎng)，對(duì)雞場(chǎng)內(nèi)的主干道及雞舍內(nèi)的過道用20%的石灰乳進(jìn)行全覆蓋消毒。在飼養(yǎng)過程中應(yīng)注意飼養(yǎng)環(huán)境的改善，寒冷季節(jié)保溫的同時(shí)還應(yīng)注意通風(fēng)，飼養(yǎng)密度不能太大，10～11只/m2，以免雞舍的有害氣體濃度過大刺激肉雞呼吸道，使呼吸道疾病加劇。

發(fā)病養(yǎng)雞場(chǎng)通過飼喂敏感藥物頭孢喹肟鈉，發(fā)病及死亡雞有所下降；新進(jìn)雛雞前全場(chǎng)進(jìn)行嚴(yán)格消毒并調(diào)整免疫程序，相關(guān)疫苗抗體水平明顯提高。新發(fā)病例逐步減少，整個(gè)區(qū)域的養(yǎng)雞場(chǎng)狀況逐漸平穩(wěn)。

7 小結(jié)與討論

7.1 H9亞型禽流感疫苗免疫的重要性

H9亞型禽流感病毒屬于低致病性禽流感病毒，主要侵害雞的呼吸系統(tǒng)，是當(dāng)前危害肉雞的主要疫病之一[1]。H9亞型禽流感病毒隱性感染存在一定的普遍性，單獨(dú)感染H9亞型禽流感，沒有明顯的臨床表現(xiàn)，當(dāng)存在某些致病因子或發(fā)生重大應(yīng)激時(shí)，H9亞型禽流感就表現(xiàn)出巨大的危害，例如，H9與新城疫、傳染性支氣管炎、傳染性法氏囊病毒、大腸桿菌以及霉菌毒素等的混合感染[2]。H9亞型禽流感與大腸桿菌混合感染多年來就有不斷的報(bào)導(dǎo)[3-5]，特別是在肉雞飼養(yǎng)過程中，養(yǎng)殖戶存在僥幸心理，擔(dān)心注射油苗影響出欄時(shí)雞肉的品質(zhì)而不免疫禽流感疫苗，若飼養(yǎng)環(huán)境較差，H9與大腸桿菌的混合感染就比較常見，勢(shì)必引起很大的經(jīng)濟(jì)損失，因此應(yīng)該重視并嚴(yán)格認(rèn)真做好H9亞型禽流感疫苗的免疫，特別是在禽流感的高發(fā)季節(jié)(冬春、秋冬交替季節(jié))更要加強(qiáng)H9亞型禽流感疫苗的免疫接種。

7.2 傳染性法氏囊疫苗的免疫

傳染性法氏囊活疫苗多在肉雞14日齡進(jìn)行免疫，由于現(xiàn)在采用的疫苗多是中等毒力的活苗，免疫后4 d法氏囊開始萎縮，引起雞的免疫抑制[6]，因此在活苗免疫后而抗體未產(chǎn)生前要增強(qiáng)雞體的抵抗力，可以選用增強(qiáng)免疫的中藥方劑進(jìn)行保健[7]以防免疫抑制引起其他病原的感染。另外，為了防止法氏囊活苗對(duì)機(jī)體免疫力的影響，可以選用法氏囊滅活疫苗。在本次案例中，建議養(yǎng)殖戶改用法氏囊滅活疫苗，收到很好的效果。

7.3 加強(qiáng)飼養(yǎng)管理

大腸桿菌是一種條件致病菌，在冬春季節(jié)，雞舍因過于要求保溫而忽視了通風(fēng)，造成雞舍內(nèi)病原微生物及氨氣濃度過高，會(huì)誘發(fā)該病，因此應(yīng)加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，注意環(huán)境通風(fēng)。

7.4 抗菌藥物的正確使用

當(dāng)前，由于抗菌藥物在肉雞養(yǎng)殖中的大量使用，很多細(xì)菌已經(jīng)對(duì)大部分常規(guī)抗生素產(chǎn)生廣泛耐藥性和多重耐藥性[8]，因此，應(yīng)定期對(duì)致病性細(xì)菌進(jìn)行抗生素敏感性檢測(cè)，以選取有效的抗菌藥物。

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