楊 旭， 吳德智， 袁 偉， 胡孝枝

(1.湖北生態(tài)工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖北武漢 430200； 2.湖北省麻城市國營五腦山林場，湖北麻城 435000)

通信作者：胡孝枝，高級工程師，主要從事花卉資源培育方面的研究。E-mail：964216884@qq.com。

茶花是山茶科山茶屬中具有觀賞價(jià)值的常綠灌木或小喬木的統(tǒng)稱，其形姿優(yōu)美、葉片濃綠有光澤、花色各異、花型繁多，是世界名貴花卉之一。目前全世界的茶花品種已達(dá)3萬余種[1]，中、日、英、美、意、法、德、澳大利亞、新西蘭等國都有栽培和繁育。我國是茶花的起源中心，資源極其豐富，已培育出的近千個茶花品種在園林工程和園藝盆景上應(yīng)用廣泛，因此茶花也被稱為“中國十大名花”之一[2]。

茶花經(jīng)過長期的異花授粉和自然選擇，產(chǎn)生了許多新品種，種質(zhì)交流頻繁，但由于我國茶花品種分類缺乏系統(tǒng)性研究，同名異物和同物異名現(xiàn)象嚴(yán)重，導(dǎo)致出現(xiàn)品種間遺傳差異小、品種創(chuàng)新不足等問題[3-4]。而以往對茶花品種的研究多以形態(tài)觀察、細(xì)胞學(xué)等為主，這種方法無法擺脫環(huán)境飾變的影響，存在很大的局限性和不確定性，對性狀相似的品種很難鑒別。在此背景下，新的遺傳多態(tài)性檢測手段——DNA分子標(biāo)記技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生，目前已有許多學(xué)者利用隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(random amplification polymorphic DNA，RAPD)、簡單序列重復(fù)(simple sequence repeat，SSR)、簡單序列重復(fù)間(inter-simple sequence repeat，ISSR)、限制性片段長度多態(tài)性(restriction fragment length polymorphism，RFLP)等對茶花開展了相關(guān)研究，而利用限制性擴(kuò)增片段長度多態(tài)性(amplified fragment length polymorphism，AFLP)分子標(biāo)記技術(shù)對茶花種質(zhì)資源遺傳多樣性進(jìn)行研究的報(bào)道甚少。與其他分子標(biāo)記方法相比，AFLP具有用量少、可重復(fù)性好、多態(tài)性強(qiáng)、分辨率高、試驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定可靠等特點(diǎn)[5-8]。本研究應(yīng)用此方法分析了35份茶花種質(zhì)資源的遺傳多態(tài)性和親緣關(guān)系，以期為茶花鑒別、雜交育種及其起源演化提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試茶花品種共35份(表1)，均采自湖北省麻城市國營五腦山林場內(nèi)的茶花種質(zhì)資源圃。

表1 供試的茶花品種

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 采集茶花新梢葉片，裝入含有硅膠的自封袋中，干燥后放入-20 ℃冰箱中，采用CTAB法[9]提取樣品基因組DNA。

1.2.2 AFLP分析 酶切體系(20 μL)：4 μL 10×Buffer tango，0.4 μLEcoRⅠ(10 U/μL)，0.4 μLMseⅠ(10 U/μL)，37 ℃ 3 h接著65 ℃ 3 h條件下完成。加入2 μL 10×T4Buffer，1 μLEcoRⅠ酶切頭(adaptor)(50 μmol/L)，1 μLMseⅠ adaptor(50 μmol/L )，10 μL T4DNA連接酶，0.4 μL(5 U/μL)酶切產(chǎn)物，16 ℃連接，過夜。利用Primer-EcoRⅠ-A和Primer-MseI-C進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增。選擇性擴(kuò)增反應(yīng)體系(20 μL)為2 μL 10×Buffer，0.4 μL 10 mmol/L脫氧核糖核苷三磷酸(deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTPs)，0.2 μL 5 U/μLTaq酶，5 μL預(yù)擴(kuò)稀釋液。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性35 s，65 ℃復(fù)性35 s，72 ℃延伸1 min，12個循環(huán)；94 ℃變性30 s，56 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸1 min，23個循環(huán)。6%變性聚丙烯酰胺膠電泳分離，銀染顯色。試驗(yàn)所用AFLP接頭及選擇性擴(kuò)增引物序列見表2。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析 利用GeneMarker 2.2軟件將35份樣品、7對引物組合擴(kuò)增得到的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，將各泳道內(nèi)分子量內(nèi)標(biāo)的位置與各樣品峰值的位置作比較分析，得到片段的大小，再根據(jù)無帶和有帶情況轉(zhuǎn)化為0，1數(shù)據(jù)矩陣。依據(jù)Nei等的方法[10-11]，利用POPGENE和NTsys-pc 2.1軟件[12-13]對樣品進(jìn)行遺傳多樣性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 7對引物組合的擴(kuò)增效率

選用7對引物組合對35份茶花品種進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果(表3)顯示，共分離出508條清晰有效的條帶，其中456條具有多態(tài)性，占89.76%；平均每對引物組合擴(kuò)增出72.6條，其中65.1條具有多態(tài)性?？梢钥闯?，利用AFLP進(jìn)行基因多態(tài)性檢測，效率高且擴(kuò)增片段多、多態(tài)性高，有利于品種間遺傳差異的分析。7對引物擴(kuò)增出的觀察等位基因數(shù)范圍為1.878 8～1.915 9個，有效等位基因數(shù)范圍為1.419 7～1.548 1 個，Nei’s基因多樣性指數(shù)(H)范圍為0.255 9～0.320 3，香農(nóng)指數(shù)(I)范圍為0.396 5～0.476 7，具有較豐富的遺傳多樣性。

表2 引物和接頭序列

表3 7對擴(kuò)增引物產(chǎn)生的條帶多態(tài)性及遺傳多樣性水平

2.2 茶花品種的分子系統(tǒng)樹

利用非加權(quán)組平均(unweighted pair-group method with arithmetic means，UPGMA)聚類法對35份供試茶花品種進(jìn)行遺傳距離矩陣分析，形成分子系統(tǒng)樹(圖1)。當(dāng)以平均遺傳距離(0.69)來劃分時(shí)，可分成三大類群：大類群Ⅰ為皮斯先生、難忘、毛緣黑瑪瑙、白寶塔、皇家天鵝絨、依莎安妮、黃達(dá)、抓破臉、牛西奧轉(zhuǎn)馬、撒威達(dá)的夢、道溫的曙光、狄斯、哈氏微笑、紅十八學(xué)士、女皇二號、大和錦、花芙蓉、可娜、琳布蕾、麻姑仙子、花鶴翎、亂世佳人、愛麗牡丹王和黛安娜皇后等24個品種，其又可分為2個亞類群，亞類群Ⅰ包括17個品種，亞類群Ⅱ包括7個品種；大類群Ⅱ?yàn)楠{子笑、六角大紅、金盤荔枝、閃爍、牛西奧美玉、絲紗羅、大卡特等7個品種；大類群Ⅲ包括娃麗娜深、帕克斯先生和情人節(jié)等3個品種；而黑魔法則未被劃入三大類群之中。

2.3 品種間的親緣關(guān)系

從表4可知，品種間的遺傳相似系數(shù)范圍為0.17～0.52，平均系數(shù)為0.37；遺傳距離范圍為0.50～0.84，平均距離為0.69。娃麗娜深和女皇二號之間的相似性系數(shù)最大(0.52)，說明它們親緣關(guān)系較近，且具有較小的遺傳距離(0.66)；花鶴翎和亂世佳人的相似性系數(shù)最小(0.17)，說明它們的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，遺傳距離也最大(0.84)。

3 結(jié)論與討論

據(jù)報(bào)道，倪穗等利用ISSR技術(shù)對國內(nèi)外20個茶花品種進(jìn)行了遺傳多樣性分析，21對引物擴(kuò)增出153條條帶，多態(tài)性為95.4%[14]；張景榮等利用RAPD技術(shù)對國內(nèi)外23個茶花品種進(jìn)行種質(zhì)資源遺傳多態(tài)性的研究，10對引物擴(kuò)增出126條條帶，多態(tài)性為88.2%[15]；申屠文月等結(jié)合RAPD分子標(biāo)記技術(shù)對山茶花3個栽培變異新品種的遺傳差異進(jìn)行分析，多態(tài)性為51.7%[16]。而本試驗(yàn)利用AFLP技術(shù)對35個茶花品種的遺傳多樣性進(jìn)行研究，7對引物擴(kuò)增出508條條帶，多態(tài)性為89.76%，平均遺傳距離為0.69，可見茶花品種間遺傳多樣性高，能準(zhǔn)確且高效地反映基因組組成上的差異，可以較好地區(qū)分表型特征非常相似的基因型，如花鶴翎和亂世佳人、牛西奧美玉和抓破臉等，這說明AFLP適用于茶花品種間的遺傳多樣性分析和種質(zhì)資源鑒別，是研究茶花種質(zhì)的有效方法之一。此外，研究結(jié)果還顯示，隨著資源和引物數(shù)量的增加，多態(tài)性程度也會提高[17]。

表4 樣品間的Nei和Li相似系數(shù)(對角線下方)和遺傳距離矩陣(對角線上方)

編號123456789101112131415161718290．400．310．350．360．310．350．430．380．400．390．360．340．380．340．420．360．360．37300．450．410．410．400．350．350．440．370．400．400．400．360．330．320．430．330．400．35310．380．310．360．390．370．390．460．390．380．410．440．370．340．330．390．300．390．32320．470．430．440．380．390．400．470．370．390．410．380．380．380．350．400．310．400．31330．360．330．330．360．310．350．380．330．340．360．410．300．360．300．520．360．340．31340．490．430．440．460．440．430．500．390．430．450．450．420．440．440．280．410．340．35350．380．330．340．380．360．360．350．380．370．350．410．320．380．390．470．320．330．33編號192021222324252627282930313233343510．690．660．700．690．660．630．700．690．680．710．670．640．690．620．700．610．6920．710．670．720．710．730．610．680．710．690．710．730．660．730．650．720．650．7230．700．690．740．690．720．690．730．740．690．710．710．660．690．650．720．650．7140．720．690．690．700．660．680．710．670．660．690．690．670．680．680．700．630．6850．710．680．720．710．690．650．710．730．710．690．730．700．690．680．740．640．7060．690．670．730．670．650．660．710．710．690．700．710．700．680．670．710．650．7070．650．640．680．670．680．620．680．680．640．660．650．650．630．630．690．610．7080．700．710．730．740．680．690．670．700．700．710．680．690．680．690．720．680．6990．700．670．740．680．700．660．720．720．700．710．670．670．680．680．710．650．69100．720．670．700．700．660．650．680．680．670．720．680．670．660．660．700．640．70110．720．700．660．720．690．650．670．690．660．680．700．670．650．680．670．640．66120．700．700．700．690．720．670．680．720．690．740．710．690．690．690．740．660．73130．740．720．720．710．690．690．720．710．670．710．690．720．710．680．690．640．68140．760．740．720．840．680．690．710．730．730．690．710．720．720．700．740．640．68150．640．630．650．650．650．740．650．660．640．650．660．650．680．670．600．760．62160．700．690．780．710．710．680．680．740．690．720．700．720．740．740．700．670．73170．690．690．730．700．690．680．700．730．740．700．690．670．680．670．710．710．72180．690．680．720．690．700．660．680．740．720．680．690．710．730．740．730．700．7219—0．730．690．760．690．680．740．710．690．730．720．710．710．680．700．660．70200．32—0．690．700．690．670．670．680．700．710．710．730．680．700．720．660．68210．370．37—0．700．710．690．710．750．700．700．700．690．730．700．720．670．72220．280．360．35—0．680．680．670．700．700．720．710．700．750．680．730．650．68230．370．370．340．38—0．620．670．720．680．700．700．680．700．690．700．650．69240．390．400．370．390．47—0．690．650．660．700．640．680．660．690．650．770．63250．300．400．340．400．400．37—0．720．710．690．690．670．690．680．700．680．69260．340．390．290．350．330．430．33—0．770．690．740．710．770．710．730．690．71270．370．360．350．360．390．420．350．26—0．690．720．710．760．710．710．720．67280．310．340．350．330．360．360．370．360．37—0．720．700．700．690．700．660．71290．330．340．350．340．350．450．380．300．330．33—0．730．730．700．700．660．69300．350．310．370．360．380．390．400．340．340．350．31—0．740．770．700．640．68310．340．390．310．280．350．410．380．270．270．350．310．30—0．740．750．670．71320．380．350．360．390．370．370．390．340．340．380．350．260．30—0．690．680．66330．350．330．330．320．360．440．350．310．340．350．360．360．290．37—0．650．74340．410．410．400．430．440．270．390．370．320．420．420．450．400．380．43—0．67350．350．390．330．390．370．470．380．350．400．340．380．390．340．410．310．40—

注：編號同表1。

通過UPGMA聚類分析可以發(fā)現(xiàn)，供試的35份材料被分成3個大類群，結(jié)果與理論上期望的有所偏差：一是來自同一種群的品種聚類情況存在差異。帕克斯先生、情人節(jié)、娃麗娜深和大卡特都是云南山茶與紅山茶雜交選育出來的品種，前三者同聚于大類群Ⅲ，而大卡特卻與閃爍、牛西奧美玉、絲紗羅等紅山茶同聚于大類群Ⅱ，這可能是由于茶花在長期的引種培育與傳播過程中交換了遺傳物質(zhì)[18]，也有可能是在流通過程中混淆了表型相似的品種，導(dǎo)致供試材料的真實(shí)性有誤。二是相同地理起源的品種聚類情況存在差異，如皇家天鵝絨、黃達(dá)、道溫的曙光、閃爍、牛西奧美玉等都是美國加州牛西奧苗圃選育出來的紅山茶，前三者在大類群Ⅰ，后兩者在大類群Ⅱ，這可能與引物偏少而使分子標(biāo)記的數(shù)量受限有關(guān)[19]，也可能是不同品種為了適應(yīng)新的環(huán)境發(fā)生了相似性的變異。

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