李夢尋， 胡九英， 孫敬禮， 魯慧文， 汪德明， 王 忻， 劉 乙， 馬力鵬， 李 濤， 沈永巧， 來紅霞， 黃 濤

(1.石河子大學(xué)動物科技學(xué)院，新疆石河子 832000； 2.新疆正大食品有限公司，新疆五家渠 831301)

豬的繁殖性能是重要經(jīng)濟性狀，但遺傳力低，利用常規(guī)育種對該性狀進行遺傳改良進展緩慢。利用影響產(chǎn)仔性能的主效基因進行分子標記輔助育種是加快母豬繁殖性狀遺傳進展的有效途徑。

FSH-β是促卵泡素β基因。促卵泡素(FSH)是哺乳動物卵子和精子成熟的主要刺激物，是α/β異二聚體糖蛋白激素家族的成員。α和β二亞基非共價連接，β亞基決定著每種激素的生理特征[1]。FSH能誘導(dǎo)雌性動物的卵泡發(fā)育、促進子宮內(nèi)膜生長等，F(xiàn)SH還協(xié)同促黃體生成素(LH)一起刺激性腺類固醇、雌二醇和孕酮的合成和分泌，而這些固醇類物質(zhì)又可以直接或間接地調(diào)控FSH的合成[2]。FSH在畜牧業(yè)生產(chǎn)中用于家畜的同期發(fā)情和超數(shù)排卵等[3]。有研究認為FSH-β基因可作為遺傳學(xué)中有關(guān)繁殖性狀研究的重要分子標記，基因中的1處逆轉(zhuǎn)座子插入突變產(chǎn)生AA、AB、BB 3種基因型[4]。

催乳素受體(PRLR)是細胞分裂素受體超家族，是一個單獨的膜被蛋白[5]。PRLR的缺失會影響催乳素蛋白的作用，使催乳素不能與之結(jié)合，進而不能通過受體作用于靶細胞而引起靶基因的表達。PRLR基因的突變可以提高窩產(chǎn)子數(shù)和窩產(chǎn)活子數(shù)，降低木乃伊率，PRLR基因的敲除會引起動物的繁殖障礙疾病[6]。目前，PRLR基因的作用引起了豬育種研究者的重視，并把它作為繁殖性狀的候選基因之一。

FUT1基因位于6號染色體上，是編碼α-(1，2)巖藻糖轉(zhuǎn)移酶的基因，多數(shù)研究發(fā)現(xiàn)其與豬腹瀉有關(guān)，但近年來也有研究證明FUT1與母豬繁殖性狀有關(guān)。

母豬繁殖性狀是數(shù)量性狀，遺傳力低。遺傳、季節(jié)、胎次和周圍環(huán)境等因素都能對其造成影響。FSH-β、PRLR和FUT1基因與豬繁殖性能有密切關(guān)聯(lián)，但由于試驗群體和樣本量不同，研究結(jié)果各有差異。此外多項研究發(fā)現(xiàn)，單個候選基因的優(yōu)勢等位基因和基因型對母豬繁殖性狀的影響不顯著，而多個候選基因合并基因型對母豬繁殖性狀的影響有顯著差異。本研究檢測了大白豬FSH-β、PRLR和FUT1基因多態(tài)性，并分析其單個基因的基因型和合并基因型與豬繁殖性狀之間的關(guān)系，以便為大白豬分子標記輔助選擇提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗所選用的269頭大白母豬均來自新疆正大種豬場。采集耳組織樣本，放入含1 mL 75%乙醇的Eppendoff管內(nèi)，放入冰盒帶回實驗室，-20 ℃保存，以備后面的樣本組織DNA提取。此外搜集整理了樣本群體第二胎的總產(chǎn)仔數(shù)、產(chǎn)活仔數(shù)、健子數(shù)、窩質(zhì)量、初生體質(zhì)量、死胎、木乃伊、弱仔和畸形等繁殖性狀相關(guān)資料。

1.2 試驗試劑

2×EsTaqMaster Mix，購自CWBIO公司；Marker DL2000、血液、細胞、組織基因組DNA抽提試劑盒，均購自TIANGEN公司；限制性內(nèi)切酶AluⅠ、HhaⅠ，購自TaKaRa公司。

1.3 引物設(shè)計與合成

FSH-β、PRLR和FUT1基因PCR擴增引物參照施啟順等的引物序列[7-8]，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，引物序列信息見表1。

表1 引物序列信息

1.4 豬耳組織DNA提取

用血液、細胞、組織基因組DNA抽提試劑盒對所采集母豬耳組織樣進行基因組DNA提取并檢測其濃度，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 PCR擴增與多態(tài)性檢測

1.5.1 PCR擴增 PCR反應(yīng)體系15.0 μL：2×EsTaqMaster Mix 7.5 μL，上、下游引物各0.4 μL，模板DNA 0.5 μL，去離子水6.2 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃變性4 min，35次循環(huán)(94 ℃，30 s；56、60、57 ℃，30 s；72 ℃，30 s)，72 ℃延伸 5 min。所有基因PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠檢測后方可進行下一步反應(yīng)。

1.5.2 基因型檢測FSH-β基因由片段插入造成，2.0%瓊脂糖電泳檢測PCR產(chǎn)物即可見多態(tài)性。PRLR基因酶切反應(yīng)：13.0 μL PCR產(chǎn)物、0.5 μL AluⅠ及1.5 μL Buffer，37 ℃水浴4 h，反應(yīng)結(jié)束后取酶切產(chǎn)物10.0 μL用4.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測分型。FUT1基因酶切反應(yīng)：8.5 μL PCR產(chǎn)物、0.5 μL HhaⅠ和1.0 μL Buffer，37 ℃水浴3 h，酶切產(chǎn)物 10 μL 用2.0%的瓊脂糖電泳檢測分型。

1.6 數(shù)據(jù)整理與統(tǒng)計分析

用Excel表格計算基因頻率、基因型頻率、多態(tài)信息含量、有效等位基因數(shù)、群體雜合度，并對基因型分布進行Hardy-Weinberg平衡檢驗[9]，用SPSS 17.0分析總產(chǎn)仔數(shù)、產(chǎn)活仔數(shù)、健仔數(shù)等繁殖性狀在不同基因型之間的差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴增及酶切結(jié)果

FSH-β基因由片段插入得到，瓊脂糖電泳檢測PCR產(chǎn)物即可見多態(tài)性，PCR產(chǎn)物經(jīng)2.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，產(chǎn)生3種帶型：500 bp純合子(AA基因型)；500、220 bp雜合子(AB基因型)；220 bp純合子(BB基因型)。

PRLR基因PCR產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶AluⅠ酶切后，產(chǎn)生3種帶型：85、59、19 bp的命名為AA基因型；104、85、59、19 bp 的命名為AB基因型；104、59 bp的命名為BB基因型。

FUT1基因PCR產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶HhaⅠ酶切后經(jīng)2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測到3種帶型：328、93 bp的命名為AA基因型；328、241、93、87 bp的命名為AB基因型；241、93、87 bp的命名為BB基因型。

2.2 各基因型頻率、基因頻率及群體遺傳特性

2.2.1 各基因型頻率、基因頻率 由表2可知，F(xiàn)SH-β基因型頻率在大白豬為AB>BB>AA，優(yōu)勢基因均為B等位基因優(yōu)勢。PRLR基因型頻率在大白豬為AB>AA>BB，優(yōu)勢基因均為A基因。FUT1基因型頻率在大白豬為BB>AB>AA，優(yōu)勢基因均為B基因。

表2 FSH-β、PRLR和FUT1基因的基因型頻率及等位基因頻率

2.2.2 不同基因的群體遺傳特性 由表3可知，F(xiàn)SH-β、PRLR和FUT1基因在試驗群體中具有中度多態(tài)(0.25

表3 基因多態(tài)信息含量(PIC)、雜合度(H)、有效等位基因數(shù)(Ne)及χ2檢驗

注：df=2，P=0.05時χ2=5.99，P=0.01時χ2=9.21。

2.3 基因多態(tài)性與豬繁殖性狀的關(guān)聯(lián)分析

2.3.1 單個基因多態(tài)性與豬繁殖性狀的關(guān)聯(lián)分析FSH-β基因各基因型間母豬繁殖性狀上均無顯著差異，因此表中并未列出。由表4可知，對于PRLR基因，AA、AB型個體總產(chǎn)仔數(shù)分別比BB型個體高出2.07頭/胎(P<0.05)和1.30頭/胎(P<0.05)，各基因型間其他繁殖性狀上均無顯著差異。對于FUT1基因，AA型個體弱仔數(shù)分別比BB、AB型少1.24頭/胎(P<0.05)和1.02頭/胎(P<0.05)，AA型個體畸形胎兒數(shù)比AB、BB型個體高0.72頭/胎(P<0.01)和0.71頭/胎(P<0.01)，其他繁殖性狀上各基因型間均無顯著差異。

2.3.2 合并基因型與豬繁殖性狀的關(guān)聯(lián)分析

2.3.2.1FSH-β與PRLR合并基因型與母豬繁殖性狀的關(guān)聯(lián)分析 由表5可知，在總產(chǎn)仔數(shù)、總活仔數(shù)性狀上FSH-β—PRLR合并基因AAAA型個體比AABB型高出4.6頭/胎(P<0.01)和3.9頭/胎(P<0.01)；在窩質(zhì)量性狀上，AAAA型個體高于AABB型5.4 kg/胎(P<0.05)。因此，在大白豬中FSH-β-PRLR最優(yōu)分子標記組合為AAAA。

表4 PRLR和FUT1基因多態(tài)性與母豬繁殖性狀的關(guān)聯(lián)分析

注：同列小寫字母、大寫字母不同者分別為差異顯著(P<0.05)、極顯著(P<0.01)。下表同。

表5 FSH-β和PRLR合并基因型與大白豬繁殖性狀的關(guān)聯(lián)分析

聯(lián)分析 由表6可知，在大白豬中FSH-β—FUT1的ABAB型個體木乃伊胎數(shù)量比BBBB型多0.28頭/胎(P<0.05)；在子代畸形數(shù)量上BBAA型個體多于其他基因型(P<0.01)；在其他繁殖性狀上各基因型間均無顯著差異。

表6 FSH-β和FUT1合并基因型與大白豬繁殖性狀的關(guān)聯(lián)分析

2.3.2.3PRLR與FUT1合并基因型與母豬繁殖性狀的關(guān)聯(lián)分析 由表7可知，在大白豬中，PRLR—FUT1合并基因型BBAB型個體木乃伊胎數(shù)量多于其他各基因型(P<0.01)，ABAA、BBBB型低于AAAB、AABB、ABAB、ABBB型(P<0.01)；在其他繁殖性狀上各基因型間均無顯著差異。

表7 PRLR和FUT1合并基因型與大白豬繁殖性狀的關(guān)聯(lián)分析

2.3.2.4FSH-β、PRLR與FUT1合并基因型與母豬繁殖性狀的關(guān)聯(lián)分析 由表8可知，在大白豬中由于FSH-β—PRLR—FUT1中AAAAAB和AABBAB型個體的數(shù)量少于3頭，因此這2種基因型不參與多重比較。FSH-β—PRLR—FUT1 BBAABB型個體的總產(chǎn)仔數(shù)和活仔數(shù)分別比BBABAB型多3.20頭(P<0.01)、2.98頭(P<0.05)。因此，在大白豬中FSH-β—PRLR—FUT1最優(yōu)分子標記組合為BBAABB。

3 結(jié)果與討論

FSH-β是母豬繁殖性狀的一個主效基因。研究表明B等位基因為優(yōu)勢基因，初產(chǎn)母豬FSH-β基因的AB基因型健仔數(shù)比AA型多1.21頭(P<0.01)，經(jīng)產(chǎn)母豬各基因型之間產(chǎn)仔數(shù)差異不顯著[9]。在趙要風(fēng)等的研究中，杜洛克、大約克、長白等國外豬種中BB型為FSH-β的優(yōu)良基因型，AA型比較罕見[10]。而Korwin-Kossakowska等研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)SH-β對產(chǎn)仔數(shù)的提高無顯著影響[11-12]。本研究所用經(jīng)產(chǎn)大白豬群體優(yōu)勢基因均為B等位基因，優(yōu)良基因型為BB型，F(xiàn)SH-β的不同基因型對不同繁殖性狀的影響均不顯著，這表明單個基因FSH-β對經(jīng)產(chǎn)母豬的繁殖性狀的選擇不具有顯著意義。

PRLR也是母豬繁殖性狀的主效基因之一，由腺垂體分泌，含有膜外結(jié)構(gòu)域、跨膜域和胞內(nèi)域3個部分，胞內(nèi)域的變異導(dǎo)致了受體結(jié)構(gòu)的多樣性[13-14]。王立辛等報道了PRLR基因在長白、大白和杜洛克群中基因頻率及基因型頻率情況，長白群中AB的基因型頻率最高，杜洛克群中AA的基因型頻率最高，A等位基因在各種群中占主導(dǎo)地位[15]。Isler等研究，PRLR基因?qū)A、AB和BB型的母豬的子宮角胎兒的平均數(shù)都有影響，并呈現(xiàn)出AA型>AB型>BB型，其中B型基因是有利基因[16]。本研究中大白豬群體中A等位基因為優(yōu)勢基因，AB型為優(yōu)勢基因型，AA、AB型個體的總產(chǎn)仔數(shù)多于BB型個體，這表示A基因為大白豬總產(chǎn)仔性狀的正效基因，對PRLR基因的A基因進行合理地選擇，可能會有效提高大白豬的總產(chǎn)仔數(shù)，以提高母豬生產(chǎn)效應(yīng)。

表8 FSH-β、PRLR和FUT1合并基因型與大白豬繁殖性狀的關(guān)聯(lián)分析

FUT1是一種巖藻糖轉(zhuǎn)移酶，F(xiàn)UT1基因位于豬的6號染色體上，多數(shù)研究發(fā)現(xiàn)其與仔豬腹瀉有關(guān)，但證明FUT1與母豬繁殖形狀的研究很少。吳圣龍對蘇太豬基因位點各基因型的生產(chǎn)性能比較研究結(jié)果表明，AB基因型的個體平均生產(chǎn)性能高于基因型BB的個體，AB基因型的個體胎斷奶窩質(zhì)量、胎總產(chǎn)仔數(shù)和胎斷奶窩質(zhì)量均顯著高于BB基因型的個體[17]。在本研究的大白豬群體中，等位基因B為優(yōu)勢基因，BB型為優(yōu)勢基因型。在大白豬中AA型個體的弱仔數(shù)顯著低于AB、BB，而胎兒的畸形數(shù)卻極顯著高于AB、BB，其他繁殖性狀的各基因型間差異均不顯著，這或許可以說明A基因為大白豬弱仔和胎兒畸形性狀的負效基因，對FUT1基因的A等位基因進行合理選擇，可能會有效減少大白豬產(chǎn)弱仔和畸形胎兒的數(shù)量，以提高母豬活仔、健仔數(shù)的產(chǎn)出。

合并基因型分析結(jié)果表明，合并基因型的遺傳效應(yīng)高于單個基因型的遺傳效應(yīng)[18]。在大白豬中FSH-β—PRLR不同合并基因型在總產(chǎn)仔數(shù)、總活仔數(shù)、窩質(zhì)量、出生體質(zhì)量、死胎性狀上不同的基因型皆有顯著性差異。FSH-β—FUT1在大白豬的ABAB型個體的木乃伊胎數(shù)比BBBB型高；BBAA型個體的胎兒畸形數(shù)多于AAAB、AABB、ABAB、ABBB、BBAB、BBBB型。PRLR-FUT1在大白豬的木乃伊胎性狀上BBAB型極顯著高于其他各基因型。FSH-β—PRLR—FUT1在大白豬的總產(chǎn)仔數(shù)、總活仔數(shù)、死胎、木乃伊胎、窩質(zhì)量、出生體質(zhì)量性狀上不同基因型皆有一定的差異性。

本研究分析發(fā)現(xiàn)，大白豬繁殖性狀FSH-β—PRLR最優(yōu)分子標記組合為AAAA，F(xiàn)SH-β—PRLR—FUT1最優(yōu)分子標記組合BBAABB。這提示在種豬繁殖性狀的選育過程中，應(yīng)根據(jù)豬群特征有目的地選擇2個或多個影響繁殖性能的候選基因進行合并，并結(jié)合分子標記輔助育種方法來進一步有效地改善母豬的繁殖性狀。

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