朱珍珍 李青霞 鄧嘉儀 鄭梓唯 趙鋆偉 唐建洲

（長沙學(xué)院 生物與環(huán)境工程學(xué)院，湖南長沙 410022）

南美白對蝦自從引進(jìn)以來就深受廣大對蝦養(yǎng)殖業(yè)者的喜愛，養(yǎng)殖規(guī)模就迅速擴(kuò)大，短短幾年時間就發(fā)展成我國養(yǎng)殖面積最廣的對蝦。然而，近年來隨著養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大和放養(yǎng)密度的增加，由細(xì)菌和病毒性疾病引發(fā)的病害也日趨嚴(yán)重，給養(yǎng)殖者造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，已成為當(dāng)前限制凡納濱對蝦養(yǎng)殖業(yè)持續(xù)發(fā)展的瓶頸問題。我國具有豐富的植物資源，應(yīng)用植物藥來防治水產(chǎn)動物疾病有著悠久的歷史[1]。植物藥具有天然、環(huán)保、無藥物殘留、對病原微生物不易產(chǎn)生抗藥性、毒副作用較小等優(yōu)點(diǎn)，也能提高水產(chǎn)動物的抗應(yīng)激能力，因此植物藥的開發(fā)和利用受到國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注，對飼料工業(yè)、水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)以及環(huán)境保護(hù)與人類健康都具有重大的現(xiàn)實(shí)意義。

五倍子為蚜科昆蟲角倍蚜或倍蛋蚜在其寄主鹽膚木、青麩楊或紅麩楊等樹上形成的蟲癭，異名文蛤、百蟲倉、木附子等。研究表明，五倍子具有很強(qiáng)的抗菌作用，主要藥效成分單寧酸（Tannin Acid），又稱丹寧、鞣酸或鞣質(zhì)。植物單寧酸具有天然、高效等優(yōu)點(diǎn)，具有廣闊的開發(fā)前景和應(yīng)用價值。臨床研究表明五倍子佐以慶大霉素、甲硝哇能增強(qiáng)殺菌效果，特別對銅綠假單抱菌、厭氧菌的作用尤為顯著，五倍子對羊毛樣抱子菌等真菌也有較強(qiáng)的抑制作用[2]。

本文對傳統(tǒng)的鹽酸提取法進(jìn)行了優(yōu)化，并研究了五倍子提取物對弧菌的抑制作用，為南美白對蝦健康養(yǎng)殖和可持續(xù)發(fā)展奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 五倍子

本實(shí)驗(yàn)所采用的五倍子為藥店購買。

1.1.2 弧菌

本實(shí)驗(yàn)室保存的弧菌有副溶血弧菌ATCC17802、溶藻弧菌ATCC33787和創(chuàng)傷弧菌ATCC27562。

1.1.3 培養(yǎng)基

培養(yǎng)基主要為2216E液體培養(yǎng)基、2216E固體培養(yǎng)基，均購自青島高科園海博生物技術(shù)有限公司。2216E 半固體培養(yǎng)基配置方法：按照質(zhì)量比 1：1 的比例稱分別取 2216E 固體培養(yǎng)基與 2216E液體培養(yǎng)基，后加入適量蒸餾水備用[3]。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 五倍子提取物的制備

采用超聲波法優(yōu)化傳統(tǒng)提取工藝提取五倍子有效成分，并采用液相色譜的方法分析提取物的濃度和純度。

1.2.2 單因子實(shí)驗(yàn)設(shè)計

以溶劑濃度、溶劑倍量、超聲波時間和超聲波頻率為單因子水平開展提取實(shí)驗(yàn)[4]（表1）。

表1 超聲波提取單因子參數(shù)

1.2.3 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計

在單因子實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，本試驗(yàn)采用正交表，對五倍子沒食子酸提取率影響最大的四個因素鹽酸濃度、溶劑倍量、超聲波時間和超聲波頻率4個因素，選擇3個水平進(jìn)行優(yōu)選。超聲方法為間歇超聲，即每超聲3秒，間歇3秒（見表2）。

表2 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計表

1.2.4 實(shí)驗(yàn)菌株的活化

實(shí)驗(yàn)室保存的副溶血弧菌ATCC17802、溶藻弧菌ATCC33787和創(chuàng)傷弧菌ATCC27562三種弧菌凍干粉，進(jìn)行活化處理，分別接種于2216E液體培養(yǎng)基中，溫度28℃、轉(zhuǎn)速180r/min的搖床上培養(yǎng)，備用。

1.2.5 體外弧菌抑制實(shí)驗(yàn)

試驗(yàn)不同濃度五倍子提取物對副溶血弧菌ATCC17802、溶藻弧菌ATCC33787和創(chuàng)傷弧菌ATCC27562的抑制作用，設(shè)計五倍子提取物的濃度梯度0.03125、0.0625、0.125、0.25、0.5、1 g/ml，研究五倍子提取物的體外抑制弧菌效果，獲得抑制弧菌生長與繁殖的最佳五倍子提取物濃度[5-6]。

2 結(jié)果與分析

2.1 五倍子提取物含量分析

五倍子提取物標(biāo)準(zhǔn)物進(jìn)樣量為10μl，保留時間為4.851min，峰面積為3226273。

2.2 單因子實(shí)驗(yàn)對五倍子提取物的提取量的影響

2.2.1 鹽酸濃度對五倍子提取物提取量的影響

用不同倍量的鹽酸水解五倍子粉末后所檢測出的峰面積是不同的，但是當(dāng)變量是溶劑倍量時，峰面積的大小不能代表沒食子酸的含量。但是，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)樣品測出的濃度與峰面積的關(guān)系。就可以通過不同倍量峰面積大小求出相應(yīng)的沒食子酸濃度，再用濃度乘以相應(yīng)水解倍數(shù)（10倍、20倍、30倍、40倍、50倍）便能得到?jīng)]食子酸含量。在鹽酸濃度、溶劑倍量、超聲波時間和超聲波頻率一定的條件下，當(dāng)鹽酸濃度為1mol/L時，其液相色譜峰面積最大，能提取出五倍子有效成分的含量最多，此為最佳濃度。

2.2.2 溶解倍數(shù)對五倍子提取物提取量的影響

五倍子粉末在酸性溶液（HCl）中水解后，其中的主要成分—鞣質(zhì)被水解成沒食子酸，然后將其置于超聲波儀器中提取，最后用高效液相色譜法（HCLP）檢測其中的沒食子酸含量。在鹽酸濃度為6M時，進(jìn)料量為10μl，當(dāng)溶解倍數(shù)為20倍時，五倍子提取物的液相色譜圖的峰面積值最大，所以由此得出提取五倍子提取物的最佳溶解倍數(shù)為20倍。

2.2.3 超聲波時間對五倍子提取物提取量的影響

沒食子酸的含量測定采用HPLC法。具體方法為：五倍子粉末在酸性溶液（HCl）中水解后，其中的主要成分—鞣質(zhì)被水解成沒食子酸，然后將其置于超聲波儀器中提取，將提取液在12000rpm、5min條件下離心后，進(jìn)樣。在進(jìn)料量為10μl，鹽酸濃度為6M，提取五倍子提取物的超聲波時間是5min時，峰面積最大，則此時間為最佳提取時間。

2.2.4 超聲波時頻率對五倍子提取物提取量的影響

當(dāng)變量是超聲波提取功率時，峰面積的大小正是代表了所提取出的沒食子酸的含量。由圖5可知，超聲波功率在40～200W范圍之間時，峰面積大小變化是沒有準(zhǔn)確的規(guī)律可循的，但是超聲波功率調(diào)整到200W之后，峰面積與超聲波功率呈正比關(guān)系，而后，峰面積大小與超聲波功率呈負(fù)相關(guān)。在其他條件不變、超聲波提取功率在240W時，其液相色譜峰面積最大。所以提取五倍子主要物質(zhì)—鞣質(zhì)時，最佳的超聲波提取功率為240W。

2.3 正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)下五倍子提取物的最佳提取條件

最佳的提取五倍子提取物的條件是1mol/L HCl、溶解倍數(shù)為20倍、超聲波20min 和頻率240W。

2.4 不同濃度的鹽酸提取的五倍子提取物抑菌效果

在一定的條件下，五倍子提取物濃度的越高，其對副溶血弧菌、創(chuàng)傷弧菌和溶藻弧菌等弧菌的抑制作用也越大，且隨著五倍子提取物的濃度的提高，其對弧菌的抑制效果增大，呈線性關(guān)系。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)對五倍子提取物的提取率進(jìn)行了系統(tǒng)的研究，五倍子天然抗菌物質(zhì)的提取采用超聲輔助酸提取法，結(jié)果表明，鹽酸濃度、溶劑倍量、超聲波時間和超聲波頻率對五倍子提取物的提取量均有影響。最佳提取工藝條件為：1mol/L HCl、溶劑的溶解倍數(shù)為20倍、超聲波提取時間為20min 和頻率240W。

五倍子是一種天然的植物抑菌物質(zhì)，我們采用鹽酸溶解五倍子粉末，通過用探究到的最佳提取工藝條件，得到五倍子提取物，并考察了該提取物對供試的3種病原菌的抑菌效果，發(fā)現(xiàn)五倍子鹽酸提取物中的抑菌成分對供試的三種菌均有明顯的抑菌作用，最小的抑菌濃度分別為：副溶血弧菌0.0625 g/ml，創(chuàng)傷弧菌0.03125 g/ml，溶藻弧菌0.03125 g/ml。通過實(shí)驗(yàn)探究的抑菌效果，證明，在1mol/L HCl、溶劑的溶解倍數(shù)為20倍、超聲波提取時間為20min 和頻率240W的提取工藝條件下、在0-1g/ml 五倍子提取物的范圍內(nèi)，1 g/ml五倍子酸提取物對副溶血弧菌、溶藻弧菌、創(chuàng)傷弧菌的抑菌效果均為最佳。

本文初步考察了五倍子鹽酸提取物的提取工藝及其抑菌效果，而對于提取五倍子有效成分的最佳溶解劑（如水、醇等）還未得到確認(rèn)，因此，下一步工作將對提取五倍子有效成分的溶解劑進(jìn)行實(shí)驗(yàn)探究，并對比出最佳溶解劑，以期五倍子提取物能夠發(fā)揮更好的抑菌效果。

[1] 宋靖芳.中草藥對魚類病原氣單胞菌、弧菌的體外抑制作用研究[D].華南師范大學(xué)，2004.

[2] 邱慶連，潘清清，張友平，等.五倍子、烏梅等45種中草藥提取物對鋸緣青蟹致病弧菌的抑菌作用研究[J].浙江海洋學(xué)院學(xué)報（自然科學(xué)版），2010，（1）：34-38.

[3] 彭勇. 副溶血噬菌體的分離鑒定、裂解性能及其在副溶血弧菌的快速檢測中的初步應(yīng)用[D].中國海洋大學(xué)，2013.

[4] 李紅然，付大友，李艷清，等.超聲微波協(xié)同萃取-HPLC測定五倍子中的沒食子酸含量[J].化工時刊，2011，（1）：36-38，41.

[5] 金周浩.副溶血弧菌的分子檢測與基因分型研究[D].浙江工商大學(xué)，2008.

[6] 羅詞興，黃旭雄，李桑，等.溶藻弧菌感染后凡納濱對蝦鰓組織免疫相關(guān)基因的表達(dá)[J].中國水產(chǎn)科學(xué)，2014，（1）：189-196.