陳永霞 徐志偉 吳益?zhèn)?經(jīng)圣勇 郭 蘋*

（1.句容市動物疫病預(yù)防控制中心，江蘇句容 212400；2.江蘇丘陵地區(qū)鎮(zhèn)江農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，江蘇句容 212400；3.句容市郭莊畜牧獸醫(yī)站，江蘇句容 212431）

2017年4月，句容市郭莊鎮(zhèn)李福祥鵝場購進雛鵝2500只，上午9點運進育雛舍，下午5點發(fā)現(xiàn)死亡36只，原以為是運輸不當(dāng)，在飲水中加入青霉素、葡萄糖，任其自由飲水，第2d又死亡一百多只，又在飼料中加入諾氟沙星，雛鵝病狀未見好轉(zhuǎn)，到第3d早上，已出現(xiàn)癥狀雛鵝538只，發(fā)病率達到21.52%，臨床癥狀表現(xiàn)為精神沉郁，羽毛粗亂無光，伏地不愿走動，關(guān)節(jié)腫大，腳掌發(fā)燙，手輕觸摸皮膚有時會破皮。翅下有斑點出血，拉稀，眼瞼腫脹，眼半閉呈嗜睡狀態(tài)，有大量膿性分泌物玷污眼周，有些鵝鼻流黏液，頭頸高舉伸出，嘴張開，多數(shù)發(fā)病后1～3d死亡，為了確診本病，經(jīng)剖檢及細菌形態(tài)觀察、培養(yǎng)特性、生化及致病性鑒定等試驗，確定為金黃色葡萄球菌感染所致。

1 材料

1.1 病鵝

病理解剖病死鵝10只，瀕死鵝5只，分三個批次，A批4只，B批4只，C批7只。

1.2 培養(yǎng)基及試劑

麥康凱培養(yǎng)基、巧克力培養(yǎng)基、LB固體培養(yǎng)基、LB液體培養(yǎng)基（Takala）、氯化鈉、三氯甲烷、3%過氧化氫、藥敏紙片、氧化酶試劑、細菌微量生化發(fā)酵管、生理鹽水。

2 診斷方法

2.1 臨床診斷

2.1.1 病理解剖

對病死鵝、瀕死鵝進行解剖，檢查病鵝全身器官狀態(tài)找到病變部位觀察病變情況。

2.1.2 病原分離和培養(yǎng)

（1）細菌的初代分離

病料采集與培養(yǎng)[1]

①無菌環(huán)境下取病死鵝心血、肝臟、脾臟、腦；

②分別接種于麥康凱培養(yǎng)基37℃恒溫培養(yǎng)24h、巧克力培養(yǎng)基37℃恒溫培養(yǎng)24h、巧克力培養(yǎng)基37℃燭缸培養(yǎng)24h，觀察菌落形態(tài)；

③將不同形態(tài)的菌落在LB培養(yǎng)基上劃線接種，37℃培養(yǎng)24h，觀察細菌的培養(yǎng)特性。

（2）細菌鑒別制備血清[2]

①分別取8只未發(fā)病鵝，20只發(fā)病鵝的血樣，翅靜脈采血，每只采血樣2 ～3ml；

②37℃溫育1h，然后再自然放置4℃冰箱里過夜；

③析出血清后，將血清移到1ml小塑料離心管中，每管裝量不超過300μl，加一滴氯仿作防腐劑，緊蓋瓶塞，封口，編號并貼好標簽，4℃低溫保存。

平板凝集試驗[3]

①用無菌接種環(huán)取一環(huán)血清，置干凈載玻片一端，另一端取生理鹽水一環(huán)做對照；

②用無菌接種環(huán)釣取被檢細菌少許混勻于血清中，將接種環(huán)滅菌后冷卻，釣取被檢菌少許混勻于生理鹽水，經(jīng)10～30s后觀察是否出現(xiàn)肉眼可見的凝集塊；

③按同樣的方法依次檢測各血清與不同形態(tài)疑似菌是否出現(xiàn)凝集反應(yīng)，記錄陽性率，確定陽性菌。

2.2 實驗室診斷

2.2.1 生化試驗[4]

①將LB培養(yǎng)基上的純化菌落接種并穿刺明膠培養(yǎng)基，37℃培育24h，靜置冰箱30min，觀察其是否被細菌液化；

②挑取分離純化細菌接種乳糖、葡萄糖、麥芽糖、甘露醇、蔗糖微量發(fā)酵管中，置37℃溫箱培育24h觀察結(jié)果。

2.2.2 血漿凝固酶試驗[5]

無菌情況下，取肉湯培養(yǎng)物0.3ml和0.5ml兔血漿在試管中充分融合，置37℃培育，定期觀察是否生成凝塊，至少觀察6h，以內(nèi)容物完全凝固，使試管傾斜或倒置時不流動者為陽性。

3 結(jié)果與分析

3.1 病理變化

A批鵝，肝臟暗紅，有出血點，表面覆蓋有黃白色的纖維素性滲出物，心包膜增厚、心臟外包黃色纖維素性滲出物，見圖1-a。B批鵝，腹腔有難聞的腐敗氣味，肝臟腫大，呈紫紅色，腹腔積有少量膠凍狀黃色滲出物，2只鵝氣管內(nèi)黏液增多，見圖1-b、圖1-f。C批鵝，心包膜增厚，肝臟腫大、瘀血、暗紅色，有大量出血點，1只鵝氣囊膜混濁變厚，肺充血，有少量氣泡，見圖1-c、圖1-e。鏡檢肺部病灶，見圖1-d。

3.2 細菌鑒定

3.2.1 初代培養(yǎng)特性

A批鵝，麥康凱培養(yǎng)基不生長，巧克力培養(yǎng)基生長出光滑、圓形、邊緣整齊、針尖大小的暗灰色菌落，見圖2-a。B批鵝，麥康凱培養(yǎng)基不生長，巧克力培養(yǎng)基生長出三種菌落，且三種菌落均在腸道組織接種部位：XJY42呈圓形、凸起、表面光滑、濕潤、微帶淺黃色（菌3），XJY43呈圓形、光滑、濕潤、針尖大小菌落，有溶血現(xiàn)象（菌4），見圖2-b。C批鵝，麥康凱培養(yǎng)基不生長，巧克力培養(yǎng)基生長出光滑、圓形、邊緣整齊、針尖大小的灰白色菌落，見圖2-c。

圖1 病死鵝病理變化

圖2 菌落形態(tài)

3.2.2 凝集試驗

確定XJY42為陽性菌株。

3.3 生化試驗

XJY42能發(fā)酵葡萄糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖、甘露醇，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣[6]；血漿凝固酶試驗、過氧化氫酶試驗均陽性；可液化明膠（表1）。

表1 XJY42生化特性

3.4 藥物敏感試驗

3.4.1 藥敏試驗方法

對分離菌株進行藥敏試驗，采用紙片法：

①取一接種環(huán)被檢菌液，均勻涂在LB培養(yǎng)基上；

②稍干后用無菌鑷子貼上藥敏紙片，各紙片中心相距至少24mm，并用鑷子輕壓紙片使之緊貼瓊脂表面；

③37℃培育24h后測量抑菌圈直徑，根據(jù)抑菌圈直徑大小判定細菌對藥物的敏感性。

抗菌效果判定：

青霉素G對葡萄球菌的抑菌圈直徑≥29mm為敏感，≤28mm為不敏感；其他藥物抑菌圈直徑〉20mm為高敏，15～20mm為中敏，〈15mm為不敏感[7]。

3.4.2 實驗結(jié)果

XJY42對慶大霉素、阿莫西林、呋喃妥因、頭孢菌素VI、頭孢噻肟、奧復(fù)星、萬古霉素、氨芐西林高度敏感（表2）。

表2 不同抗生素對XJY42菌株藥敏試驗結(jié)果

經(jīng)病理變化分析、細菌鑒定、生化試驗等方法，鑒定為金黃色葡萄球菌感染。藥敏試驗結(jié)果表明，XJY42株對阿莫西林、頭孢菌素VI、氨芐西林等高度敏感。

4 治療與預(yù)防

4.1 治療方法

①20%阿莫西林，15-20kg飲水混入25g，連續(xù)3～5d；

②氨芐西林，每只雛鵝1萬單位，中鵝3萬～5萬單位，肌肉注射，每天3次。也可以10%氨芐西林拌料或飲水，50g氨芐西林拌料100kg或兌水80-150kg現(xiàn)配現(xiàn)用，每日兩次，連續(xù)3-5d；

③呋喃妥因，按0.01%～0.02%的比例拌料服用，每日一次，連續(xù)3～5d；

④妥布霉素針劑，0.3～1.1μg/ml，肌肉注射。

經(jīng)上述藥物綜合治療后，痊愈452只，治愈率達到84%。

4.2 預(yù)防措施

①一定要重視孵化室、種蛋及各種器材用具的衛(wèi)生問題，定期需要消毒殺菌，防止感染；

②剛出生的雛鵝需要服用抗菌藥預(yù)防感染，如用氨芐西林飲水，用量為1g藥物加2kg水，連用3d；

③飼料內(nèi)加入土霉素，按照0.1%的比例拌飼料，連用3-5d。

5 討論

金黃色葡萄球菌無處不在，作為常見病原，大部分存在于呼吸道里和皮膚表面上。金黃色葡萄球菌感染一年四季都可能發(fā)生，尤其是氣候多變季節(jié)和潮濕的下雨季節(jié)更為多發(fā)；各種年齡段的禽類都容易感染，但以幼禽[8]更加敏感，多見于40～80日齡中雛。

金黃色葡萄球菌是禽類化膿性感染中最為多見的病原菌，會導(dǎo)致各種感染，也可能引起肺炎、心包炎、偽膜性腸炎，甚至引起膿毒癥等全身感染。金黃色葡萄球菌是皮膚表面的常在菌，在大部分情況下是不會入侵體內(nèi)，但當(dāng)皮膚和黏膜受到損傷，如注射疫苗、網(wǎng)刺、刮傷等可成為本病發(fā)生的因素。

近年來各種實驗研究發(fā)現(xiàn)，金黃色葡萄球菌粘黏在黏膜表面是感染的最先要條件。細菌粘黏是細菌膜上的黏附素蛋白與機體內(nèi)胞外基質(zhì)（互相反應(yīng)作用的結(jié)果。雖然機體內(nèi)胞外基質(zhì)通常不暴露出來，但在組織受到破壞后，機體內(nèi)胞外基質(zhì)就暴露出來，金黃色葡萄球菌就會引起感染。

感染初期出現(xiàn)癥狀，體熱，關(guān)節(jié)腫脹，精神狀態(tài)低沉，不愿意動。發(fā)病初期食欲正常，之后食欲降低，瘦弱，最后因營養(yǎng)不良死亡。解剖檢驗可以看見關(guān)節(jié)處有漿性到干酪樣的滲出物；肝大，充血。鏡檢下可以看見關(guān)節(jié)滑膜纖維增生壞死；肝臟細胞病變壞死，血管周圍的單核細胞和易染性白細胞數(shù)量增加。

金黃色葡萄球菌所導(dǎo)致感染的疾病病死率高、耐藥性強，治療困難。植入疫苗是預(yù)防感染的方法，目前疫苗主要分為四種：以金黃色葡萄球菌全菌或部分菌體為疫苗、針對莢膜和黏附因子的疫苗、針對毒素和酶的疫苗、針對毒力因子的疫苗[9]。金黃色葡萄球菌為兼性厭氧菌，對于營養(yǎng)方面的需求不高，在普通培養(yǎng)基上就可以生長繁殖，革蘭氏陽性。

金黃色葡萄球菌的耐藥性逐日增強，所以應(yīng)該采集病樣快速分析出病菌種類，通過藥物敏感試驗后，選取最適宜的藥物，拌在飼料和日常飲用水中，對全部禽類進行治療，這是大量飼養(yǎng)禽類下發(fā)病之后的首要控制治療措施。金黃色葡萄球菌感染發(fā)病率與所在環(huán)境中球菌的含量成正比，病死鵝的排泄物加大了環(huán)境中金黃色葡萄球菌的含量，更加加速了病情的惡化。在飼養(yǎng)管理過程中，應(yīng)完善防疫設(shè)施，注意環(huán)境衛(wèi)生，并進行定期消毒。由于抗生素的大量使用，金黃色葡萄球菌出現(xiàn)大量耐藥菌株，特別是耐甲氧西林葡萄球菌的出現(xiàn)使得金黃色葡萄球菌成為世界感染頑疾之一。

微生物的檢測正向著更迅速、更簡單、更精確的趨勢發(fā)展，法國梅里埃公司和美國3M公司的2種快速鑒別金黃色葡萄球菌的培養(yǎng)基?？梢员热涨捌毡榈臋z測方式減短一半的時間，完全適合用在實驗室的快速檢測，尤其是在設(shè)施缺乏的實驗室中，更加能顯示出操作使用的方便性。聚合酶鏈式反應(yīng)法是檢測耐甲氧西林菌株的最適宜方法，雖然存在容易引起污染、假性陰性等困擾，但是因為可快捷擴增DNA片段和目的基因，因此在檢測行業(yè)有著不可小覷的實用價值。多種檢測方式[10]相互結(jié)合可以相較以往很大的提升檢測金黃色葡萄球菌的敏感度[11]，是檢測病菌的發(fā)展趨勢。

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[3] 姚火春.獸醫(yī)微生物學(xué)實驗指導(dǎo)[M].中國農(nóng)業(yè)出版社，2002：36-37.

[4] 廖延雄.獸醫(yī)微生物實驗室診斷手冊[M].中國農(nóng)業(yè)出版社，1995：81-93.

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[6] Buchanan R，Gibbons N.伯杰細菌鑒定手冊[M].科學(xué)出版社，1984：598-599，667-672.

[7] 羅君毅，程池.酶制劑抗菌活性檢測標準菌株的藥敏性分析[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2009，（1）：17-22.

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[11] 黃韜睿，李玉鋒，王鑫.PCR和ELISA在食源性致病菌檢測中的應(yīng)用[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2008，（9）：182-184.