安鳳秋，呂家瓏，刁 展，李海紅，趙琪琪

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，農(nóng)業(yè)部西北植物營(yíng)養(yǎng)與農(nóng)業(yè)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 楊凌 712100；2.西安工程大學(xué)環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院，西安 710048）

土壤是人類賴以生存的重要資源，近年來(lái)，我國(guó)土壤重金屬污染問(wèn)題日趨突出。大量研究表明，重金屬進(jìn)入土壤可改變土壤的微生物活性，使群落結(jié)構(gòu)及多樣性發(fā)生變化[2－5]。閻姝等[5]報(bào)道了重金屬污染的稻田土壤微生物量顯著下降，細(xì)菌和真菌脂肪酸（PLFA）變化幅度達(dá)到30%以上。Gough等[6]報(bào)道長(zhǎng)期受不同濃度重金屬污染的淡水沉積物中，土壤微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變和重建。Deng等[7]研究表明，重金屬污染可對(duì)農(nóng)田土壤根際微生物的群落結(jié)構(gòu)和多樣性產(chǎn)生顯著影響。

研究微生物群落結(jié)構(gòu)的方法主要有Biolog微平板法[10]、脂肪酸法[4，7]和 PCR變性梯度凝膠電泳（DGGE）[9－10]等，這些方法在靈敏度和精確度方面有一定的局限性。高通量DNA測(cè)序技術(shù)用于研究土壤微生物群落結(jié)構(gòu)在精確度和靈敏度方面較上述方法均有大幅度提高。Ye等[11]采用高通量測(cè)序技術(shù)研究了活性污泥和污水中的微生物群落結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示變形菌綱和熱孢菌綱相對(duì)豐度較高，污水中分支桿菌屬和弧菌屬是優(yōu)勢(shì)菌群。目前高通量測(cè)序技術(shù)大多用于研究污泥、廢水、尾礦及森林等生態(tài)系統(tǒng)的微生物群落組成變化[11－13]，對(duì)重金屬污染土壤的細(xì)菌群落組成相關(guān)內(nèi)容的報(bào)道較少，有少數(shù)研究以重金屬?gòu)?fù)合污染和實(shí)驗(yàn)室模擬污染土壤為研究對(duì)象[14－15]，探討了重金屬污染對(duì)土壤微生物群落的影響。目前，采用高通量技術(shù)對(duì)鉛污染的塿土農(nóng)田土壤細(xì)菌群落組成變化的研究還很有限。

鑒于此，本試驗(yàn)采用高通量技術(shù)研究鉛對(duì)塿土細(xì)菌群落組成的影響，揭示土壤理化性質(zhì)與細(xì)菌群落組成之間的關(guān)系，為重金屬污染土壤的早期預(yù)警和生物修復(fù)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究地點(diǎn)及試驗(yàn)設(shè)計(jì)

田間試驗(yàn)地位于陜西省楊凌示范區(qū)五泉鎮(zhèn)（34°17′51″N，108°00′48″E）國(guó)家黃土肥力和肥料效益監(jiān)測(cè)基地，該基地海拔524.7 m，年平均氣溫約13℃，年平均降水量為585 mm。供試土壤屬褐土類塿土亞類，紅油土屬，厚層紅油土種（土墊旱耕人為土），黃土母質(zhì)。該試驗(yàn)地周圍為農(nóng)田，無(wú)工業(yè)企業(yè)分布。

試驗(yàn)設(shè)3個(gè)處理，每處理3個(gè)重復(fù)，分別為對(duì)照（WCK）、低鉛處理（WLOW）、高鉛處理（WHIGH）。低鉛處理添加 Pb（NO3）2濃度為 175 mg·kg－1；高鉛處理添加Pb（NO3）2濃度為 350 mg·kg－1；對(duì)照不添加 Pb（NO3）2溶液。共9個(gè)小區(qū)，每個(gè)小區(qū)長(zhǎng)2 m，寬1 m，小區(qū)之間設(shè)寬度為0.5 m的隔離行，并在每個(gè)小區(qū)四周埋設(shè)深度為0.5 m水泥隔板。于2010年6月3日將對(duì)應(yīng)濃度Pb（NO3）2溶液添加至相應(yīng)小區(qū)耕層中，對(duì)照組添加等體積的水，通過(guò)人工耕翻使0～20 cm表層土壤混合均勻；土壤含水量為田間持水量的80%，老化。之后，在小區(qū)實(shí)施小麥－玉米輪作。小麥、玉米品種分別為小偃22和陜單16。試驗(yàn)前在小區(qū)土壤中施氮磷鉀底肥，底肥用量：尿素 0.15 g·kg－1；Ca（H2PO4）20.05 g·kg－1；K2SO40.10 g·kg－1。

2013年12月，采用“梅花”5點(diǎn)取樣法，用土鉆采集土壤樣品，取樣深度為0～20 cm，每個(gè)小區(qū)采集土樣約0.5 kg，將土樣充分混勻后去除植物殘?bào)w及石礫，取其中約0.1 kg裝入滅菌的自封袋中，置冰盒中迅速帶回實(shí)驗(yàn)室，過(guò)2 mm篩后保存于－80℃冰箱中進(jìn)行分子生物學(xué)分析；其余土樣裝入自封袋中帶回實(shí)驗(yàn)室，室溫下自然風(fēng)干，過(guò)篩后測(cè)定土壤基本理化性質(zhì)及重金屬含量。

1.2 樣品分析

土壤pH值測(cè)定的土水比（質(zhì)量∶體積）為1∶2.5；土壤有機(jī)質(zhì)的測(cè)定采用重鉻酸鉀外加熱法；速效鉀的測(cè)定用火焰光度法；速效磷采用0.5 mol·L－1的NaHCO3浸提、鉬銻抗比色分光光度法測(cè)定；堿解氮采用堿解擴(kuò)散法測(cè)定，上述方法均參照鮑士旦[16]的分析方法。

鉛全量采用 HNO3－HCl－HClO4消解火焰原子吸收（PE，AA800，美國(guó)）光譜法測(cè)定[16]，有效態(tài)鉛（APb）采用 EDTA 浸提[17]ICP－MS（Thermo，XseriesⅡ，美國(guó)）測(cè)定，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)，取其平均值計(jì)算每個(gè)處理的相關(guān)指標(biāo)。

1.3 DNA提取、PCR擴(kuò)增和測(cè)序

采用DNA試劑盒提取土壤總DNA，型號(hào)為FastDNARspin kit（MP bio，Santa Ana，美國(guó)）。DNA濃度和質(zhì)量采用超微量核酸蛋白測(cè)定儀檢測(cè)（Thermo，NanoDrop ND 2000，美國(guó)），將符合試驗(yàn)要求的DNA送深圳華大基因公司擴(kuò)增，通過(guò)Illumina MiSeq平臺(tái)完成高通量測(cè)序。PCR擴(kuò)增采用16S rDNA基因V4區(qū)的通用引物 515F（5′－GTG CCA GCM GCC GCG GTAA－3′）和 806R（5′－GGA CTA CHV GGG TWT CTA AT－3′）。PCR反應(yīng)條件如下，預(yù)變性：95℃保持3 min；變性：95 ℃保持 30 s；退火：56 ℃保持 30 s；延伸：72℃保持45 s，共30個(gè)循環(huán)；72℃延伸20 min。序列平均長(zhǎng)度253 bp，已提交NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)，序列號(hào)SRP075183。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Mothur（V.1.36.1）過(guò)濾數(shù)據(jù)，獲得高質(zhì)量的優(yōu)化序列，利用軟件USEARCH（v7.0.1090）在97%相似度下進(jìn)行聚類得到可操作分類單元（OTU）的代表序列；通過(guò)RDP classifer（v2.2）軟件將OTU代表序列與數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)進(jìn)行物種注釋，統(tǒng)計(jì)每個(gè)樣品在每個(gè)OTU中的豐度信息。

采用SPSS 22.0軟件對(duì)樣品的土壤基本理化性質(zhì)、細(xì)菌豐度與多樣性指數(shù)、組間差異物種進(jìn)行單因素方差分析（LSD法）和斯皮爾曼（Spearman）相關(guān)性分析。應(yīng)用CANOCO 4.5軟件對(duì)環(huán)境因素和細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行冗余分析（RDA）。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤性質(zhì)

土壤理化性質(zhì)和鉛含量見(jiàn)表1。3個(gè)處理的土壤含水量、有機(jī)質(zhì)、速效磷、速效鉀、有效態(tài)鉛和總鉛含量有顯著差異（P＜0.05），pH和堿解氮含量無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

1.2.1 儀器 使用GE-VolusonE8型彩色多普勒超聲診斷儀(GE，美國(guó))，陰道探頭RIC5-9-D，頻率5～9 MHz，常規(guī)腹部探頭4C-D，頻率1.7～6.2 MHz，經(jīng)腹三維容積探頭RA B4-8-D，占用率2.4～5.8 MHz。檢查中保持每例患者參數(shù)設(shè)定一致。宮腔鏡為Olympas 4.5 cm、6.5 cm連續(xù)灌流宮腔鏡(Olympas，日本)。

2.2 土壤細(xì)菌群落組成

9個(gè)土壤樣品高通量測(cè)序共得到153 653條高質(zhì)量序列，平均每個(gè)樣品獲得17 073條序列。以97%相似度劃分共得到14 414個(gè)OTU，樣品中OTU數(shù)目范圍為1574～1652，平均每個(gè)樣品中有1601個(gè)OTU。

表2為3個(gè)處理的序列數(shù)及多樣性指數(shù)。方差分析結(jié)果顯示：WCK與WHIGH處理的序列數(shù)有顯著性差異（P＜0.05）；WLOW和WHIGH處理的豐富度指數(shù)（Chao和 ACE）具有顯著性差異（P＜0.05），且WLOW處理的豐富度指數(shù)大于WHIGH處理的相應(yīng)值，說(shuō)明WLOW處理的細(xì)菌群落豐富度高于WHIGH；比較多樣性指數(shù)（Shannon和 Simpson），WCK、WLOW 和WHIGH處理之間均無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。

在97%的OTU相似度下，3個(gè)處理共得到2582個(gè)OTU（圖1），其中WCK和WLOW處理共有1822個(gè)OTU，WCK和WHIGH處理共有1796個(gè)OTU，WLOW和WHIGH處理共有1814個(gè)OTU，其中1697個(gè)OTU為3個(gè)處理共有，且WHIGH處理特有OTU數(shù)為204個(gè)，高于WCK和WLOW處理。

表1 土壤理化性質(zhì)和鉛含量Table1 Characteristics of soil samples and lead content

表2 不同處理間土壤細(xì)菌豐度與多樣性指數(shù)Table2 Soil bacterial abundance and diversity indices between different treatments

圖1 3個(gè)處理的Venn圖（OTUS0.03）Figure1 Venn diagram shared bacterial OTU among three treatments（OTUS0.03）

2.3 細(xì)菌群落組成

2.3.1 門水平上的群落組成

3個(gè)處理的細(xì)菌群落組成大體相似，分別屬于27個(gè)門，31個(gè)綱，39個(gè)目，43個(gè)科，13個(gè)屬，但各種細(xì)菌所占比例略有差異。如圖2所示：變形菌門（Proteobacteria，平均相對(duì)豐度為25%）為最主要優(yōu)勢(shì)菌群，第二優(yōu)勢(shì)菌為放線菌門（Actinobacteria，平均相對(duì)豐度為18.60%），其他相對(duì)豐度較高的菌群有：酸桿菌門（Acidobacteria，平均相對(duì)豐度為17.82%），擬桿菌門（Bacteroidetes，平均相對(duì)豐度為12.04%），綠彎菌門（Chloroflexi，平均相對(duì)豐度為5.84%），浮霉菌門（Planctomycetes，平均相對(duì)豐度為5.27%），厚壁菌門（Firmicutes，平均相對(duì)豐度為5.22%）和芽單胞菌門（Gemmatimonadetes，平均相對(duì)豐度達(dá)3.59%）。放線菌門（Actinobacteria）在 WHIGH處理中含量略高于WLOW 和 WCK處理，酸桿菌門（Acidobacteria）在WLOW處理中的含量略高于WCK和WHIGH處理，其余菌群在3個(gè)處理中差別不大。

2.3.2 綱水平上的群落組成

2.3.3 目水平上的群落組成

目分類水平上共得到39個(gè)菌群，放線菌目（Actinomycetales，平均相對(duì)豐度為9.74%）是優(yōu)勢(shì)菌群，相對(duì)豐度大于3%的菌群還有：藍(lán)藻菌目（Cytophagales），Saprospirales目，乳酸桿菌目（Lactobacillales），鞘脂單胞菌目（Sphingomonadales）。WHIGH處理中的放線菌目（Actinomycetales）和藍(lán)藻菌目（Cytopha gales）相對(duì)豐度在3個(gè)處理中最高。

圖2 細(xì)菌在門水平上的群落結(jié)構(gòu)組成Figure2 The taxonomic composition distribution in samples of phylum－level

圖3 細(xì)菌在屬水平上的群落組成結(jié)構(gòu)Figure3 The taxonomic composition distribution in samples of genus－level

2.3.4 屬水平上的群落組成

屬分類水平上共得到15個(gè)菌群（圖3），未分類菌群平均相對(duì)豐度達(dá)77%，表明土壤中存在大量新類群。相對(duì)豐度小于0.5%歸為其他種類的菌群達(dá)8.65%。乳球菌屬（Lactococcus）是優(yōu)勢(shì)菌群，且在WCK處理中的相對(duì)豐度居3個(gè)處理之首。

對(duì)3個(gè)處理的OTU進(jìn)行PCA分析（圖4），第一主軸和第二主軸的貢獻(xiàn)率分別為15.64%和15.09%。WCK和WLOW處理均處于主軸下方，距離較近，表明兩者土壤中細(xì)菌的OTU組成相近，WHIGH距WCK和WLOW處理較遠(yuǎn)，表明其細(xì)菌在OTU水平上的群落組成與WCK和WLOW處理差異較大。

圖4 不同濃度處理下的土壤細(xì)菌OTU主成分分析Figure4 Principal component analysis（PCA）of OUT in soil bacterial among three treatments

2.4 組間差異物種分析

在屬分類水平上對(duì)3個(gè)處理進(jìn)行一維方差分析，結(jié)果如圖5所示。3個(gè)處理間共有9個(gè)屬具有顯著性差異（P＜0.05），除假單胞菌屬（Pseudomonas）和紅弧菌屬（Skemanella）相對(duì)豐度較高外，其余7個(gè)屬的相對(duì)豐度較低（＜0.3%）；WHIGH和WCK處理相比，3個(gè)屬有顯著差異（P＜0.05），分別是：假單胞菌屬（Pseudomonas），紅弧菌屬（Skemanella）和水棲菌屬（Enhydrobacter）；WLOW 和 WCK 處理相比，水棲菌屬（Enhydrobacter）、Lacibacter和貪噬菌屬（Variovorax）具有顯著差異（P＜0.05）；WHIGH與WLOW處理之間有5個(gè)屬具有顯著差異（P＜0.05），分別是：Balneimonas、壤霉菌屬（Agromyces）、水棲菌屬（Enhydrobacter）、Devosia和 Flavihumibacter。水棲菌屬（Enhydrobacter）在3個(gè)處理間差異均顯著；壤霉菌屬（Agromyces）和Devosia在WHIGH處理中的相對(duì)豐度大于WLOW和WCK處理，這兩個(gè)屬分別屬于放線菌門（Actinobacteria）和變形菌門（Proteobacteria）。3個(gè)處理在屬分類水平上呈現(xiàn)較多的低豐度差異顯著物種，WHIGH和WCK處理差異物種較多。

2.5 細(xì)菌群落與土壤性質(zhì)的關(guān)系

細(xì)菌OTU水平群落組成與土壤性質(zhì)冗余分析（RDA）如圖6所示。不同處理下第一主軸和第二主軸對(duì)細(xì)菌群落相對(duì)豐度方差的解釋比例分別為14.5%和14.4%，兩者共解釋28.9%的方差變化。有效態(tài)鉛和總鉛含量、土壤有機(jī)質(zhì)、速效磷和含水量與土壤細(xì)菌OTU水平群落組成相關(guān)性較大。其中，有效態(tài)鉛和總鉛含量與WHIGH（Pb21W/Pb22W）處理的細(xì)菌OTU水平群落組成具有較強(qiáng)的正相關(guān)性，而與WCK（CK1W/CK2W/CK3W）和 WLOW（Pb11W/Pb12W）處理的細(xì)菌OTU水平群落組成呈較強(qiáng)負(fù)相關(guān)，WCK（CK1W/CK2W）處理的細(xì)菌OTU水平群落組成還與土壤有機(jī)質(zhì)含量呈正相關(guān)。

圖5 屬分類水平上具有顯著性差異的物種分析Figure5 Analysis of significant differences at the genus－level

圖6 不同鉛濃度處理下土壤細(xì)菌群落與土壤理化指標(biāo)的冗余分析Figure6 Redundancy analysis（RDA）of the relationship between the structure of soil microbial communities（relative abundances of OTUs）and environmental variables

在門分類上對(duì)菌群（相對(duì)豐度＞5%）進(jìn)行Spearman相關(guān)性分析，結(jié)果如表3所示。有5種細(xì)菌與環(huán)境因素顯著相關(guān)，厚壁菌門（Firmicutes）與含水量顯著正相關(guān)，與速效鉀、有效態(tài)鉛和總鉛含量顯著負(fù)相關(guān)，芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）與速效鉀含量顯著負(fù)相關(guān)，疣微菌門（Verrucomicrobia）與pH顯著負(fù)相關(guān)；速效磷、有效態(tài)鉛和總鉛含量與綠彎菌門（Chloroflexi）和硝化螺旋菌門（Nitrospirae）顯著正相關(guān)，而硝化螺旋菌門（Nitrospirae）與含水量顯著負(fù)相關(guān)。

表3 門分類水平上細(xì)菌群落與土壤性質(zhì)的Spearman分析（相對(duì)豐度＞0.5%）Table3 Spearman′s rank correlations between abundant taxa of phylum－level（RA＞0.5%in all samples combined）and soil properties

3 討論

3.1 土壤鉛處理對(duì)細(xì)菌群落組成的影響

土壤受重金屬污染后，微生物群落組成可發(fā)生明顯變化[2，5，18]，但這種影響因土壤類型、重金屬污染劑量和污染周期長(zhǎng)短而異[10，14，19]。Niklińska 等[19]報(bào)道長(zhǎng)期受重金屬污染的森林土壤微生物群落組成變化不大。本研究的PCA分析顯示W(wǎng)CK和WLOW處理的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)主成分相似，但WHIGH處理與二者有差異；通過(guò)對(duì)比豐富度指數(shù)（Chao和ACE），也顯示出WLOW和WCK處理之間無(wú)顯著差異，但WLOW與WHIGH處理之間呈顯著差異；WHIGH處理的Shannons指數(shù)略高于WLOW和WCK處理的相應(yīng)值，其特有的OTU數(shù)為204個(gè)（圖1），因此WHIGH處理細(xì)菌群落多樣性略高于WLOW和WCK處理。Golebiewski等[14]報(bào)道重金屬污染的土壤樣品在門和綱的分類水平上不能充分表現(xiàn)出微生物群落變化，需要更低的分類單元描述微生物群落變化，本文在門分類水平上，細(xì)菌群落組成除放線菌門（Actinobacteria）和酸桿菌門（Acidobacteria）在三個(gè)處理間略有差異外，其余類群在3個(gè)處理間大體相似，這與Golebiewski等結(jié)論相似；而在屬分類水平上，不同處理間才呈現(xiàn)出較多的差異顯著物種（圖5）；且WHIGH與WLOW具有顯著差異的屬達(dá)5種（P＜0.05），均為低豐度物種（相對(duì)豐度＜0.3%），可見(jiàn)本文細(xì)菌群落組成的變化主要體現(xiàn)在低豐度菌群發(fā)生了顯著改變。這也表明高通量技術(shù)比常規(guī)方法具有更高的靈敏度，能夠探測(cè)到微生物群落結(jié)構(gòu)的細(xì)微變化。

一定程度的重金屬污染能改變?cè)腥郝鋬?nèi)部種群之間的競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，導(dǎo)致優(yōu)勢(shì)種群的變更或者產(chǎn)生一部分對(duì)重金屬有抗性的微生物，從而使土壤微生物群落多樣性增加[20]。有文獻(xiàn)報(bào)道放線菌是PAHs和重金屬Pb、Cu和Zn污染土壤中的優(yōu)勢(shì)菌群[21]。本文在門、綱和目的分類單元下，放線菌均為優(yōu)勢(shì)菌群，其在WHIGH處理的相對(duì)豐度高于WLOW和WCK處理，該結(jié)果與前人研究結(jié)論一致。本文WHIGH處理的β－變形菌綱（Betaproteobacteria）和藍(lán)藻菌綱（Cytophagia）相對(duì)豐度均高于WLOW和WCK處理。變形菌門（Proteobacteria）是重金屬污染土壤中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌，可能與其降解代謝及生境廣泛有關(guān)[15，22－23]，藍(lán)藻菌綱（Cytophagia）通常用于處理重金屬污染的水體，其可在細(xì)胞壁外分泌胞外多糖，從而螯合污染物中的重金屬離子[24－25]。WHIGH比WLOW和WCK處理中含有更多的抗性菌，這也可能是WHIGH處理多樣性豐富的原因之一。本文抗性菌群的解毒機(jī)制有待于今后深入研究。

3.2 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與土壤性質(zhì)之間的關(guān)系

RDA結(jié)果顯示，有效態(tài)鉛和總鉛含量與WHIGH處理的細(xì)菌OTU水平群落組成具有較強(qiáng)的正相關(guān)性，與WCK和WLOW處理的細(xì)菌OTU水平群落組呈負(fù)相關(guān)，此結(jié)果進(jìn)一步印證了WHIGH處理含有較多的抗逆菌群。WCK處理的細(xì)菌OTU水平群落組成與有機(jī)質(zhì)正相關(guān)，有機(jī)質(zhì)可改變土壤孔隙度、通氣度與土壤團(tuán)粒，具有顯著的緩沖作用和持水力，可為土壤細(xì)菌提供適宜的生長(zhǎng)環(huán)境[26]。Spearman分析結(jié)果顯示，土壤pH值、含水量、重金屬含量及速效磷、有效鉀均與相應(yīng)的微生物類群有相關(guān)性。土壤pH值和含水量主要影響土壤理化反應(yīng)，從而影響微生物的微生態(tài)生存環(huán)境，微生物的生長(zhǎng)代謝產(chǎn)生一定的化學(xué)物質(zhì)反過(guò)來(lái)又影響了土壤中化學(xué)物質(zhì)的存在形態(tài)和濃度[27－28]。

外源鉛進(jìn)入土壤后受各種物理、化學(xué)作用的影響，總體上是由不穩(wěn)定態(tài)向穩(wěn)定態(tài)轉(zhuǎn)變，活性和毒性呈降低趨勢(shì)[29]。與嚴(yán)重重金屬污染土壤，如礦區(qū)土壤相比，本試驗(yàn)所添加的重金屬含量屬于中低等水平，且添加鉛已長(zhǎng)達(dá)3年，雖然3個(gè)處理間的鉛用量有差異，但并未引起土壤中的細(xì)菌群落組成發(fā)生顯著的劑量效應(yīng)，此結(jié)論與夏月等[20]結(jié)論較一致。本文細(xì)菌群落組成未發(fā)生顯著的劑量效應(yīng)，可能是由于地上部分有作物種植，依據(jù)本實(shí)驗(yàn)室前期的研究結(jié)果，地上部分種植的作物對(duì)土壤中的重金屬有不同程度的吸收作用[30]；還有可能是因?yàn)樵谥亟饘儆绊懴?，根際環(huán)境中的pH值、Eh值、根系分泌物也發(fā)生了變化，根分泌的粘膠物質(zhì)與根際中的Pb2+、Cu2+、Cd2+等重金屬離子絡(luò)合，形成穩(wěn)定的螯合體，將污染物固定在土壤中，進(jìn)而影響到重金屬在土壤－植物－微生物中的遷移轉(zhuǎn)化行為[7，31]，使重金屬生物可利用毒性降低，從而對(duì)土壤微生物群落多樣性的影響減小，但具體機(jī)制還有待于今后更加深入地研究。本文3個(gè)處理間的土壤細(xì)菌群落組成有差異，重金屬鉛應(yīng)該是造成這個(gè)差異的主要因素，土壤環(huán)境因素對(duì)細(xì)菌菌群的改變也產(chǎn)生了一定程度的影響。由于本文添加外源鉛濃度較低且經(jīng)過(guò)了較長(zhǎng)的周期，土壤微生物可通過(guò)改變其群落組成來(lái)修復(fù)自然界中較低濃度的重金屬污染，為今后深入研究微生物修復(fù)提供了理論依據(jù)。

4 結(jié)論

（1）對(duì)照和低鉛處理的OTU組成較相似，而高鉛處理的OTU與前二者差異較大。變形菌門（Proteobacteria，25%）和放線菌門（Actinobacteria，18.60%）在3個(gè)處理中均為優(yōu)勢(shì)菌群，相對(duì)豐度較高的菌群還有酸桿菌門（Acidobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、綠彎菌門（Chloroflexi）和浮霉菌門（Planctomycetes）；放線菌綱（Actinobacteria）、β－變形菌綱（Betaproteobacteria）和藍(lán)藻菌綱（Cytophagia）在高鉛處理中相對(duì)豐度最高。

（2）在屬分類水平上具顯著差異的菌群有9個(gè)（P＜0.05），除假單胞菌屬（Pseudomonas）和紅弧菌屬（Skemanella）外（相對(duì)豐度＞0.6%），Balneimonas、壤霉菌屬（Agromyces）、水棲菌屬（Enhydrobacter）、Devosia、貪噬菌屬（Variovorax）、Flavihumibacter和 Lacibacter均為低豐度菌群（相對(duì)豐度＜0.3%）。

（3）土壤有效鉛和總鉛含量與高鉛處理的細(xì)菌OTU水平群落組呈正相關(guān)，而與對(duì)照和低鉛處理的細(xì)菌OTU水平群落組呈負(fù)相關(guān)；對(duì)照的細(xì)菌OTU水平群落組成與土壤有機(jī)質(zhì)含量正相關(guān)。在門分類水平上，厚壁菌門（Firmicutes）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）、疣微菌門（Verrucomicrobia）、綠彎菌門（Chloroflexi）和硝化螺旋菌門（Nitrospirae）與土壤環(huán)境因素顯著相關(guān)（P＜0.05）。

[1]陳興蘭,楊成波.土壤重金屬污染、生態(tài)效應(yīng)及植物修復(fù)技術(shù)[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境與發(fā)展,2010,27（3）：58－62.

CHEN Xing－lan,YANG Cheng－bo.The study of ecological benefits,soil contamination by heavy metals and the phytoremediation technique[J].Agro-Environment&Development,2010,27（3）：58－62.

[2]吳建軍,蔣艷梅,吳愉萍,等.重金屬?gòu)?fù)合污染對(duì)水稻土微生物生物量和群落結(jié)構(gòu)的影響[J].土壤學(xué)報(bào),2008,45（6）：1102－1109.

WU Jian－jun,JIANG Yan－mei,WU Yu－ping,et al.Effect of complex heavy metal pollution on biomass and community structure of soil microbes in paddy soil[J].Acta Pedologica Sinica,2008,45（6）：1102－1109.

[3]陳承利.重金屬Cd、Pb、Hg污染對(duì)土壤微生物及其活性影響研究[D].杭州：浙江大學(xué),2006：2－3.

CHEN Cheng－li.Effects of cadmium,lead and mercury pollution on soil microorganisms and their activities[D].Hangzhou：Zhejiang University,2006：2－3.

[4]曾路生,廖 敏,黃昌勇,等.外源鉛對(duì)水稻土微生物量、微生物活性及水稻生長(zhǎng)的影響[J].生態(tài)環(huán)境,2008,17（3）：993－998.

ZENG Lu－sheng,LIAO Min,HUANG Chang－yong,et al.Effects of lead contamination on soil microbial biomass,microbial activities and rice growth in paddy soils[J].Ecology and Environment,2008,17（3）：993－998.

[5]閻 姝,潘根興,李戀卿.重金屬污染降低水稻土微生物商并改變PLFA群落結(jié)構(gòu)：蘇南某地污染稻田的案例研究[J].生態(tài)環(huán)境,2008,17（5）：1828－1832.

YAN Shu,PAN Gen－xing,LI Lian－qing.Decline of microbial biomass quotient and change in microbial PLFA community structure of a rice paddy soil under heavy metal pollution：A case study of a polluted rice paddy from southern Jiangsu,China[J].Ecology and Environment,2008,17（5）：1828－1832.

[6]Gough H L,Stahl D A.Microbial community structures in anoxic fresh－water lake sediment along a metal contamination gradient[J].The ISME Journal,2011,5（3）：543-558.

[7]Deng L J,Zeng G M,Fan C Z,et al.Response of rhizosphere microbial community structure and diversity to heavy metal co-pollution in arable soil[J].Applied Microbiology&Biotechnology,2015,99（19）：8259-8269.

[8]張 紅,呂家瓏,曹瑩菲,等.不同植物秸稈腐解特性與土壤微生物功能多樣性研究[J].土壤學(xué)報(bào),2014,51（4）：743-752.

ZHANG Hong,Lü Jia-long,CAO Ying-fei,et al.Decomposition characteristics of different plants straws and soil microbial functional diversity[J].Acta Pedologica Sinica,2014,51（4）：743-752.

[9]Pan J,Yu L.Effects of Cd or/and Pb on soil enzyme activities and microbial community structure[J].Ecological Engineering,2011,37（11）：1889-1894.

[10]Shi W,Becker J,Bischoff M,et al.Association of microbial community composition and activity with lead,chromium,and hydrocarbon contamination[J].Applied and Environmental Microbiology,2002,68（8）：3859-3866.

[11]Ye L,Zhang T.Bacterial communities in different sections of a municipal wastewater treatment plant revealed by 16S rDNA 454 pyrosequencing[J].Appl Microbiol Biotechnol,2013,97（6）：2681-2690.

[12]Epelde L,Lanzén A,Blanco F,et al.Adaptation of soil microbial community structure and function to chronic metal contamination at an abandoned Pb-Zn mine[J].Fems Microbiology Ecology,2015,91（1）：1-11.

[13]Frey B,Stemmer M,Widmer F,et al.Microbial activity and community structure of a soil after heavy metal contamination in a model forest ecosystem[J].Soil Biology&Biochemistry,2006,38（7）：1745-1756.

[14]Golebiewski M,Deja-Sikora E,Cichosz M,et al.16S rDNA pyrosequencing analysis of bacterial community in heavy metals polluted soils[J].Microbial Ecology,2014,67（3）：635-647.

[15]丁傳雨,鄭 遠(yuǎn),任學(xué)敏,等.能源植物修復(fù)土壤鎘污染過(guò)程中細(xì)菌群落分析[J].環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào),2016,36（8）：3009-3016.

DING Chuan-yu,ZHENG Yuan,REN Xue-min,et al.Changes in bacterial community composition during the remediation of Cd contaminated soils of bioenergy crops[J].Acta Scientiae Circumstantiae,2016,36（8）：3009-3016.

[16]鮑士旦.土壤農(nóng)化分析[M].三版.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社,2000：22-107.

BAO Shi-dan.Soil and agricultural chemistry analysis[M].3rd Edition.Beijing：Agriculture Publication,2000：22-107.

[17]Smith C J,Hopmans P,Cook F J.Accumulation of Cr,Pb,Cu,Ni,Zn and Cd in soil following irrigation with treated urban effluent in Australia[J].Environmental Pollution,1996,94（3）：317-323.

[18]Chen J,He F,Zhang X,et al.Heavy metal pollution decreases microbial abundance,diversity and activity within particle-size fractions of a paddy soil[J].Fems Microbiology Ecology,2014,87（1）：164-181.

[19]Niklińska M,Chodak M,Laskowski R.Characterization of the forest humus microbial community in a heavy metal polluted area[J].Soil Biology&Biochemistry,2005,37（12）：2185-2194.

[20]夏 月,Sardar Khan,賀紀(jì)正,等.限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析（ARDRA）方法對(duì)重金屬污染土壤中細(xì)菌群落多樣性的研究[J].環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào),2007,27（6）：953-960.

XIA Yue,Sardar Khan,HE Ji-zheng,et al.Use of amplified ribosomal DNA restriction analysis to study microbial diversity in soils impacted by heavy metals[J].Acta Scientiae Circumstantiae,2007,27（6）：953-960.

[21]Bamborough L,Cummings S P.The impact of increasing heavy metal stress on the diversity and structure of the bacterial and actinobacterial communities of metallophytic grassland soil[J].Biology&Fertility of Soils,2009,45（3）：273-280.

[22]Kuppusamy S,Thavamani P,Megharaj M,et al.Pyrosequencing analysis of bacterial diversity in soils contaminated long-term with PAHs and heavy metals：Implications to bioremediation[J].Journal of Hazardous Materials,2016,317：169-179.

[23]江玉梅,張 晨,黃小蘭,等.重金屬污染對(duì)鄱陽(yáng)湖底泥微生物群落結(jié)構(gòu)的影響[J].中國(guó)環(huán)境科學(xué),2016,36（11）：3475-3486.

JIANG Yu-mei,ZHANG Chen,HUANG Xiao-lan,et al.Effect of heavy metals in the sediment of Poyang Lake estuary on microbial communities structure base on Mi-seq sequencing[J].China Environmental Science,2016,36（11）：3475-3486.

[24]El-Enany A E,Issa A A.Cyanobacteria as a biosorbent of heavy metals in sewage water[J].Environmental Toxicology&Pharmacology,2000,8（2）：95-101.

[25]Philippis R D,Colica G,Micheletti E.Exopolysaccharide-producing cyanobacteria in heavy metal removal from water：Molecular basis and practical applicability of the biosorption process[J].Applied Microbiology&Biotechnology,2011,92（4）：697-708.

[26]王佩雯,朱金峰,陳 征,等.高通量測(cè)序技術(shù)下連作植煙土壤細(xì)菌群落與土壤環(huán)境因子的耦合分析[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào),2016,24（11）：1754-1763.

WANG Pei-wen,ZHU Jin-feng,CHEN Zheng,et al.Coupling analysis based on high throughput sequencing technology of soil bacterial community and soil environmental factors in continuous cropping tobacco soil[J].Journal of Agricultural Biotechnology,2016,24（11）：1754-1763.

[27]Lauber C L,Hamady M,Knight R,et al.Pyrosequencing-based assessment of soil pH as a predictor of soil bacterial community structure at the continental scale[J].Applied&Environmental Microbiology,2009,75（15）：5111-5120.

[28]Kemmitt S J,Lanyon C V,Waite I S,et al.Mineralization of native soil organic matter is not regulated by the size,activity or composition of the soil microbial biomass：A new perspective[J].Soil Biology&Biochemistry,2008,40（1）：61-73.

[29]徐明崗,吳 曼,武海雯,等.土壤外源鉛的穩(wěn)定化特征及其對(duì)土壤性質(zhì)的響應(yīng)[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào),2012,31（9）：1702-1709.

XU Ming-gang,WU Man,WU Hai-wen,et al.External lead stabilization characteristics in soils and responses to soil properties[J].Journal of Agro-Environment Science,2012,31（9）：1702-1709.

[30]Liu K,Lv J L,Dai Y C,et al.Cross-species extrapolation of models for predicting lead transfer from soil to wheat grain[J].PLos One,2016,11（8）：e0160552.

[31]徐衛(wèi)紅,黃 河,王愛(ài)華,等.根系分泌物對(duì)土壤重金屬活化及其機(jī)理研究進(jìn)展[J].生態(tài)環(huán)境,2006,15（1）：184-189.

XU Wei-hong,HUANG He,WANG Ai-hua,et al.Advance in studies on activation of heavy metal by root exudates and mechanism[J].Ecology and Environment,2006,15（1）：184-189.