胡金山，田安然，耿金鵬*，隋 麗，展 永

(1.河北工業(yè)大學生物物理研究所，天津300401;2.華北理工大學 化學工程學院，河北 唐山063210;3.中國原子能科學研究院，北京102413)

玉米(Zea mays L.)原產(chǎn)自南美洲，為1年生禾本科草本植物，是目前全世界產(chǎn)量最高的三大糧食作物之一，其籽粒以黃、白兩色為主。玉米素有長壽食品的美稱，含有豐富的蛋白質(zhì)、氨基酸、脂肪酸、維生素、纖維素以及多糖等，經(jīng)常食用能夠預防動脈粥樣硬化、心腦血管疾病、高膽固醇血癥的發(fā)生［1］。玉米不僅作為糧食和飼料，還廣泛用于食品、化工、醫(yī)藥、紡織等行業(yè)［2］。全球?qū)τ衩卓偭康男枨笕找嬖鲩L?，F(xiàn)階段，通過提高玉米種植面積增加產(chǎn)量已經(jīng)非常困難，因而對提高玉米單產(chǎn)和改善玉米品質(zhì)提出了更高的要求。除氣候、環(huán)境、土壤等特定因素，玉米遺傳基礎狹窄、種質(zhì)資源相對匱乏已經(jīng)成為我國玉米育種的瓶頸［3］。

輻射誘變在創(chuàng)新、拓展玉米種質(zhì)資源方面發(fā)揮著重要作用。傳統(tǒng)輻射源以χ、γ、β射線和中子為主，但存在育種周期長、定向突變差等問題，限制了輻射誘變育種的應用。近年來，重離子輻射誘變因其束流多樣性、突變頻譜寬、穩(wěn)定周期短等特點開創(chuàng)了輻射誘變育種的新途徑［4］。質(zhì)子輻射(PR)盡管原子序數(shù)較低但電離密度大，也屬高傳能線密度輻射(LET)，可將自身所攜帶能量沉積在其徑跡上，產(chǎn)生的相對生物學效應(RBE)較χ、γ、e等低LET輻射明顯，而其引起的生理損傷卻明顯小于7Li、12C等重離子［5-6］。20世紀90年代，我國科研人員嘗試用加速的高能質(zhì)子輻射誘變植物種子，相繼取得了一系列成果。唐掌雄等［7］用質(zhì)子輻射麥類，結果發(fā)現(xiàn)，M1代苗高和根長的變化分別與輻照劑量及射線能量有關。王彩蓮等［8］用質(zhì)子輻射水稻，獲得了矮稈和千粒質(zhì)量顯著增加的突變株。施巾幗等［9］研究了質(zhì)子輻射對小麥的誘變效應，結果發(fā)現(xiàn)，不同劑量質(zhì)子輻射對小麥M1代的有益變異效果不同。質(zhì)子輻射突變頻率高，可以顯著加快育種進程，但現(xiàn)有文獻報道對玉米的輻射誘變研究大多采用γ射線［10］、重離子［5-6］以及航天搭載［11］等方式，研究重點主要集中在細胞基因組的生理損傷［12］、生物誘變效應［5-6］、突變體的營養(yǎng)品質(zhì)［13-14］以及構建理論模型［15］等方面，而關于質(zhì)子輻射誘變玉米的研究卻鮮見報道。鑒于此，利用不同劑量質(zhì)子輻射處理玉米種子，研究其對發(fā)芽率、成苗率、空稈率、株高、穗位高以及千粒質(zhì)量等生物性狀的影響，同時采用隨機擴增多態(tài)性DNA(RAPD)分子標記技術研究M1代的突變率并進行遺傳相似聚類分析，系統(tǒng)研究質(zhì)子輻射對玉米的生物誘變效應，初步篩選有益變異株，為提高質(zhì)子輻射效果和選育玉米新品種提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 供試材料及質(zhì)子輻射處理

供試玉米品種為白馬牙玉米，白馬牙玉米因籽粒白色、顆粒偏平而得名，為河北遷安當?shù)貍鹘y(tǒng)種植品種。采用中國原子能科學研究院的HI－13串列加速器對白馬牙玉米干種子進行質(zhì)子輻射，輻射能量為 13.00 MeV/u，傳能線密度為 3.50 keV/μm，輻射劑量分別為 0(CK)、10、20、30、40、50 Gy，每個劑量處理種子50粒，所有輻射試驗均在正常大氣條件下進行。

1.2 田間試驗及表觀性狀監(jiān)測

田間試驗于2016年在河北省遷安市隆興農(nóng)業(yè)科技示范場進行，淺耕施基肥，人工開穴單粒點播。不同劑量質(zhì)子輻射處理分別播種50粒種子(株距0.25 m，行距 0.50 m)。根據(jù)植株生長情況定期灌溉，追肥尿素、磷酸二銨一次。觀測發(fā)芽率、成苗率、空稈率、葉型、株高、穗位高、千粒質(zhì)量等表觀性狀以及抗病性。重點統(tǒng)計M1代出苗期第15天的發(fā)芽率、拔節(jié)期第5天的成苗率以及抽雄吐絲期第7天的空稈率(n=50)，隨機統(tǒng)計完熟期收獲前玉米植株的株高、穗位高、千粒質(zhì)量等表觀性狀指標(n=20)，以未經(jīng)質(zhì)子輻射處理的M1代玉米表觀性狀指標作為對照(CK)。

1.3 光合速率測定

在玉米抽雄吐絲期的第8天同一時間段內(nèi)環(huán)境溫度相對穩(wěn)定條件下，采用ECA－PB0402光合速率測定儀(北京益康農(nóng)科技有限公司生產(chǎn))測定M1代玉米穗位上部第1片葉的光合速率，各輻射劑量處理及CK隨機測量20株長勢較為接近的植株，取平均值。

1.4 RAPD 分析

DNA提取及相關檢測:采用 Tiangen公司的DNA提取試劑盒，根據(jù)具體步驟提取CK及各輻射劑量處理M1代玉米抽雄吐絲期葉片DNA，采用凝膠電泳成像系統(tǒng)(1%瓊脂糖凝膠)檢測。采用UV－765紫外可見分光光度計對樣品逐一進行吸光度檢測。

PCR擴增:采用美國Bio公司的熒光定量PCR儀進行DNA擴增，擴增程序按95℃ 5 min，37℃1 min，72 ℃ 1.5 min，共 35 個循環(huán)，額外 72 ℃10 min用于完全延伸。擴增產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠中進行電泳分離，1×TAE緩沖液含有EB，最后用凝膠成像系統(tǒng)拍照。

PCR體系優(yōu)化及引物篩選:由于PCR體系會對RAPD結果的穩(wěn)定性產(chǎn)生影響，為保證擴增的準確、可靠以及可重復性，對PCR體系進行一系列優(yōu)化。優(yōu)化體系如下:采用 25 μL 體系，含 10.8 μL 超純水、2.5 μL buffer、2.5 μL Dye、2 μL dNTP、4 μL 引物、1.2 μL Taq 酶、2 μL DNA 模板。以對照 DNA 為模板，選用142對隨機引物在優(yōu)化體系下進行擴增，從中選出條帶穩(wěn)定性好、清晰度高、帶型豐富的隨機引物。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

采用SPSS軟件的單因素方差分析和LSD多重比較進行數(shù)據(jù)分析。各統(tǒng)計量定義如下:

發(fā)芽率=(發(fā)芽種子粒數(shù)/供試種子粒數(shù))×100%，

成苗率=(成苗株數(shù)/供試種子粒數(shù))×100%，

空稈率=(空稈株數(shù)/成活總株數(shù))×100%，

多態(tài)性比率=(多態(tài)性條帶數(shù)/對照擴增條帶數(shù))×100%。

根據(jù)RAPD電泳結果統(tǒng)計，缺失或增加條帶為陽性記為1，與對照條帶相同擴增陰性記為0。采用NTsys軟件對不同劑量處理及CK進行聚類分析。

2 結果與分析

觀察田間表觀性狀發(fā)現(xiàn)，質(zhì)子輻射誘變的白馬牙玉米M1代在發(fā)芽、成苗、抽雄、開花、散粉、吐絲、成熟等階段都有變異現(xiàn)象出現(xiàn)。20 Gy質(zhì)子輻射處理有3株葉片出現(xiàn)皺縮、卷曲，40 Gy質(zhì)子輻射處理有5株葉片變寬，但上述2個處理的穗上葉片數(shù)和總?cè)~片數(shù)與CK沒有明顯差異。10 Gy質(zhì)子輻射處理有1株出現(xiàn)雄性不育，2株花藥由紫色變?yōu)辄S色，2株花絲由紅色變?yōu)榉凵?。另外?0 Gy質(zhì)子輻射處理有4株出現(xiàn)同位多穗現(xiàn)象。10 Gy質(zhì)子輻射處理抗病性整體增強，但20、30 Gy質(zhì)子輻射處理抗倒伏能力整體減弱，抗旱性沒有明顯變化。10 Gy質(zhì)子輻射處理有6株抽雄期、吐絲期均比CK提前3 d，成熟期也相應提前且活稈成熟，而50 Gy質(zhì)子輻射處理有3株成熟期卻比CK晚2 d。

2.1 質(zhì)子輻射對玉米M1代發(fā)芽率、成苗率和空稈率的影響

玉米發(fā)芽率能夠直觀地顯示種子的萌發(fā)出芽狀況，而成苗率則反映植株的成苗情況。如圖1所示，不同劑量質(zhì)子輻射處理發(fā)芽率均在86%以上，其中，20 Gy處理出苗情況最好，發(fā)芽率高達98%，輻射劑量繼續(xù)增加，發(fā)芽率總體呈降低趨勢。質(zhì)子輻射各組成苗率均在84%以上，整體變化趨勢與發(fā)芽率相似，但略低于發(fā)芽率?？斩捖手苯佑绊懹衩桩a(chǎn)量，統(tǒng)計空稈率對準確估算玉米產(chǎn)量有重要意義。與CK相比，10、40 Gy處理誘變的空稈率分別為13.04%、20.93%，而 20、50 Gy 處理空稈率則明顯較低(2%左右)，不同劑量質(zhì)子輻射處理M1代空稈率隨輻射劑量的變化呈典型的馬鞍形雙峰曲線。

圖1 不同劑量質(zhì)子輻射對玉米M1代發(fā)芽率、成苗率和空稈率的影響

2.2 質(zhì)子輻射對玉米M1代株高、穗位高、千粒質(zhì)量的影響

相對穗位(穗位高與株高之比)能在一定程度上反映植株的抗倒伏能力，千粒質(zhì)量則是體現(xiàn)玉米籽粒大小與飽滿程度的一項指標，也是田間試驗預測產(chǎn)量的重要依據(jù)。由表1可知，與CK相比，10、20、40、50 Gy處理玉米株高均顯著增加，而30 Gy處理顯著降低。穗位高只有20 Gy處理顯著增加，整體而言，質(zhì)子輻射對株高的影響大于對穗位高的影響。20、30 Gy處理玉米植株的相對穗位均明顯增高，提示上述2個劑量處理的植株抗倒伏能力減弱。圖2所示為不同劑量質(zhì)子輻射M1代玉米果穗，10 Gy 處理玉米千粒質(zhì)量高達 654 g，20、40、50 Gy 處理玉米千粒質(zhì)量也均顯著增加(表1)，隨輻射劑量增加玉米千粒質(zhì)量也呈典型的馬鞍形雙峰曲線變化，提示質(zhì)子輻射對提高白馬牙玉米產(chǎn)量有潛在的作用。

表1 不同劑量質(zhì)子輻射對玉米M1代株高、穗位高和千粒質(zhì)量的影響

圖2 不同劑量質(zhì)子輻射處理M1代玉米果穗

2.3 質(zhì)子輻射對玉米M1代光合速率的影響

光合作用能夠提供玉米生長發(fā)育所需物質(zhì)和能量，是玉米產(chǎn)量形成的基礎。由圖3可見，不同劑量質(zhì)子輻射處理的白馬牙玉米M1代光合速率隨輻射劑量增加呈典型的馬鞍形曲線變化。其中，10 Gy處理白馬牙玉米M1代的光合速率最高，達23.48 μmol/(m2·s)，其次是 20、40 Gy 處理，分別為22.01、21.87 μmol/(m2·s)，3 個處理均顯著高于CK［19.72 μmol/(m2·s)］，而 30 Gy 處理［18.96 μmol/(m2·s)］略低于 CK，50 Gy 處理［19.82 μmol/(m2·s)］基本與CK持平。

圖3 不同劑量質(zhì)子輻射對玉米光合速率的影響

2.4 玉米突變的RAPD分析

在優(yōu)化反應體系下，從142對隨機引物中篩選出16對(表2)，共擴增出124個條帶，擴增產(chǎn)物片段大小均在200～3 000 bp。不同劑量質(zhì)子輻射處理玉米基因組DNA均出現(xiàn)不同程度的多態(tài)性，主要表現(xiàn)為電泳條帶的增加或缺失。從圖4可見，與CK相比，引物A2中箭頭所指10、20 Gy處理在800～1 200 bp各增加1個條帶，而50 Gy處理在800～1 200 bp增加不同的2個條帶;引物A10中箭頭所指50 Gy處理在800～1 200 bp缺失1個條帶，10、50 Gy處理在500～800 bp增加相同的1個條帶，而20、30、40 Gy處理也增加相同的1個條帶。

表2 RAPD分析選用隨機引物序列

為系統(tǒng)研究質(zhì)子輻射誘變對玉米基因組的影響，采用RAPD分別統(tǒng)計多態(tài)性比率(表3)，不同劑量質(zhì)子輻射誘變的多態(tài)性比率為 20.16% ～32.26%，10、50 Gy處理多態(tài)性比率明顯高于其他劑量處理組，20 Gy處理多態(tài)性比率最低，多態(tài)性比率呈現(xiàn)非線性的變化趨勢，由此可見，質(zhì)子輻射能夠有效引起玉米基因組的變異。利用NTsys軟件基于遺傳相似度對不同劑量質(zhì)子輻射處理進行聚類分析可知(圖5)，整個質(zhì)子輻射群體在遺傳相似系數(shù)0.69附近聚為兩大類，其中20、30、40 Gy誘變處理與CK聚為一類，10、50 Gy處理誘變效果相近聚為另一類。

圖4 隨機引物A2、A10擴增結果

表3 不同劑量質(zhì)子輻射對玉米基因組DNA多態(tài)性的影響

圖5 不同劑量質(zhì)子輻射誘變的聚類分析

3 結論與討論

本試驗結果表明，質(zhì)子輻射能夠引起白馬牙玉米M1代明顯的誘變效應。不同劑量質(zhì)子輻射處理白馬牙玉米M1代的發(fā)芽率、成苗率均在84%以上，可見，低劑量質(zhì)子輻射處理對以上指標影響不大，但質(zhì)子輻射對玉米植株的空稈率影響明顯，空稈率隨質(zhì)子輻射劑量的增加呈馬鞍形變化，該指標是否穩(wěn)定遺傳需要逐代跟蹤。質(zhì)子輻射對千粒質(zhì)量以及光合速率的影響也較為明顯，隨輻射劑量增加有增加—降低—增加—降低交替出現(xiàn)的馬鞍形趨勢。耿金鵬等［16］曾報道，不同劑量重離子7Li輻射對玉米自交系永19的株高、穗位高有馬鞍形劑量效應。陳學君等［6］證實，重離子12C和36Ar輻射處理玉米自交系鄭58對部分表觀性狀有正負雙重作用。韓榮飛等［15］綜合能質(zhì)沉積和電荷協(xié)同提出了EMC模型，從理論角度闡述了馬鞍形存活率產(chǎn)生的機制。不同輻射試驗引起的變異情況比較復雜，因粒子類型、射線能量、輻射劑量以及供試材料不同而反應不一，推測馬鞍形劑量效應可能是一種普遍的輻射誘變效應。

Duncan等［17］系統(tǒng)研究了22個雜交玉米品種的光合特性，證明光合速率是一個可以穩(wěn)定遺傳的性狀。于康珂等［18］探索了不同成熟度玉米葉片對高溫脅迫的光合響應特征，結果發(fā)現(xiàn)，成熟葉片葉綠素含量顯著下降，且不同玉米自交系的光合速率相差較大。本試驗測定光合速率時所選植株的長勢與CK相近，不同劑量質(zhì)子輻射處理引起的植株長勢明顯增強或減弱的單株未被測量。10、20、40 Gy處理植株的光合速率顯著高于CK，這可能是輻射引起玉米葉片細胞葉綠體合成的增加或突變所致，同時，對應劑量處理的千粒質(zhì)量也有所增加。但唐掌雄等［7］利用質(zhì)子輻射誘變麥類種子發(fā)現(xiàn)，M1代幼苗出現(xiàn)葉綠素缺失的現(xiàn)象。究竟質(zhì)子輻射如何影響玉米葉綠體合成從而影響光合作用，并最終影響千粒質(zhì)量需要更進一步研究。如果增強的植株光合速率特性和提高的千粒質(zhì)量指標能夠穩(wěn)定遺傳，那么通過對輻射誘變后代定向選擇，則有可能培育出光合能力突出的玉米新品種，這對于培育高產(chǎn)玉米及創(chuàng)新種質(zhì)資源具有重要意義。

自 Williams等［19］和 Welsh 等［20］提出 RAPD 分子標記以來，該技術因其快速、簡便、靈敏等特點逐漸滲透于基因組研究的各個方面［21-22］。李謹?shù)龋?3］應用RAPD對航天搭載輻射仙客來突變株進行分析，結果顯示，太空環(huán)境對仙客來當代植株造成了顯著誘變。孫曉莉等［24］采用RAPD分析獲得了60Co γ射線輻照蝴蝶蘭的最佳輻射誘變劑量。DNA分子水平的多態(tài)性檢測是進行基因組研究的基礎，也為探索質(zhì)子輻射誘變玉米的理論機制提供了依據(jù)。本結果也證實，RAPD能有效檢測玉米基因組的DNA變化，尤其是片段的插入或者刪除。與轉(zhuǎn)基因玉米不同，質(zhì)子輻射誘變并沒有外源基因的導入，主要是自身遺傳物質(zhì)的同源重組［25］。目前尚未確定引起玉米生物誘變效應的相關基因，下一步仍需要在細胞或生物大分子層面進行研究以闡明質(zhì)子輻射誘變的機制。

綜上所述，質(zhì)子輻射能夠有效引起玉米M1代的生物誘變效應，空稈率、千粒質(zhì)量以及光合速率等生物性狀變異明顯，且均有典型的馬鞍形劑量效應出現(xiàn)。10 Gy質(zhì)子輻射顯著提高了白馬牙玉米的千粒質(zhì)量，結合群體生物性狀認為，10 Gy為最優(yōu)輻射劑量。RAPD和聚類分析表明，質(zhì)子輻射能夠有效引起玉米基因組的變異，從而引起玉米M1代的生物誘變效應?？梢?，質(zhì)子輻射是玉米種質(zhì)創(chuàng)新的一種有效手段。

致謝:承蒙中國原子能科學研究院北京串列加速器核物理國家實驗室和河北省遷安市隆興農(nóng)業(yè)科技示范場航天育種基地提供的幫助，特此感謝!

［1］ 張中東，惠國強，張紅梅，等.玉米的營養(yǎng)及藥用價值研究進展［J］.玉米科學，2006，14(3):173-176.

［2］ 侯旭光.內(nèi)蒙古玉米產(chǎn)業(yè)化發(fā)展現(xiàn)狀與對策［J］.河南農(nóng)業(yè)科學，2006(11):15-18.

［3］ 楊培珠，鐘國祥，謝虹，等.玉米種質(zhì)資源的背景與利用現(xiàn)狀［J］.中國農(nóng)學通報，2011，27(5):25-28.

［4］ 周章印.玉米誘變育種研究進展［J］.河北農(nóng)業(yè)科學，2008，12(7):54-57.

［5］ Geng J，Li D，Cao T，et al.Mutagenic effects of maize inbred line irradiated by heavy ion7Li［J］.Molecular Plant Breeding，2012，3(13):132-138.

［6］ 陳學君，李文建，陳婧，等.不同劑量重離子輻照玉米自交系的生物學效應比較［J］.原子核物理評論，2008，25(2):176-181.

［7］ 唐掌雄，施巾幗，鞏玲華，等.質(zhì)子輻照麥類種子對苗期生長的影響［J］.核農(nóng)學通報，1997，18(6):260-262.

［8］ 王彩蓮，陳秋方，慎玫.空間環(huán)境和質(zhì)子對水稻的誘變效應［J］.中國核科技報告，1998(6):775-786.

［9］ 施巾幗，孫國慶，李桂英，等.質(zhì)子對小麥的誘變效應及作用機理研究Ⅰ.質(zhì)子對小麥的誘變效應［J］.核農(nóng)學報，2002，16(2):65-69.

［10］ 石海春，李奇，柯永培，等.60Co－γ射線對自交系R08和48－2 的誘變效應［J］.西南農(nóng)業(yè)學報，2011，24(5):1636-1641.

［11］ 喬曉，石海春，柯永培，等.玉米航天誘變SP3株系的遺傳變異分析［J］.玉米科學，2012，20(3):15-21.

［12］ 羅紅兵，孔福全，倪嵋楠，等.重離子輻照玉米種子引起的基因組DNA變異分析［J］.激光生物學報，2009，18(6):755-759.

［13］ 陳學君，栗孟飛，楊德龍，等.SFE－GC/HPLC對重離子輻照育種的玉米油中五種營養(yǎng)物質(zhì)的含量分析［J］.營養(yǎng)學報，2012，34(5):496-500.

［14］ 仲彩萍，李唯，陳學君.重離子輻照對玉米自交系營養(yǎng)品質(zhì)的影響［J］.甘肅農(nóng)業(yè)大學學報，2010，45(5):29-34.

［15］ 韓榮飛，吳躍進，卞坡，等.低能重離子劑量－存活率效應及其擬合模型探討［J］.原子核物理評論，2009，26(4):352-355.

［16］ 耿金鵬，李多芳，曹天光，等.重離子輻射玉米自交系田間性狀的統(tǒng)計分析［J］.玉米科學，2013，21(2):66-70.

［17］ Duncan W G，Hesketh J D.Net photosynthetic rates，relative leaf growth rates，and leaf numbers of 22 races of maize grown at eight temperatures［J］.Crop Science，1968，8(6):670-674.

［18］ 于康珂，孫寧寧，齊紅志，等.不同成熟度玉米葉片光合生理對高溫脅迫的響應特征及基因型差異［J］.河南農(nóng)業(yè)科學，2017，46(5):34-38.

［19］ Williams J G K，Kubelik A R，Livak K J，et al.DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers［J］.Nucleic Acids Research，1990，18(22):6531-6535.

［20］ Welsh J，McClelland M.Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers［J］.Nucleic Acids Research，1990，18(24):7213-7218.

［21］ Liu P，Zhang B，Zhao H，et al.Analysis of genetic relationship among celery germplasms by RAPD［J］.Agricultural Biotechnology，2014，3(2):10-13.

［22］ 李多芳，田安然，耿金鵬，等.航天搭載誘導百日草的生物學效應［J］.北方園藝，2015(23):97-100.

［23］ 李謹，耿金鵬，曹天光，等.太空環(huán)境對仙客來誘變效應的研究［J］.北方園藝，2015(4):112-115.

［24］ 孫曉莉，章鐵，劉秀清.蝴蝶蘭60Co γ射線輻照材料的RAPD 分子標記研究［J］.中國農(nóng)學通報，2009，25(1):156-159.

［25］ 崔寧波，張正巖，張曲薇.轉(zhuǎn)基因玉米材料的選育及產(chǎn)業(yè)化研究進展［J］.河南農(nóng)業(yè)科學，2017，46(6):13-22.