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        基于空氣動(dòng)力輔助離子化-超高分辨質(zhì)譜成像技術(shù)的大鼠腎臟組織中多種類代謝物的分布研究

        2018-03-13 07:52:33王中華何秉淑孫成龍宋肖煒賀玖明張瑞萍再帕爾阿不力孜
        分析化學(xué) 2018年3期
        關(guān)鍵詞:膽堿磷脂甘油

        王中華 何秉淑 孫成龍 宋肖煒 賀玖明 張瑞萍 再帕爾·阿不力孜*,

        1(中央民族大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院,生物成像與系統(tǒng)生物學(xué)研究中心, 北京 100081) 2(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院/北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所,天然藥物活性物質(zhì)與功能國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 100050)

        1 引 言

        質(zhì)譜成像(Mass spectrometry imaging,MSI) 是將成像處理軟件與質(zhì)譜的離子掃描技術(shù)相結(jié)合的一種新型成像方法,可在分子水平上對(duì)生物組織內(nèi)的分子“直接”分析,獲取其含量和空間分布信息[1,2]。腎臟是重要的代謝和排泄器官,小分子代謝物代謝異常在糖尿病腎病等多種腎病的發(fā)生過(guò)程中具有重要作用,全面了解其在腎臟組織中的含量及分布特征,有助于揭示腎臟疾病的發(fā)病機(jī)制、發(fā)現(xiàn)具有組織特異性的生物標(biāo)志物[3~5]。目前,MSI技術(shù)主要包括以下三大類型: 需要在真空條件下進(jìn)行離子化的二次離子質(zhì)譜(SIMS), 基質(zhì)輔助激光解吸電離(MALDI)質(zhì)譜,以及近幾年發(fā)展起來(lái)的以解吸電噴霧電離(DESI)為代表的敞開(kāi)式離子化質(zhì)譜成像技術(shù)等[6~10]。其中,SIMS成像技術(shù)主要應(yīng)用于樣品表面的元素分析。MALDI-MSI是最成熟、應(yīng)用最為廣泛的質(zhì)譜成像技術(shù),尤其適用于蛋白質(zhì)、多肽等生物大分子的成像分析[6,7],近年來(lái),隨著新型基質(zhì)的開(kāi)發(fā),其也被應(yīng)用在小分子成像分析領(lǐng)域。如Liu等[11]采用基于新型耐鹽基質(zhì)的MALDI-MSI質(zhì)譜成像技術(shù)研究了腎纖維化的發(fā)病機(jī)制,發(fā)現(xiàn)腎纖維化動(dòng)物模型中與糖酵解、三羧酸循環(huán)、脂肪酸代謝、抗氧化劑等代謝網(wǎng)絡(luò)相關(guān)的21種小分子代謝物的含量及分布特征發(fā)生了顯著變化。與MALDI-MSI相比,DESI-MSI技術(shù)具有可在開(kāi)放環(huán)境下操作、使用便捷,且樣品前處理簡(jiǎn)單、無(wú)需添加基質(zhì)等優(yōu)點(diǎn),在小分子代謝物成像分析方面具有廣闊的應(yīng)用前景[9,10]。如Dill等[12]采用DESI-MSI技術(shù)比較了乳頭狀腎細(xì)胞癌的癌組織與癌旁組織脂類代謝物的整體輪廓差異,結(jié)果表明,DESI-MSI技術(shù)結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)分析可準(zhǔn)確區(qū)分癌組織與正常組織,可應(yīng)用于疾病分子病理診斷。本課題組前期自主研發(fā)出新型敞開(kāi)式空氣動(dòng)力輔助離子化(Air flow assisted ionization, AFAI;或稱之為Air flow assisted desorption electrospray ionization, AFADESI;以下統(tǒng)稱為AFAI)及其免標(biāo)記、便捷、高靈敏的質(zhì)譜分子成像新技術(shù)(AFAI-MSI),并成功應(yīng)用于候選新藥作用機(jī)制和腫瘤生物標(biāo)志物的原位篩查及免標(biāo)記分子病理診斷的研究[13,14]。本研究建立了基于AFAI-MSI技術(shù)檢測(cè)大鼠腎臟組織中小分子代謝物的分布特征的質(zhì)譜成像分析方法,為AFAI-MSI技術(shù)在腎臟疾病研究中的應(yīng)用提供了重要依據(jù)。

        2 實(shí)驗(yàn)部分

        2.1 儀器與試劑

        AFAI-MSI成像系統(tǒng)平臺(tái),采用Q Exactive型四極桿-靜電場(chǎng)軌道離子阱質(zhì)譜儀(美國(guó)Thermo Scientific公司),拆卸原有商業(yè)離子源,通過(guò)自制離子源接口安裝AFAI 離子源,并配有Xcalibur 2.2數(shù)據(jù)采集與處理系統(tǒng);UltiMate 3000系列超高效液相色譜儀(美國(guó)Thermo Scientific公司),包括二元梯度泵、在線脫氣機(jī)、自動(dòng)進(jìn)樣器(配有恒溫箱)、柱溫箱、二極管陣列檢測(cè)器;CM 1860冷凍切片機(jī)(德國(guó)Leica Microsystem公司)。乙腈、異丙醇(色譜純,Merck公司),實(shí)驗(yàn)用水為某品牌純凈水。8周齡SD大鼠由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供。

        2.2 腎臟組織樣本的制備

        將2只雌性SD大鼠于高濃度CO2條件下處死,立即摘取腎臟組織,用超純水沖洗掉外周血跡后迅速置于液氮中冷凍,于-80℃保存。

        2.3 組織切片的制備

        將組織從-80℃冰箱轉(zhuǎn)移至CM 1860冷凍切片機(jī)(操作溫度為-20℃),連續(xù)獲取相鄰兩個(gè)厚度為8 μm的腎臟組織切片,分別置于兩個(gè)載玻片上,然后真空干燥30 min。

        2.4 質(zhì)譜條件

        采用正離子全掃描模式,掃描范圍為70~1000 Da,質(zhì)量分辨率設(shè)為70000,自動(dòng)增益控制目標(biāo)值為3×106,最大注入時(shí)間為200 ms。噴霧電壓為7 kV,傳輸管電壓為3 kV,噴霧氣(氮?dú)?壓力為0.6 MPa,噴霧溶劑(異丙醇-乙腈-水,4∶4∶2,V/V)流速為5 μL/min,空氣輔助氣流速為45 L/min。數(shù)據(jù)采集采用Xcalibur 2.2軟件(美國(guó)Thermo Scientific公司)。

        2.5 數(shù)據(jù)處理方法

        利用Xcalibur 2.2軟件將原始數(shù)據(jù)文件轉(zhuǎn)換為cdf格式,隨后采用本課題組與科邁恩(北京)科技有限公司合作研制的質(zhì)譜成像軟件MassImager(質(zhì)譜成像系統(tǒng)工作站v1.0版)進(jìn)行文件讀取,以檢測(cè)離子的種類、相對(duì)強(qiáng)度和空間位置,進(jìn)行成像分析[15]。

        3 結(jié)果與討論

        3.1 溶劑的選擇

        溶劑的極性、粘度、表面張力、介電常數(shù)等理化性質(zhì)是影響噴霧溶劑將目標(biāo)分子從組織內(nèi)萃取、解吸、電離的因素。采用甲醇、乙腈、異丙醇和水作為噴霧溶劑,以質(zhì)譜峰個(gè)數(shù)和強(qiáng)度為監(jiān)測(cè)指標(biāo),分別對(duì)溶劑組成和比例進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明,采用乙腈-異丙醇-水(4∶4∶2,V/V)作為噴霧溶劑,對(duì)小分子代謝物的檢測(cè)效果最佳。

        3.2 方法穩(wěn)定性考察

        制備寬度和間隔均為3 mm的羅丹明B紅色條帶,對(duì)其進(jìn)行AFAI-MS分析,以m/z443.2離子強(qiáng)度為監(jiān)測(cè)指標(biāo),連續(xù)測(cè)定3天,考察了分析系統(tǒng)的穩(wěn)定性[16]。結(jié)果表明,m/z443.2離子峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(Relative standard deviation,RSD)<20%,表明AFAI-MS分析方法的重復(fù)性良好。

        3.3 AFAI-高分辨質(zhì)譜檢測(cè)分析

        應(yīng)用空氣動(dòng)力輔助離子化-超高分辨質(zhì)譜對(duì)腎臟組織冰凍切片進(jìn)行了原位分析,結(jié)果表明,在正離子模式下能夠檢測(cè)到信號(hào)強(qiáng)度103~107的離子共498個(gè)(去除同位素),檢測(cè)到的離子類型包括[M+H]+、[M+Na]+、[M+K]+、[2M+Na]+和[2M+K]+等。利用其精確質(zhì)荷比信息,在Metlin、HMDB、LIPID MAPS等數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索可能的分子式及代謝物,結(jié)合同位素豐度比、不同類型加合離子之間的精確質(zhì)荷比差值以及文獻(xiàn)報(bào)道等信息,分析推測(cè)代謝物的可能結(jié)構(gòu),共發(fā)現(xiàn)38種不同種類的內(nèi)源性代謝物(表1)。從表1可見(jiàn),這些代謝物的分子量在100~900 Da之間均有分布,其質(zhì)量偏差均在5 ppm以內(nèi),分別屬于有機(jī)胺、糖、神經(jīng)遞質(zhì)、維生素、多肽、有機(jī)酸、甘油磷脂、鞘脂、甘油脂、固醇酯等不同的代謝物類型,表明建立的基于超高分辨質(zhì)譜的AFAI-MS分析方法可適用于腎臟組織中含量差異較大的不同分子量和結(jié)構(gòu)類型的多種小分子代謝物的原位分析,并能獲得準(zhǔn)確的分子信息。

        表1 從腎臟組織中發(fā)現(xiàn)的38種內(nèi)源性代謝物

        Table 1 38 kinds of metabolites identified in rat kidney tissues

        名稱aName實(shí)測(cè)質(zhì)荷比Measured(m/z)理論質(zhì)荷比Theoretical(m/z)質(zhì)量偏差bDeviationofmass(δ)分子離子Molecularions膽堿Choline104.1074104.10703.84[M+H]+甜菜堿Betaine118.0864118.08630.85[M+H]+?;撬酺aurine126.0221126.02200.79[M+H]+肌酐Creatinine136.0482136.04810.74[M+Na]+N?甲基尼克酰胺N?methylnicotinamide137.0710137.07090.73[M+H]+乙酰膽堿Acetylcholine146.1175146.1176-0.68[M+H]+肉堿Carnitine162.1124162.1125-0.62[M+H]+乙酰精氨Acetylspermidine188.1757188.17570.00[M+H]+甘油磷酸Glycerolphosphate195.0029195.00290.00[M+Na]+葡萄糖Glucose203.0526203.05260.00[M+Na]+山梨醇Sorbitol205.0683205.06830.00[M+Na]+磷酸膽堿Phosphocholine206.0552206.05520.00[M+Na]+泛酸PantothenicAcid242.0996242.0999-1.24[M+Na]+甘油磷脂酰乙醇胺Glycerylphosphorylethanolamine254.0189254.0190-0.39[M+K]+硫胺素Thiamine265.1115265.1118-1.13[M+H]+甘油磷脂酰膽堿Glycerophosphocholine280.0918280.0920-0.71[M+Na]+檸檬酸鈉Sodiumcitrate332.9559332.9571-3.60[M+K]+精氨酸?羥基天冬氨酸酸或羥基精氨酸?天冬氨酸酸Lys?Asp?OHorAsp?Lys?OH392.1052392.1064-3.06[M+Na]+1?(3?甲基丁酰基)?6?芹菜糖基葡萄糖1?(3?Methylbutanoyl)?6?apiosylglucose397.1707397.17050.50[M+H]+硬脂?;鈮AStearoylcarnitine428.3732428.3735-0.70[M+H]+MG(18∶0)381.2973381.2975-0.52[M+Na]+LysoPC(16∶0)518.3214518.3217-0.58[M+Na]+PC(18∶2)558.2952558.2956-0.72[M+K]+PC(18∶1)560.3102560.3112-1.78[M+K]+PC(20∶4)582.2960582.29560.69[M+K]+PG(22∶4)583.2990583.3006-2.74[M+Na]+PA(30∶0)607.4694607.4697-0.49[M+H]+CE(20∶4)695.5730695.5737-1.01[M+Na]+Cer(44∶1)700.6570700.6578-1.14[M+Na]+SM(34∶2)723.5405723.5411-0.83[M+Na]+SM(34∶1)739.5137739.5150-1.76[M+K]+PG(34∶1)771.5121771.5146-3.24[M+Na]+PE(38∶5)788.4958788.4990-4.06[M+K]+PG(36∶2)797.5277797.5302-3.13[M+Na]+PC(38∶5)804.4969804.49403.60[M+K]+SM(42∶3)833.6485833.6507-2.64[M+Na]+PC(40∶8)852.5501852.5514-1.52[M+Na]+LacCer(d32∶1)872.5490872.5495-0.57[M+K]+a,脂類化合物的簡(jiǎn)稱:化合物名(碳原子數(shù):雙鍵數(shù)),MG:甘油單酯,LysoPC:溶血磷脂酰膽堿,PC:磷脂酰膽堿,PG:磷脂酰甘油,PA:磷脂酸,CE:膽固醇酯,Cer:神經(jīng)酰胺,SM:鞘磷脂,PE:磷脂酰乙醇胺,LacCer:乳糖神經(jīng)酰胺。b,質(zhì)量偏差:質(zhì)量偏差=(實(shí)測(cè)質(zhì)量數(shù)-理論質(zhì)量數(shù))/理論質(zhì)量數(shù)×106。a,Abbreviationoflipidcompounds:Compoundname(NumberofCarbons:Numberofdoublebonds),MG:Monoglycerides,LysoPC:Lyso?phosphatidylcholine,PC:Phosphatidylcholine,PG:Phosphatidylglycerol,PA:Phosphatidicacid,CE,Cholesterylester,Cer,Ceramide,SM:Sphingomyelin,PE:Phosphatidylethanolamine,LacCer:Lactosylceramide.b.Deviationofmass:Deviationofmass=(Measuredmass-the?oreticalmass)/Theoreticalmass×106.

        3.4 代謝物的質(zhì)譜成像分析

        膽堿及其代謝物在腎組織中的分布情況如圖1所示,膽堿是細(xì)胞膜、線粒體膜和神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿的組成成分,參與脂代謝、信號(hào)傳導(dǎo)、生物分子的翻譯后修飾、核受體的激活、細(xì)胞膜的流動(dòng)性調(diào)控等多種生命過(guò)程[17]。從圖1可見(jiàn),膽堿在腎臟組織中分布廣泛,在腎皮質(zhì)和腎乳頭區(qū)域含量最高。

        圖1 膽堿及其代謝物在大鼠腎組織中的分布: (A) 膽堿, (B) 乙酰膽堿, (C) 甜菜堿, (D) 磷酸膽堿, (E) 甘油磷酸膽堿Fig.1 Distribution of choline and its metabolites in rat kidney tissues: (A) Choline, (B) Acetylcholine, (C) Betaine, (D) Phosphocholine, and (E) Glycerophosphocholine

        乙酰膽堿是膽堿在膽堿乙?;D(zhuǎn)移酶的作用下合成的,可促進(jìn)水和離子的排出。本研究發(fā)現(xiàn)乙酰膽堿主要分布于近髓皮質(zhì)區(qū)域,可能與膽堿乙?;D(zhuǎn)移酶在腎皮質(zhì)集合管中的特異性分布有關(guān)[18]。

        甜菜堿和甘油磷脂酰膽堿分別是膽堿的氧化和磷酸化代謝產(chǎn)物,分別在腎臟外髓質(zhì)和腎乳頭區(qū)域有特異性分布。據(jù)報(bào)道,甜菜堿和甘油磷脂酰膽堿是腎臟中重要的滲透保護(hù)劑,參與腎臟皮質(zhì)-髓質(zhì)軸向滲透壓梯度的形成,并且能夠?qū)垢吣蛩丨h(huán)境對(duì)腎髓質(zhì)細(xì)胞的損害作用,維持細(xì)胞內(nèi)生物大分子的正常結(jié)構(gòu)和功能[19]。甜菜堿在外髓質(zhì)區(qū)域含量很高,不僅可以檢測(cè)到[M+H]+、[M+Na]+、[M+K]+等準(zhǔn)分子離子,還能檢測(cè)到較強(qiáng)的 [2M+Na]+、[2M+K]+等準(zhǔn)分子離子峰,這些離子在腎臟組織中分布特征基本一致(圖2)。

        圖2 甜菜堿的5種分子離子在大鼠腎組織中的分布: (A) [M+H]+,(B) [M+Na]+,(C) [M+K]+,(D) [2M+Na]+,(E) [2M+K]+Fig.2 Distributions of five molecular ions of betaine in rat kidney tissue: (A) [M+H]+, (B) [M+Na]+, (C) [M+K]+, (D) [2M+Na]+, (E) [2M+K]+

        磷酸膽堿在皮質(zhì)和外髓質(zhì)部分具有少量分布,且主要分布在腎乳頭區(qū)域,推測(cè)其可能參與腎臟皮質(zhì)-髓質(zhì)軸向滲透壓梯度的形成。文獻(xiàn)[19]中曾將皮質(zhì)和髓質(zhì)分離,分別進(jìn)行提取后, 再測(cè)定磷酸膽堿的含量,但未檢測(cè)到磷酸膽堿,推測(cè)可能與所采用的方法的靈敏度較低有關(guān)。

        此外,本研究還發(fā)現(xiàn)了多種有機(jī)胺、糖、維生素、肉堿和有機(jī)酸類小分子代謝物在腎臟的不同組織區(qū)域呈特征性分布(圖3),推測(cè)它們?cè)谀I臟細(xì)胞保護(hù)、滲透壓的調(diào)節(jié)、神經(jīng)遞質(zhì)代謝調(diào)控等方面具有重要作用[19~22]。例如,本研究發(fā)現(xiàn)硫胺素(維生素B1)主要分布在腎臟近髓皮質(zhì)部分,與乙酰膽堿具有相似的分布特征。有研究表明,維生素B1是乙酰膽堿代謝的重要調(diào)控因子,可抑制膽堿酯酶的活性,維生素B1的缺乏可導(dǎo)致此酶活性升高和乙酰膽堿的分解代謝增加,而補(bǔ)充維生素則可以提高乙酰膽堿的水平[22]。此外,維生素B1在體內(nèi)可轉(zhuǎn)變成硫胺素焦磷酸,參與糖在體內(nèi)的代謝。因此,維生素B1缺乏時(shí),可導(dǎo)致糖代謝紊亂;而增加維生素B1的攝入可改善糖尿病導(dǎo)致的腎臟損傷,具有逆轉(zhuǎn)早期糖尿病、腎病的作用[23]。

        圖3 有機(jī)胺、糖、維生素、肉堿和有機(jī)酸類代謝物在大鼠腎組織中的分布: (A) 肌酐,(B) N-甲基尼克酰胺,(C) 乙酰膽堿,(D) 精氨酸-羥基天冬氨酸酸或羥基精氨酸-天冬氨酸酸,(E) 甘油磷脂酰乙醇胺,(F) 葡萄糖,(G) 山梨醇,(H) 1-(3-甲基丁?;?-6-芹菜糖基葡萄糖,(I) 甘油磷酸,(J) 檸檬酸鈉,(K) 硫胺素,(L) ?;撬?,(M) 泛酸,(N) 肉堿,(O) 硬脂酰基肉堿。Fig.3 Distribution of metabolites of organic amine, sugar, vitamins, peptides and organic acids in rat kidney tissues: (A) Creatinine, (B) N-methylnicotinamide, (C) Acetylspermidine, (D) Lys-Asp-OH or Asp-Lys-OH, (E) Glycerylphosphorylethanolamine, (F) Glucose, (G) Sorbitol, (H) 1-(3-Methylbutanoyl)-6-apiosylglucose, (I) Glycerol phosphate, (J) Sodium citrate, (K) Thiamine, (L) Taurine, (M) Pantothenic Acid, (N) Carnitine, (O) Stearoylcarnitine.

        圖4是脂類代謝物在腎臟組織中的分布特征圖。脂類代謝物具有許多重要的生物學(xué)功能,參與調(diào)節(jié)多種生命活動(dòng)過(guò)程,包括能量轉(zhuǎn)換、物質(zhì)運(yùn)輸、信息識(shí)別與傳遞、細(xì)胞發(fā)育和分化、細(xì)胞凋亡等[24,25]。本研究建立的AFAI-MSI質(zhì)譜成像方法可檢測(cè)到溶血磷脂酰膽堿、磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、甘油磷脂酸、鞘磷脂、神經(jīng)酰胺、甘油單酯、固醇酯等脂類代謝物。這些脂類代謝物在腎臟組織中呈不均勻分布,可能與腎臟組織不同區(qū)域具有不同的結(jié)構(gòu)和功能有關(guān)。

        圖4 脂類代謝物在大鼠腎組織中的分布: (A) LysoPC (16∶0),(B) PC(18∶1),C∶ PC(18∶2),(D) PC(20∶4),(E) PC(38∶5),(F) PC(40∶8),(G) PE(38∶5),H∶ PG(22∶4),(I) PG(34∶1),(J) PG(36∶2),(K) PA(30∶0),(L) SM(34∶1),M∶ SM(34∶2),(N) SM(42∶3),(O) Cer(44∶1), (P): LacCer(d18∶1/14∶0), (Q) MG(18∶0),(R) CE(20∶4)Fig.4 Distribution of lipids in rat kidney tissues: (A) LysoPC (16∶0), (B) PC(18∶1), (C) PC(18∶2), (D) PC(20∶4), (E) PC(38∶5), (F) PC(40∶8), (G) PE(38∶5), (H) PG(22∶4), (I) PG(34∶1), (J) PG(36∶2), (K) PA(30∶0), (L) SM(34∶1), (M) SM(34∶2), (N) SM(42∶3), (O) Cer(44∶1), (P) LacCer(d18∶1/14∶0), (Q) MG(18∶0), (R) CE(20∶4)

        4 結(jié) 論

        建立了基于空氣動(dòng)力輔助離子化-高分辨質(zhì)譜技術(shù)檢測(cè)大鼠腎臟組織中小分子代謝物分布的質(zhì)譜成像分析方法。本方法無(wú)需樣品預(yù)處理, 靈敏度高,代謝物覆蓋范圍寬,可直接獲取多種類型、含量差異達(dá)4個(gè)數(shù)量級(jí)的內(nèi)源性代謝物的結(jié)構(gòu)、含量及空間分布信息。因此,本方法有望應(yīng)用于腎臟中內(nèi)源性代謝物的原位表征和代謝調(diào)控機(jī)制研究,為探究代謝物在糖尿病、腎病、慢性腎炎、急性腎衰等多種急慢性腎病中的作用等提供一種新的分析方法。

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