竇曉，楊建剛，曹新志，馬瑩瑩，郭家秀，張琦，蘇暢

（四川理工學(xué)院生物工程學(xué)院，四川自貢 643000）

大曲作為中國(guó)白酒發(fā)酵過(guò)程中的發(fā)酵劑，可以給發(fā)酵過(guò)程提供微生物、前體風(fēng)味物質(zhì)以及各種酶類(lèi)[1～3]。酵母菌作為大曲微生物中的主要組成部分之一，對(duì)大曲的功能的形成有著不可或缺的作用。傳統(tǒng)的酵母菌株鑒定方法建立在菌株的形態(tài)、生理特性和生物化學(xué)特性質(zhì)差異之上。然而這些特征會(huì)受培養(yǎng)條件的影響，在某種程度上具有不確定性，為確保鑒定結(jié)果的可靠性，鑒定一株菌經(jīng)常需要完成 50～100項(xiàng)實(shí)驗(yàn)[4]。費(fèi)時(shí)費(fèi)力且重復(fù)性不高。

核糖體RNA基因(rRNA)存在于所有細(xì)胞生物中并具有相同的起源和功能，因而可以反映所有物種間具有可比性的進(jìn)化史。而且rDNA中有些片段具有高度的序列同源性或保守性，從而可為不同物種間的系統(tǒng)學(xué)比較提供研究參考點(diǎn)。

Kurtzman & Robnett[5,6]和 Fell等[7]測(cè)定了所有已知酵母種類(lèi)的26S rRNA D1 D2區(qū)序列，發(fā)現(xiàn)在這一600 bp左右的片段中，種內(nèi)序列變異小于等于1%，而種間序列差異大于 1%。目前這一標(biāo)準(zhǔn)已被國(guó)際酵母分類(lèi)學(xué)界普遍接受，從而也使酵母菌的菌種鑒定變得相對(duì)容易。近年來(lái)，以核酸為研究對(duì)象的分子生物學(xué)技術(shù)以其簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)逐漸應(yīng)用到酵母菌的分類(lèi)鑒定中。

單鏈構(gòu)象多態(tài)性(Single Strand Conformation Polymorphism，SSCP)技術(shù)是基因突變分析中最常用的方法之一。其理論基礎(chǔ)是單鏈DNA具有序列特異性的二級(jí)或三級(jí)構(gòu)象。一個(gè)或多個(gè)堿基的差異能影響其構(gòu)象，在非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳中，構(gòu)象的改變表現(xiàn)為單鏈DNA遷移率的改變，根據(jù)各樣品的單鏈遷移率，就可以把突變體和非突變體區(qū)分開(kāi)。該方法最初應(yīng)用于人類(lèi)基因點(diǎn)突變的檢測(cè)中[8,9]，由于其在檢測(cè)堿基差異方面的高分辨力，而廣泛應(yīng)用于人類(lèi)和植物病原真菌種的鑒定和菌株分析中[10,11]。

本研究通過(guò)對(duì)不同時(shí)期大曲中分離的酵母菌的26S rRNA基因D1/D2區(qū)序列進(jìn)行分析，在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行同源序列搜索(BLAST)，比較供試菌株與已知酵母菌相應(yīng)序列的同源性。依據(jù)分離鑒定的結(jié)果對(duì)大曲生產(chǎn)過(guò)程中的酵母菌的演替規(guī)律進(jìn)行了初步探究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品

大曲取自瀘州老窖制曲生態(tài)園，對(duì)生產(chǎn)過(guò)程中0、3、5、7、10、25、90 d的大曲進(jìn)行采集。在形態(tài)學(xué)觀察的基礎(chǔ)上，挑取了260株酵母進(jìn)行26S rRNA基因D1/D2區(qū)的序列測(cè)序與比對(duì)。

1.1.2 儀器試劑

基因擴(kuò)增儀（GT9612）購(gòu)自杭州柏恒科技有限公司；離心機(jī)（CF15R）購(gòu)自日立集團(tuán)；電泳儀（JK600C）購(gòu)自北京君意東方電泳設(shè)備有限公司；凝膠成像系統(tǒng)Alpha Innotech購(gòu)自美國(guó)Alpha公司；Taq PCR Master Mix，引物NL1，NL4均購(gòu)自北京博邁德生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 酵母菌分離

在瀘州老窖制曲生態(tài)園中采取第0、3、5、7、10、25、90 d的大曲，每個(gè)時(shí)期的大曲雜碎混勻后取50 g加入到450 mL無(wú)菌水里面充分混勻后，吸取1 mL混合液到裝有9 mL無(wú)菌水的試管中，依次做成10-2，10-3，10-4，10-5，10-6五個(gè)梯度，然后再用YPD培養(yǎng)基（酵母粉10 g/L，葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，瓊脂20 g/L，自然pH）和PDA培養(yǎng)基（馬鈴薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂20 g/L，自然pH）進(jìn)行平板分離。

1.2.2 總DNA的提取

在涂布的平板上挑取單菌落再劃線純化，分離純的酵母菌株。用Makimura等[12]方法提取菌體總DNA。在斜面上挑取少量酵母菌體（一環(huán)），置于一已滅菌的1.5 mL的離心管內(nèi)。加入100 μL裂解液（100 mM Tris，30 mM EDTA，0.5% SDS，pH 8.0 15P滅菌30 min備用），100 ℃水浴15 min。加入100 μL 2.5M的醋酸鉀后（室溫冷卻后），置于冰上30 min至60 min。在4 ℃下13000 r/min離心5 min，上清液移至一新1.5 mL離心管內(nèi)(200 μL槍)。加入等體積的氯仿異戊醇（24:1），劇烈震蕩10 min（上下?lián)u動(dòng)，除去蛋白），13000 r/min，離心15 min，吸取100 μL上清液至另一只滅菌的1.5 mL離心管中。重復(fù)上一步，直到兩相之間沒(méi)有沉淀，將上清液移至另一只滅菌的 1.5 mL離心管中（可省略）。加入等體積（100 μL）的冷的異丙醇，放置-20 ℃靜置15 min（沉淀DNA）。13000 r/min離心15 min。用100 μL 70%乙醇洗滌沉淀。重復(fù)上一步驟。將沉淀置于真空干燥器中抽干乙醇（65 ℃烘干 30 min或65 ℃水?。＜尤?50 μL已滅菌的 MILLI-Q 水（ddH2O），在4 ℃下溶解2 h，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 PCR擴(kuò)增和測(cè)序

PCR擴(kuò)增26S rRNA D1 D2區(qū)，PCR擴(kuò)增反應(yīng)所用引物參照 Kurtzman等[5]，正向引物 NL1：5′-GCATATCGGTAAGCGGAGGAAAAG-3′，反向引物 NL4：5′-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3′。PCR 采用25 μL體系，擴(kuò)增反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，循環(huán) 35 次；72 ℃ 8 min。PCR反應(yīng)產(chǎn)物的瓊脂糖電泳檢測(cè)：取2 μL PCR擴(kuò)增原液點(diǎn)樣于 1%的瓊脂糖凝膠，電泳，溴化已錠(EB)染色后在紫外燈照射下確定是否擴(kuò)出所要片段。26S D1 D2區(qū)擴(kuò)增出單一明亮條帶，片段大小約為500～600 bp。

1.2.4 DNA序列分析方法

DNA序列分析：用DNA Star軟件并結(jié)合DNA正反向序列圖譜對(duì)DNA序列進(jìn)行拼接和校正。將校正后的序列在國(guó)際核酸數(shù)據(jù)庫(kù)(http:www.ncbi.nlm.nih.gov.blast)中進(jìn)行同源序列搜索，初步確定受試菌株的分類(lèi)地位，一般在D1 D2區(qū)可以按如下經(jīng)驗(yàn)值判斷：(1)與最近緣種的模式菌株相似率為 100%，可確定為同一種；(2)與最近緣種的模式菌株的相似率<98%，可初步確定為新種；(3)與最近緣種的模式菌株的相似率在99%～100%之間，它們的關(guān)系要視不同的情況而定，除考慮序列差異外，還應(yīng)考慮生理生化性狀差異。

SSCP分析：用 DCodeTM 突變檢測(cè)電泳儀進(jìn)行SSCP檢測(cè)。參照使用說(shuō)明配置丙稀酰胺，甲叉雙丙稀酰胺(37.5:1)的8%凝膠。把PCR產(chǎn)物稀釋2～5倍，取5 μL(大約150～300 ng)與等量的上樣緩沖液(0.05%溴酚蘭，0.05%二甲苯青，95%甲酰胺，4% 0.5 mol EDTA，pH 8.0)混勻，在95 ℃下變性10 min，迅速放在冰上，放置15 min。把變性后的樣品依次加入到點(diǎn)樣孔中，200 V電壓10 ℃電泳16 h。電泳結(jié)束后將凝膠按照 Wallace[13]的方法進(jìn)行硝酸銀染色，用相機(jī)拍照保存。

2 結(jié)果與討論

2.1 26S rRNA D1/D2區(qū)序列的擴(kuò)增

在對(duì)分離的260株菌的26S rRNA D1/D2區(qū)序列進(jìn)行了PCR擴(kuò)增，下圖為PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖，顯示產(chǎn)物的長(zhǎng)度都在500～750 bp，這與酵母菌的D1/D2區(qū)域序列長(zhǎng)度為500～600 bp左右相符合，說(shuō)明擴(kuò)增正常。電泳效果圖見(jiàn)圖1。

圖1 26S rRNA D1/D2區(qū)序列PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.1 PCR amplification product electrophoresis of 26S rRNA D1/D2 region sequence

2.2 26S rRNA D1/D2區(qū)序列的比對(duì)

對(duì)分離的260株菌的26SrRNA基因D1/D2區(qū)序列在 GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行同源序列搜索(BLAST)后，將同源性大于 99%的菌株歸為同一個(gè)種發(fā)現(xiàn)有101株菌與異常威克漢姆酵母(Wickerhamomyces anomalus)的同源性高于99%，故將這101株酵母菌鑒定為異常威克漢遜酵母(Wickerhamomyces anomalus)；其中 52株菌與扣囊覆膜酵母(Saccharomycopsis fibuligera)的同源性大于99%，故鑒定為扣囊覆膜酵母(Saccharomycopsis fibuligera)；11株菌與釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的相似度為 100%；Clavispora lusitaniae 18株；庫(kù)德畢赤酵母(Pichia kudriavzevii)15株；假絲酵母(Candida glabrata)16株；Kluyveromyces marxianus 13株；Torulaspora delbrueckii 9株；生絲畢赤酵母(Hyphopichia burtonii)7株；Meyerozyma guilliermondii 3株；Pichia caribbica 2株；其余均為一株。表1為部分菌株在Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行同源序列搜索后結(jié)果。

表1 部分菌株26S rRNA基因D1/D2區(qū)與模式菌株比對(duì)結(jié)果Table 1 Comparison of 26S rRNA gene D1 / D2 region of part of the strains with model strains

2.3 對(duì)不同種菌株的 26S rRNA基因D1/D2-SSCP圖譜比較

為了進(jìn)一步確定它們之間的種間差異，對(duì)部分不同菌株進(jìn)行26S rRNA D1/D2-SSCP圖譜分析比較，結(jié)果如圖2所示。所比較株菌D1/D2-SSCP圖譜都包括兩條泳動(dòng)慢的單鏈和一條泳動(dòng)快的雙鏈。雙鏈位置的不同反映菌株間26S rRNA基因D1/D2區(qū)片段長(zhǎng)度的差異，堿基序列的差異通過(guò)單鏈位置及兩單鏈位置關(guān)系的差異反映在SSCP圖譜上。因此，由圖2可以看出不同類(lèi)型株菌的核型差異很明顯。

圖2 部分菌株間的26S rRNA基因D1/D2-SSCP圖譜比較Fig.2 Comparison of 26S rRNA D1 / D2-SSCP patterns among some strains

2.4 基于26S rRNA D1/D2區(qū)序列構(gòu)建M-L系統(tǒng)樹(shù)

圖3 基于26S rRNA基因D1/D2區(qū)序列構(gòu)建的M-L系統(tǒng)樹(shù)Fig.3 M-L system tree based on 26S rRNA D1 / D2 regionsequence

用軟件MEGA6.06對(duì)所有序列進(jìn)行比對(duì)后，刪除兩端未對(duì)齊的堿基生成進(jìn)化樹(shù)，并進(jìn)行1000次的Bootstraps檢驗(yàn)。采用“Maximum Likelihood Tree”(M-L)方法顯示進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果見(jiàn)圖。構(gòu)建了22種不同菌株與其相似度最接近的模式菌株的M-L系統(tǒng)樹(shù)如（圖3），通過(guò)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)對(duì)大曲中分離出的不同類(lèi)型的酵母的種間親緣關(guān)系進(jìn)行了直觀界定。

2.5 不同時(shí)期大曲酵母菌的分布規(guī)律

根據(jù)對(duì)260株酵母菌的26S rRNA D1/D2區(qū)序列比對(duì)鑒定的結(jié)果以及前期平板計(jì)數(shù)的結(jié)果對(duì)不同時(shí)期大曲中的酵母菌進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。如圖4所示，在大曲生產(chǎn)初期酵母種群數(shù)量較多，在頂溫區(qū)（7 d～10 d）種群減少，酵母數(shù)量最多，但種群開(kāi)始減少，主要以異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）和扣囊復(fù)膜酵母（Saccharomycopsis fibuligera）為主，成品大曲（90 d以后）酵母主要以扣囊復(fù)膜酵母（Saccharomycopsis fibuligera）為主。這可能是隨著大曲培菌過(guò)程中溫度的變化使酵母群落發(fā)生了相應(yīng)的演替。

圖4 不同時(shí)期大曲中酵母的分布Fig.4 Yeastdistributions in Daqu in different periods

3 討論

3.1 本文通過(guò)傳統(tǒng)的平板計(jì)數(shù)的方法對(duì)大曲培菌過(guò)程中的酵母菌的種群變化進(jìn)行了初步的統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)頂溫區(qū)（7～10 d）酵母數(shù)量最多，主要以異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）和扣囊復(fù)膜酵母（Saccharomycopsis fibuLigera）為主，成品大曲（90 d以后）酵母主要以扣囊復(fù)膜酵母（Saccharomycopsis fibuligera）為主。成品大曲中的酵母菌種類(lèi)相對(duì)單一，而它又能直接參與中國(guó)白酒的發(fā)酵過(guò)程，因此對(duì)成品大曲中含量最高的扣囊復(fù)膜酵母進(jìn)行更深一步的的研究很有必要。但傳統(tǒng)分離由于自身的局限性對(duì)各時(shí)期的優(yōu)勢(shì)菌株的體現(xiàn)并沒(méi)有現(xiàn)代分子生物學(xué)那樣系統(tǒng)直觀，例如DGGE和高通量等方法。Zhang Liqiang等運(yùn)用PCR-DGGE技術(shù)解析了不同類(lèi)型大曲中微生物的組成差異[14]；Zheng等運(yùn)用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)30年窖齡和300年窖齡的瀘州老窖窖泥微生物的多樣性進(jìn)行了系統(tǒng)分析[15]；這些技術(shù)與傳統(tǒng)的分離鑒定方法存在著很大的優(yōu)勢(shì)，可以簡(jiǎn)單直觀地反映出某一時(shí)期某種物質(zhì)中的可培養(yǎng)的以及不可培養(yǎng)的微生物的組成，但傳統(tǒng)分離也存在著自身獨(dú)有的優(yōu)勢(shì)，相比較現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)它可以得到活的菌株，為微生物的進(jìn)一步研究提供基礎(chǔ)。因此運(yùn)用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)手段來(lái)指導(dǎo)傳統(tǒng)分離將是以后的發(fā)展方向。

3.2 隨著DNA序列分析技術(shù)的日趨成熟和簡(jiǎn)易化，序列分析方法已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于酵母菌的分類(lèi)鑒定以及系統(tǒng)學(xué)研究。而 26S rRNA基因D1/D2區(qū)序列在GenBank/EMBL/DDBJ等國(guó)際核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)中的公布為酵母菌的分類(lèi)鑒定帶來(lái)了極大的方便[16]。

3.3 26S rRNA的Dl/D2區(qū)域位于大亞基的5′端，序列長(zhǎng)度在600 bp左右，該段區(qū)域具有較高的變異率，可以用于親緣關(guān)系較近的菌株之間的分類(lèi)研究。此區(qū)域序列已建成了完備的分析數(shù)據(jù)庫(kù)，用其進(jìn)行酵母菌種的鑒定更為方便準(zhǔn)確，其應(yīng)用也最為廣泛[17,18]。本實(shí)驗(yàn)也是依于此對(duì)大曲生產(chǎn)過(guò)程中不同時(shí)期的樣品中分離出的酵母菌進(jìn)行了26S rRNA基因D1 D2區(qū)的序列同源性分析，共分析鑒定了260株酵母菌。從而確定了大曲生產(chǎn)過(guò)程中不同時(shí)期的酵母菌的組成結(jié)構(gòu)，初步掌握了大曲中酵母菌的演替規(guī)律，對(duì)研究傳統(tǒng)中國(guó)白酒的功能微生物奠定了一定的基礎(chǔ)。

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