馮艷艷，王海燕，劉蓓蓓，韋艷娜，張珍珍，白 昀，倪 博，邵國青，雷治海，馮志新*

(1. 南京農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，南京 210095；2. 江蘇省農(nóng)業(yè)科學院獸醫(yī)研究所·農(nóng)業(yè)部獸用生物制品工程技術重點實驗室，南京210014)

豬支原體肺炎(Mycoplasmal pneumonia of swine，MPS)是由豬肺炎支原體(Mycoplasmahyopneumoniae，Mhp)引起的一種慢性接觸性呼吸道病。MPS世界性流行，發(fā)病率高，并常誘發(fā)其他病原的感染引起死亡，給現(xiàn)代養(yǎng)豬業(yè)造成巨大損失[1]。研究發(fā)現(xiàn)，Mhp對豬氣管上皮細胞表面纖毛的黏附作用是侵襲宿主呼吸道的關鍵步驟，決定了支原體的致病性[2-3]，因此眾多的文獻通過豬氣管上皮細胞(swine tracheal epithelial cells，STEC)模型探究Mhp的致病機制，但傳統(tǒng)STEC都是通過浸沒培養(yǎng)，無論是傳代的細胞系還是原代分離的細胞均只能單層生長，無法分化形成原代細胞在體內(nèi)生長條件下的假復層纖毛柱狀上皮形狀和功能[4]；因此，建立一種盡可能接近體內(nèi)生長方式的細胞培養(yǎng)模型以研究Mhp的感染及與宿主互作關系尤為重要。

近年來有學者利用氣液交界面(air-liquid interface，ALI)培養(yǎng)模型研究人呼吸道上皮抗感染防御機制已取得重大突破[5-7]，本研究借鑒人呼吸道上皮細胞ALI培養(yǎng)技術經(jīng)驗，建立及優(yōu)化豬氣管上皮傳代細胞系的3D培養(yǎng)模型，分別將不同毒力的Mhp菌株感染豬氣管上皮細胞，從細胞生長特性、活性和功能等方面比較Mhp強弱毒株的損傷差異及可能機制，為深入探究Mhp的致病機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

RPMI-1640購自維森特生物技術有限公司，血清購自Gbico公司；人胎盤膠原Ⅳ購自Sigma公司；LPS購自Sigma公司；Alamar Blue、Hoechst 33342染液購自上海翊圣生物有限公司；NAC抗氧化劑、NO檢測試劑盒、乳酸脫氫酶細胞毒性檢測試劑盒購自碧云天生物技術有限公司；活性氧檢測試劑盒購自南京凱基生物有限公司；CFDA-SE細胞增殖示蹤熒光探針購自碧云天生物技術有限公司；黏液蛋白MUC5B一抗購自Santa Cruze；Cy3標記的兔多抗IgG購自碧云天生物技術有限公司；3470(Cat#)Transwell?通透性嵌套購自Costar。

1.2 菌體、細胞

豬肺炎支原體強毒菌株NJ株、中等毒力菌株AH株、弱毒菌株168L株由江蘇省農(nóng)業(yè)科學院獸醫(yī)研究所分離保存，各菌株毒力經(jīng)豬體試驗測定；STEC傳代細胞系購自上海撫生實業(yè)有限公司。

1.3 傳代STEC細胞ALI培養(yǎng)模型

將生長于含10%胎牛血清RPMI-1640培養(yǎng)基中的STEC傳代細胞以105·mL-1的濃度接種于膠原包被的24孔Transwell中，每孔接種250 μL，Transwell下層加800 μL細胞培養(yǎng)液，在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，以后每天吸棄從下層小室滲透到支持膜表面液體，直到觀察發(fā)現(xiàn)細胞長滿單層、支持膜表面保持可見的干燥，則說明已形成氣液交界面，繼續(xù)培養(yǎng)5 d后用2.5%戊二醛固定部分細胞，通過掃描電鏡觀察纖毛分化情況。待纖毛分化成功后，可用于感染試驗。

1.4 Mhp感染ALI細胞

分別將Mhp 168L株、NJ株和AH株接種于KM2培養(yǎng)基中，以1∶10復壯，待菌液培養(yǎng)至對數(shù)生長期備用。將各菌液以12 000 r·min-1，離心20 min，菌體沉淀用PBS洗滌一次，用無血清的RPMI-1640培養(yǎng)液重懸，調(diào)整滴度為107CCU·mL-1，分別以200 μL·孔-1接種于上層小室中已分化的細胞單層，分別標記為168L組、NJ組、AH組；設置陰性對照，接種等體積無血清的RPMI-1640培養(yǎng)液；設置陽性對照，接種用等體積無血清RPMI-1640培養(yǎng)液稀釋的10 μg·mL-1的LPS，放入37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育培養(yǎng)。

為了鑒定Mhp菌株的感染情況，在感染前按文獻報道的方法[8]，每管菌株中各加10 μL 10 mmol·L-1的CFDA-SE染液， 放入37 ℃ 200 r·min-1搖床中孵育15 min，進行標記。感染48 h后，用PBS洗滌細胞面3遍，在上層小室中加入100 μL配制好的Hoechst 33342染液標記細胞。用一次性刀片將Transwell insert的支持膜切下，放到載玻片上，用10%甘油封片，于Zeiss Lsm 710激光掃描共聚焦下進行斷層掃描鑒定；另外用2.5%戊二醛固定各感染組細胞，通過掃描電鏡觀察其纖毛生長情況。

1.5 NAC抗氧化劑處理

分別取陰性對照和各感染組的其中三孔細胞，在其Transwell下層各加含終濃度為10 mmol·L-1NAC的新鮮培養(yǎng)液，之后放入37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育培養(yǎng)。

1.6 細胞生長特性檢測

分別取Mhp各感染組的細胞，在上層小室中加PBS 洗三遍，用Millicell ERS-2 電壓計測量Transwell Inserts上下兩側(cè)上皮細胞間的測膜電阻TEER。

1.7 細胞活性檢測

1.7.1 Alamar Blue檢測法 分別取各感染組細胞，在各孔Transwell上下層各加入含10% Alamar Blue的RPMI-1640，在培養(yǎng)箱孵育2～4 h，吸取各孔上層所有液體至新的96孔板中，在激發(fā)光波長為560 nm，發(fā)射光波長為590 nm的熒光分光光度計上檢測。

1.7.2 乳酸脫氫酶(LDH)釋放檢測法 分別取各感染組Transwell上層液體，按照LDH釋放檢測試劑盒說明書進行檢測。

1.8 細胞黏液分泌檢測

在各感染組Transwell上層加入4%的多聚甲醛固定20 min，加入1∶200稀釋的anti-MUC5B抗體，4 ℃孵育過夜，第二天加入1∶300稀釋的Cy3標記的兔多抗IgG抗體，37 ℃培養(yǎng)箱孵育1 h后，DAPI避光染色，用一次性刀片將Transwell insert的支持膜切下，放到載玻片上，用10%甘油封片，于Zeiss Lsm 710激光掃描共聚焦下進行斷層掃描鑒定；之后將Transwell insert的支持膜放到96孔板中，使用550 nm激發(fā)波長，570 nm發(fā)射波長，檢測各組熒光強度。

1.9 細胞氧化應激檢測

1.9.1 細胞NO釋放檢測 分別取各感染組Transwell上層液體，按照NO檢測試劑盒說明書進行檢測。

1.9.2 細胞內(nèi)源性ROS 檢測 按活性氧檢測試劑盒說明書，在各感染組Transwell上層加DCFH-DA熒光探針，培養(yǎng)箱中作用20 min，RPMI-1640洗去未結(jié)合的游離探針，設置陽性對照組，使用488 nm激發(fā)波長，525 nm發(fā)射波長，檢測各組熒光強度。

1.10 統(tǒng)計分析

各試驗組檢測數(shù)據(jù)使用SPSS軟件進行One-way ANOVA與Two-way ANOVA方差分析，并用GraphPad Prism 5軟件制圖。

2 結(jié) 果

2.1 傳代STEC細胞ALI培養(yǎng)模型的建立

在ALI培養(yǎng)第5 天時，STEC表面有豐富的類似微絨毛結(jié)構分化，且分化數(shù)量多，生長旺盛，表示細胞分化狀態(tài)正常，可用于感染試驗(圖1)。

2.2 Mhp感染STEC細胞的檢測

在感染48 h后，激光共聚焦檢測各組Mhp感染情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Mhp 168L株、NJ株和AH株均能成功黏附STEC表面(圖2)。

2.3 掃描電鏡觀察細胞形態(tài)

在感染48 h后，掃描電鏡觀察各感染組STEC表面纖毛生長情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，168L株、AH株和NJ株感染組細胞表面的纖毛上均有球狀黏附物，且各組纖毛生長狀態(tài)存在明顯差異，與對照組相比，弱毒株168L株組纖毛上有散在的球狀黏附物，纖毛狀態(tài)與對照組差異不大；中等毒力AH株組纖毛上球狀黏附物數(shù)量增多，纖毛有明顯的變粗、破損和脫落現(xiàn)象；強毒株NJ株組纖毛上出現(xiàn)聚堆的球狀黏附物，纖毛發(fā)生嚴重的破損和脫落現(xiàn)象(圖3)。

圖1 ALI培養(yǎng)第5天的STEC掃描電鏡結(jié)果Fig.1 The STEC scans by ALI in the fifth day

A. Control組；B. Mhp 168L株感染組；C. Mhp AH株感染組；D. Mhp NJ株感染組A. Control group; B. Mhp 168L strains infected group; C. Mhp AH strain infected group; D. Mhp NJ strain infected group圖2 不同毒力組Mhp與STEC的黏附作用(48 h)Fig.2 The adherence of Mhp with different virulence to STEC cells (48 h)

A. Control組；B. Mhp 168L株感染組；C. Mhp AH株感染組；D. Mhp NJ株感染組A. Control group; B. Mhp 168L strains infected group; C. Mhp AH strain infected group; D. Mhp NJ strain infected group圖3 不同毒力Mhp感染48 h后STEC纖毛生長情況Fig.3 Cilia of STEC infected by Mhp with different virulence at 48 h

2.4 感染細胞生長特性檢測

TEER值能準確地反映細胞間緊密連接狀態(tài)，從而指示細胞的生長特性。在感染后48 h，檢測各組跨細胞膜電阻，發(fā)現(xiàn)與陰性對照組相比，各感染組細胞的電阻值均出現(xiàn)了不同程度的下降，其中弱毒株168L株感染組下降程度最小，平均電阻值為113.8 Ω，對細胞生長的抑制較??；而中等毒力AH株和強毒株NJ株感染組下降程度依次變大，平均電阻值僅為84.5和72.9 Ω，對細胞生長的抑制率也依次升高；與陽性對照組相比，168L株與AH株感染組差異均顯著(P<0.05)，而NJ株感染組與陽性對照組差異不顯著(P>0.05)；各感染組之間，168L株與AH株、NJ株組相比差異性均顯著(P<0.05)(圖4)。

2.5 感染細胞活性檢測

各組間相同字母代表差異不顯著，不同字母代表差異顯著(P<0.05). 下表同Columns with the same letters represent no significant difference, without the same superscripts are significantly different (P<0.05). The same as below圖4 不同毒力Mhp感染48 h STEC的電阻值Fig.4 TEER of STEC infected by Mhp with different virulence at 48 h

2.5.1 Alamar Blue檢測 通過Alamar Blue法檢測了不同毒力Mhp菌株對STEC活細胞代謝的抑制率，在感染后24、36、48 h，檢測各組細胞Alamar Blue還原率，發(fā)現(xiàn)隨著感染時間的延長，弱毒株168L株感染組細胞Alamar Blue還原率幾乎沒有下降，一直穩(wěn)定在60%左右，各時間點差異不顯著(P>0.05)，對STEC活細胞代謝的抑制率較低，對細胞活性影響較??；而中等毒力AH株和強毒株NJ株感染組細胞Alamar Blue還原率下降明顯，在48 h時下降幅度最大，分別下降至48%和46%，對STEC活細胞代謝的抑制率依次上升，顯著降低細胞活性；而且在感染后48 h，與陽性對照組相比，NJ株、AH株組差異不顯著(P>0.05)，而168L株組與陽性對照組、AH株、NJ株組之間差異均顯著(P<0.05)(圖5)。

圖5 不同毒力的Mhp感染STEC不同時間Alamar Blue還原率Fig.5 Alamar Blue reduction rate of STEC infected by Mhp with different virulence at different time

2.5.2 LDH釋放檢測 在感染后48 h，通過LDH釋放檢測各組細胞死亡率，發(fā)現(xiàn)與陰性對照組相比，各感染組細胞的細胞死亡率均出現(xiàn)了不同程度的升高，其中弱毒株168L株感染組細胞的死亡率最低，平均死亡率僅比陰性對照組升高4.2%，而中等毒力AH株和強毒株NJ株感染組細胞死亡率依次升高，比陰性對照組升高21.8%和51.0%；與陽性對照組相比，168L株、AH株組差異顯著(P<0.05)，而NJ株差異不顯著(P>0.05)(圖6)。

圖6 不同毒力Mhp感染48 h STEC的細胞死亡率Fig.6 Cell mortality rate of STEC infected by Mhp with different virulence at 48 h

2.6 感染細胞黏液分析檢測

在感染48 h后，通過激光共聚焦檢測各組MUC5B黏液蛋白分泌情況，發(fā)現(xiàn)與陰性對照組相比，弱毒株168L株感染組差異不顯著(P>0.05)，而中等毒力AH株和強毒株NJ株感染組黏液蛋白分泌量顯著上調(diào)，平均熒光強度值較陰性對照組分別升高了126.3和133.3，差異顯著(P<0.05)；與陽性對照組相比，168L株、AH株和NJ株組差異性均顯著(P<0.05)；各感染組之間，AH株和NJ株差異性不顯著(P>0.05)(圖7)。

A1～A3. 陰性對照；B1-B3. Mhp 168L株；C1～C3. Mhp AH株；D1～D3. Mhp NJ株；E1～E3. 陽性對照(LPS)；1. 細胞核DAPI染色；2. MUC5B蛋白Cy3熒光檢測；3. 1、2合并圖;F.黏液蛋白MUC5B熒光強度A1-A3. Negative group; B1-B3. Mhp 168L strains; C1-C3. Mhp AH strains D1-D3. Mhp NJ strains; E1-E3. Control group (LPS treated); 1. DAPI dyeing for cell nucleus；2. Cy3 fluorescence for MUC5B；3. Merged 1 & 2;F.Fluorescence intensity of MUC5B圖7 不同毒力Mhp感染STEC黏液蛋白MUC5B分泌情況及熒光強度(48 h)Fig.7 The production situation and fluorescence intensity of MUC5B of STEC infected by Mhp with different virulence (48 h)

2.7 感染細胞氧化應激檢測

2.7.1 NO釋放檢測 在感染后24、36、48 h，分別檢測各感染組細胞NO釋放，發(fā)現(xiàn)隨著感染時間的延長，弱毒株168L株和中等毒力AH株感染組與陰性對照組中細胞NO釋放變化較少，刺激細胞產(chǎn)生含氮自由基的能力較弱，而NJ株感染組細胞NO釋放變化較大，且逐步上升，在感染后48 h，強毒株NJ株感染組細胞NO釋放上升至最高，均值達到16 μmol·L-1，能刺激細胞產(chǎn)生較高水平的含氮自由基。感染各時間點，168L株感染組與陰性對照組相比差異均不顯著(P>0.05)，而AH株組與NJ株組在各時間點與陰性對照組相比均差異顯著(P<0.05)。在感染后48 h，NJ株感染組釋放的NO量與陽性對照組相比差異已不顯著(P>0.05)(圖8)。

圖8 不同毒力的Mhp感染STEC不同時間NO濃度Fig.8 NO concentration of STEC infected by Mhp with different virulence at different time

2.7.2 細胞內(nèi)源性ROS檢測 在感染后48 h，檢測各感染組反映ROS釋放水平的細胞DCF熒光強度，發(fā)現(xiàn)與陰性對照組相比，弱毒株168L株感染組ROS釋放水平差異不顯著(P>0.05)，刺激細胞產(chǎn)生活性氧的能力較弱，而中等毒力AH株和強毒株NJ株感染組與陰性對照組相比差異顯著(P<0.05)，平均細胞DCF熒光強度分別升高了90.6和775.3，刺激細胞產(chǎn)生活性氧的水平依次升高；NJ株感染組刺激細胞釋放ROS的量最高，與陽性對照組差異已不顯著(P>0.05)(圖9)。

2.8 NAC抗氧化劑對各感染組細胞損傷的影響

圖9 不同毒力Mhp感染48 h STEC的 DCF熒光強度Fig.9 DCF model fluorescence intensity of STEC infected by Mhp with different virulence at 48 h

NAC抗氧化劑處理各組后，在感染后48 h，發(fā)現(xiàn)對照組的NAC處理孔與未處理孔相比，其細胞活性(Alamar Blue法)、電阻值和黏液分泌均沒有顯著變化，說明NAC抗氧化劑對STEC細胞的生長特性、活性與功能無影響；而各感染組的NAC處理孔與未處理孔相比，內(nèi)源性ROS產(chǎn)生水平與對照組的百分比均有所下降(7.8%～58.3%)，且隨著感染菌株毒力增加，下降幅度增大，其中弱毒株168L株組的下降水平最低，且與對照組相比，差異不顯著；各感染組的NAC處理孔與未處理孔相比，細胞跨膜電阻值與對照組的百分比均有顯著上升(3.6%～22.4%)，且隨著感染菌株毒力增加，上升幅度增大；各感染組的NAC處理孔與未處理孔相比，MUC5B黏液蛋白分泌量與對照組的百分比均有顯著下降(7.6%～74.7%)，且隨著感染菌株毒力增加，下降幅度增大；各感染組的NAC處理孔與未處理孔相比，其細胞活性(Alamar Blue法)與對照組的百分比均有顯著提高(3.7%～12.3%)，且隨著感染菌株毒力增加，提高幅度增大。

NAC處理后，不同毒力Mhp菌株感染組對STEC在跨膜電阻、細胞代謝、黏液分泌功能方面的影響均有不同程度的恢復，且菌株毒力越強，NAC添加后的恢復作用越明顯(圖10)。

圖10 NAC抗氧化劑對不同毒力Mhp感染48 h STEC損傷的影響Fig.10 Effects of NAC antioxidants on the damage of STEC infected by Mhp with different virulence at 48 h

3 討 論

豬肺炎支原體黏附并定植到豬呼吸道纖毛上皮是感染和發(fā)生致病作用的關鍵階段[9]，但前期研究中選用的體外感染模型均為浸沒培養(yǎng)的原代細胞或細胞系，非呼吸道靶細胞或非分化出纖毛的呼吸道上皮細胞的選用，無法模擬Mhp在體內(nèi)感染的真實狀態(tài)，影響Mhp感染與致病機制的準確評價[10-11]。氣液界面(ALI)培養(yǎng)技術將細胞生長于兩相介質(zhì)上，真實模擬體內(nèi)呼吸道或消化道的管腔結(jié)構。對于呼吸道上皮細胞，有助于細胞立體結(jié)構的形成和纖毛及微絨毛的分化，同時具有黏液分泌等細胞功能[12]。因此，本研究通過建立傳代STEC 3D細胞模型以及基于此細胞的Mhp侵染模型，更真實地模擬了Mhp與豬呼吸道纖毛的結(jié)合過程，為支原體的增殖培養(yǎng)和研究菌體與細胞互作開辟新途徑。

本研究分別從細胞形態(tài)、細胞生長特性、細胞活性和細胞黏液分泌功能方面比較和分析Mhp強弱毒株對STEC的致病性差異。掃描電鏡觀察感染不同毒力Mhp菌株的STEC細胞表面纖毛狀態(tài)，直觀體現(xiàn)了各菌株毒力的差異，證實了各菌株的毒力與纖毛細胞損傷的相關性。緊密連接是宿主黏膜屏障的重要組成部分，是黏膜上皮細胞選擇性通透作用的物質(zhì)基礎。研究表明，3D細胞的跨膜電阻值TEER能反映細胞間緊密連接形成情況和生長特性，其電阻值越低，緊密連接的完整性和生長特性越差[12-14]。本試驗結(jié)果顯示，感染后48 h，對照組和Mhp 168L組緊密連接和生長特性良好，而AH和NJ組緊密連接被破壞，生長被抑制。這表明Mhp對STEC的生長存在抑制作用，且其抑制作用的程度與菌株的毒力呈正相關。在此基礎上，我們又選用Alamar Blue和LDH釋放檢測兩種方法測定STEC活性。Alamar Blue是一種反映活細胞代謝能力[15]，且在3D細胞上常用的細胞活性測定方法[16-17]，LDH釋放檢測則是從細胞膜完整性方面測定細胞活性[17-18]，我們前期的研究結(jié)果表明，Mhp感染有可能會導致細胞膜完整性的破壞[19]。因此，本研究采用以上兩種細胞活性檢測方法來評價Mhp感染影響細胞活性的情況，并分析導致細胞活性損傷的可能方式。結(jié)果表明，Mhp強毒的感染不僅破壞了細胞膜的完整性，同時也降低了細胞的代謝與增殖能力，這種破壞能力同樣與菌株的毒力呈正相關。ALI培養(yǎng)與浸沒培養(yǎng)的STEC相比，ALI培養(yǎng)的STEC能分泌多種黏液蛋白，如MUC5B、MUC5AC和MUC4等，更接近于體內(nèi)氣管的生理功能[12,20]，有研究表明，人肺炎支原體感染，會導致黏液過量分泌，支原體損傷程度越大，黏液分泌量越高，因此黏液分泌過量也是疾病惡化的反映[21]。本試驗通過不同毒力的Mhp感染傳代STEC 3D細胞，比較各感染組黏液分泌量差異，結(jié)果表明，Mhp感染顯著上調(diào)黏液分泌量，其中NJ株黏液分泌量極顯著高于AH株，AH株極顯著高于168L株，也同樣驗證了Mhp菌株毒力越強，刺激感染細胞分泌黏液的量越高，越可能容易引起肺炎病變的惡化。

本研究結(jié)果驗證了Mhp感染會導致分化的STEC細胞活性降低，生長受到抑制以及黏液分泌量上調(diào)，且與菌株的毒力強弱呈正相關。在Mhp可能的致病機制方面，我們前期研究在浸沒培養(yǎng)細胞模型上，從細胞氧化系統(tǒng)角度進行探索，初步發(fā)現(xiàn)了Mhp強弱毒株體外感染氣管上皮細胞后可產(chǎn)生氧化損傷及相關蛋白的表達差異[22-23]。本研究在3D細胞模型上驗證細胞氧化損傷與Mhp感染致病的相關性，首先通過測定細胞NO和ROS分泌量，研究結(jié)果表明Mhp感染后可刺激宿主細胞產(chǎn)生過量的活性氧自由基與活性氮自由基，且產(chǎn)生量與Mhp毒力呈正相關[24]；另外應用NAC抗氧化劑處理Mhp感染組，發(fā)現(xiàn)NAC處理后，不同毒力Mhp菌株感染組的ROS和黏液分泌量均顯著降低，細胞活性和電阻值均顯著升高，其變化水平與菌株的毒力呈正相關。這表明NAC可通過降低細胞內(nèi)源性ROS分泌量，從而降低Mhp菌株對各感染組細胞形態(tài)、細胞活性以及細胞黏液分泌方面的損傷，而且菌株毒力越強，NAC的抑制作用越明顯，進一步論證了該氧化應激與后續(xù)形成的細胞活性與功能損傷密切相關[ 25]。但同時也發(fā)現(xiàn)，在細胞活性的檢測中，NAC氧化抑制劑的加入并不能完全恢復感染組細胞的代謝能力，說明Mhp感染引起細胞代謝能力的下調(diào)還受其他主要因素的影響。

4 結(jié) 論

通過更接近體內(nèi)環(huán)境的豬氣管上皮3D分化細胞感染模型證明，Mhp感染可影響宿主細胞的生長特性、活性與功能，損傷分化的纖毛，其損傷的能力與菌株毒力呈正相關；而這種損傷機制與Mhp菌株引起感染細胞氧化應激的能力密切相關。

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