倪 璞， 劉宏偉

(同濟大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院牙周教研室，上海 200072)

種子細胞是牙周組織工程成功的關(guān)鍵因素之一，牙周膜干細胞(periodontal ligament stem cells, PDLSCs)，牙周膜細胞(periodontal ligament cells, PDLCs)及軀干骨來源的骨髓基質(zhì)細胞(bone marrow stromal cells, BMSCs)均被證明是牙周再生良好的種子細胞[1-3]。但種子細胞來源較少，培養(yǎng)難度較大，難以用于臨床治療。有外國學(xué)者利用骨髓充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stems, BMMSCs)培養(yǎng)液上清液制備瓊脂糖凝膠，填入大鼠顱骨缺損，刺激骨缺損周圍旁分泌因素，成功促進骨缺損的再生[4]。本實驗選取不同種子細胞及BMMSCs細胞的培養(yǎng)液，比較這些培養(yǎng)液對SD大鼠牙周組織的修復(fù)效果，為進一步復(fù)雜的牙周組織工程的研究及臨床應(yīng)用提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與儀器

同批次6周齡雄性SD大鼠(SPF級)，購自同濟大學(xué)實驗動物中心；低糖型DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、谷氨酰胺、青鏈霉素購自美國Gibco公司；0.25%胰蛋白酶、瓊脂糖粉劑、CO2恒溫孵箱購自美國Thermo公司；離心機購自德國Eppendorf公司；YJ-875型超凈工作臺購自蘇州凈化設(shè)備廠；倒置相差顯微鏡及照相系統(tǒng)購自日本Nikon公司；10cm培養(yǎng)皿及15、50mL離心管購自美國Corning公司。

1.2 方法

1.2.1 大鼠BMMSCs的培養(yǎng) 選取6周齡SD大鼠，予1%戊巴比妥鈉0.006mL/g對大鼠行腹腔麻醉，75%乙醇浸泡5min，無菌條件下取出大鼠雙側(cè)股骨及脛骨，在無菌PBS中剝離多余組織，反復(fù)沖洗干凈。剪開兩端骨骼處，用5mL注射器抽取含10% FBS和1%雙抗的低糖DMEM培養(yǎng)液從一端打入，沖出骨髓狀物滴至含有同樣培養(yǎng)液的10cm培養(yǎng)皿中，吹打成細胞懸液，置于5% CO2、37℃、95%飽和濕度的孵育箱中孵育。倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況。當細胞鋪滿瓶底80%時，用質(zhì)量分數(shù)0.25%的胰酶消化，1∶3傳代。取3～5代細胞進行實驗。

1.2.2 人牙周膜細胞培養(yǎng) 取正畸患者拔除的損壞較少的前磨牙，浸泡于含1%雙抗的低糖DMEM中，無菌條件下刮取牙根中1/3的牙周膜組織，剪成1.0mm×1.0mm×1.0mm小塊，平鋪于10cm培養(yǎng)皿底，加入含10% FBS和1%雙抗的低糖DMEM培養(yǎng)液，置于5%CO2、37℃、95%飽和濕度的孵育箱中孵育。倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況。當細胞鋪滿瓶底80%時，用質(zhì)量分數(shù)0.25%的胰酶消化，1∶2傳代。取3～5代細胞進行實驗。

1.2.3 實驗分組 將大鼠分為實驗組、對照組和空白組，每組填入不同的材料。實驗組： 填入BMMSCs培養(yǎng)液(BMMSCs-CM)凝膠；對照組： 填入BMMSCs凝膠(BMMSCs)或填入牙周膜細胞凝膠(PDLCs)。空白組： 無任何填充物。

1.2.4 BMMSCs培養(yǎng)液提取 取3～5代大鼠BMMSCs鋪滿皿底80%時，使用僅含雙抗的低糖DMEM進行培養(yǎng)，48h后收集上清液，4℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 凝膠制備 實驗組： 取BMMSCs培養(yǎng)液上清液，每毫升加入0.045g瓊脂糖粉劑，烘箱加熱至37℃溶解，冷卻至室溫凝結(jié)后即投入實驗使用。對照組： 各自取3～5代大鼠BMMSCs和PDLCs離心(離心半徑30cm，2000r/min，5min)，棄上清液。離心后的BMMSCs及PDLCs，以PBS稀釋混勻，維持細胞濃度為3×105/mL?；靹?，每毫升中加入0.045g瓊脂糖粉劑，加熱至37℃溶解，冷卻至室溫凝結(jié)后即投入實驗使用。

1.2.6 ELISA檢測BMMSCs培養(yǎng)液 取實驗組預(yù)備好的BMMSCs培養(yǎng)液、對照組不含血清的低糖DMEM，按試劑盒說明制備檢測樣品，對IGF-1、VEGF、PDGF-BB、BMP-2進行檢測。

1.2.7 BMMSCs-CM誘導(dǎo)后RT-PCR及Western印跡法檢測 分別利用實驗組BMMSCs的培養(yǎng)液上清及對照組含10%FBS及雙抗的低糖DMEM的常規(guī)培養(yǎng)液對PDLCs進行培養(yǎng)，48h后收集兩組PDLCs，提取總RNA，按照TRIzol Reagent試劑盒說明，將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA。按RT-PCR試劑盒說明進行反轉(zhuǎn)錄及cDNA擴增，再后對OPN、OCN、Runx2進行RT-PCR檢測。將兩組誘導(dǎo)后的PDLCs，采用RIPA法提取細胞蛋白，依BCA法檢測蛋白濃度并統(tǒng)一上樣，15%分離膠和5%濃縮膠行SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，放入BSA封閉液中搖床上2h，一抗孵育過夜，二抗孵育2h，行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。分析牙周膜細胞OPN、OCN、Runx2蛋白表達情況。

表1 RT-PCR引物序列

1.2.8 大鼠牙周缺損模型制備 取同批次6周齡雄性SD大鼠，將大鼠隨機分為4組，每組8只。1%戊巴比妥鈉麻醉后，用微創(chuàng)牙齦分離器和刀片翻開左下頜第一磨牙頰側(cè)牙齦，使用低速裂鉆并以裂鉆直徑為標準，生理鹽水冷卻下磨除范圍為近根到遠中根，高度為1mm，見圖1。分別向各組缺損中填充預(yù)備好的材料，術(shù)后嚴密縫合，無需放置牙周塞治劑，術(shù)中隨時吸取血液、唾液及生理鹽水。術(shù)后正常飲食。填充材料后4周每組處死3只，8周每組處死5只大鼠，分離左側(cè)下頜骨，4%多聚甲醛中體外固定48～72h。

圖1 左下頜第一磨牙磨除頰側(cè)牙槽骨后橫斷面示意圖Fig.1 The cross section of the first molar of the left mandible

1.2.9 Micro-CT掃描及分析 利用Micro-CT系統(tǒng)在0.5mm鋁濾過、70kV電壓和200μA電流的條件下，將取下的頜骨以15μm分辨率掃描并三維重建。每個樣本均選擇其中有效的195張二維圖像，勾畫出第一磨牙頰側(cè)及根分叉區(qū)自牙根尖至牙槽嵴頂?shù)难啦酃峭鈬喞?，利用系統(tǒng)自帶軟件計算，新生骨率，公式如下：

BVd表示術(shù)后即刻處死的大鼠下頜第一磨牙頰側(cè)及根分叉區(qū)牙槽骨體積；BVc表示術(shù)前處死的同齡同批次未經(jīng)處理的大鼠同區(qū)域牙槽骨體積；BVd‘表示術(shù)后4周及8周處死的大鼠下頜第一磨牙頰側(cè)及根分叉區(qū)牙槽骨體積；BVc’表示術(shù)后4周及8周處死的同齡同批次未經(jīng)處理的大鼠同區(qū)域牙槽骨體積；BVd/BVc表示術(shù)后即刻剩余骨率；BVd‘/BVc’表示術(shù)后4周或8周剩余骨率；1-BVd/BVc表示術(shù)后即刻骨缺損率。

1.2.10 組織學(xué)分析 用EDTA-甘油溶液完全脫鈣后，沖水，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，浸蠟后石蠟包埋，切片。H-E染色： 切片脫蠟入水，蘇木精染色8min，沖水返藍，伊紅染色2min，沖水，梯度脫水，透明，封片。40倍光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

利用SPSS20.0軟件對RT-PCR及Micro-CT所得數(shù)據(jù)進行t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠BMMSCs

體外培養(yǎng)原代大鼠BMMSCs，24h后部分貼壁，48～72h后可觀察到少量短梭形或多角形細胞貼壁，1～2d后呈集落狀生長，5～7d后細胞匯合達到80%，可消化傳代。傳代后細胞呈梭形，P3～P5代細胞增殖迅速，形態(tài)穩(wěn)定，見圖2。

圖2 大鼠BMMSCs形態(tài)(×100)Fig.2 Morphology of BMMSCs(×100)

2.2 人牙周膜細胞

用組織塊法培養(yǎng)PDLCs，5～7d內(nèi)貼壁組織塊邊緣有細胞爬出，呈長梭形，數(shù)量隨培養(yǎng)時間增加而增多。15～18d后細胞匯合達到80%，可消化傳代。傳代后細胞呈梭形，P3～P5代細胞增殖迅速，形態(tài)穩(wěn)定，見圖3。

圖3 人牙周膜細胞形態(tài)(×100)Fig.3 Morphology of PDLCs(×100)

2.3 生長因子含量檢測結(jié)果

實驗組培養(yǎng)液內(nèi)檢測到IGF-1含量約1084.027pg/mL, VEGF含量約5.073pg/mL，未檢測到PDGF-BB及BMP-2。對照組常規(guī)培養(yǎng)液內(nèi)則未檢測到任何生長因子。表明BMMSCs分泌了大量的生長因子，并累積在培養(yǎng)液中。

2.4 誘導(dǎo)培養(yǎng)后相關(guān)基因的表達

RT-PCR檢查結(jié)果顯示： BMMSCs培養(yǎng)液誘導(dǎo)組的骨相關(guān)基因OPN、OCN、Runx2表達均增高(P<0.05)，見表2。Western印跡法檢測結(jié)果顯示： 經(jīng)BMMSCs培養(yǎng)液誘導(dǎo)后，OPN、OCN、Runx2表達增高，優(yōu)于常規(guī)培養(yǎng)液培養(yǎng)效果(P<0.05)，結(jié)果與RT-PCR一致，見圖4。

表2 RT-PCR檢測結(jié)果

圖4 Western印跡法檢測相關(guān)蛋白的表達Fig.4 Detection of related proteins by Western blotting與DMEM培養(yǎng)基比較，*P<0.05

2.5 Micro-CT三維重建

術(shù)后4周和8周的Micro-CT三維重建結(jié)果顯示： 8周時，實驗組大鼠下頜骨第一磨牙頰側(cè)牙槽骨恢復(fù)情況較好，已基本恢復(fù)牙槽骨術(shù)前形態(tài)。對照組及空白組牙槽骨恢復(fù)較差，見圖5。

圖5 術(shù)后4周及8周左側(cè)下頜骨micro-CT三維重建Fig.5 Micro-CT 3D reconstructions of the Mandible in 4 weeks and 8 weeks after the operation

2.6 Micro-CT定量分析結(jié)果

Micro-CT三維掃描結(jié)果顯示： 4周時，各組新生骨率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。8周時，實驗組新生骨率明顯高于對照組及空白組(P<0.05)，見表4。

表4 各組8周時新生骨率

2.7 組織學(xué)表現(xiàn)

H-E染色結(jié)果顯示： 4周時，各組第一磨牙頰側(cè)牙槽骨在術(shù)后恢復(fù)的形態(tài)影像學(xué)表現(xiàn)無統(tǒng)計學(xué)意義，故僅對8周時做比較。術(shù)后8周的切片結(jié)果顯示，實驗組和對照組近中根頰側(cè)均出現(xiàn)不同程度骨覆蓋，形態(tài)不規(guī)則，由于在牙根標記切線制作過程中及術(shù)后恢復(fù)過程中，出現(xiàn)生理等不可預(yù)見問題，且切片過程中，切片角度及包埋角度無法做到完全一致，故該結(jié)果只能作為參考，無法進行統(tǒng)計學(xué)分析，見圖6。對部分實驗組切片頰側(cè)進行放大，可見牙周膜結(jié)構(gòu)，見圖7。

圖6 8周時左下頜第一磨牙近中根雙側(cè)改建H-E染色(×4)Fig.6 H-E staining of the rat mandibular first molar(×4)

圖7 8周時實驗組左下頜第一磨牙近中根頰側(cè)改建H-E染色結(jié)果(×40)Fig.7 H-E staining of the rat mandibular first molar buccal side(×40)箭頭處為牙周膜

3 討 論

PDLCs是一組異質(zhì)性的細胞群，由成纖維細胞、成骨細胞、成牙骨質(zhì)細胞及未分化的間充質(zhì)干細胞多種細胞組成。Wang等[4]發(fā)現(xiàn)： 牙周膜干細胞更多存在于牙槽骨表面的牙周膜中，分離培養(yǎng)的牙槽骨表面的牙周膜干細胞具有較強的增殖能力和成骨成纖維分化的潛能。PDLCs是最具有牙周結(jié)締組織附著再生能力的細胞，但仍然難以滿足臨床治療和實驗研究的需求。BMMSCs雖對很多特殊疾病有療效，但實際操作中，常有移植后2d到數(shù)周，細胞消失的情況[5]。故Chen等[6]提出BMMSCs移植至缺損處后，其生長因子及細胞因子的分泌能刺激缺損周邊的旁分泌因素，并能在BMMSCs的培養(yǎng)液中累積。

Osugi等[7]利用BMMSCs培養(yǎng)液制備凝膠，填入大鼠顱骨缺損，成功促進骨缺損的再生。從發(fā)育角度看，頜骨與其他顱面部骨骼一樣來自于神經(jīng)外胚層的神經(jīng)嵴細胞[8]，而細胞培養(yǎng)液易于獲取，且其數(shù)量巨大，如其也能通過刺激牙周缺損處的旁分泌因素，從而達到了修復(fù)牙周缺損的效果，則為牙周組織的再生提供了新的途徑和可能。

本實驗通過ELISA法對BMMSCs培養(yǎng)液及低糖DMEM中的生長因子濃度進行檢測，僅在培養(yǎng)液中檢測到VEGF及IGF-1，未檢測到其他指標，DMEM中則未檢測到任何生長因子。表明BMMSCs分泌了大量的生長因子，并累積在培養(yǎng)液中。

Runx2在成骨分化的信號過程中起核心作用，能誘導(dǎo)細胞向成骨細胞定向分化。OCN、OPN是細胞質(zhì)和胞外分泌蛋白，是成骨分化的重要指標。利用BMMSCs培養(yǎng)液對PDLCs進行48h的培養(yǎng)后，對以上指標進行RT-PCR和Western印跡法的分析，對比于常規(guī)培養(yǎng)液培養(yǎng)的PDLCs，三組指標均顯示BMMSCs培養(yǎng)液組表達較高。這說明BMMSCs培養(yǎng)液中含有的大量生長因子可以促進PDLCs向成骨分化。綜上分析得出如下結(jié)論： (1) 種子細胞可分泌大量生長因子，并在培養(yǎng)液中累積；(2) 經(jīng)過BMMSCs培養(yǎng)液誘導(dǎo)培養(yǎng)后的細胞，成骨能力增強，更有利于牙周組織的再生。

目前,尚無相關(guān)利用細胞培養(yǎng)液恢復(fù)牙周組織的研究，且本課題組前期研究利用BMMSCs和PDLCs雙膜片與牙根復(fù)合進行了動物的原位移植(牙生物性種植)，系單個牙位實驗，故本實驗亦選擇單個磨牙牙位(大鼠下頜第一磨牙近遠中約1mm)的頜骨范圍為實驗區(qū)域。本實驗將PDLCs及BMMSCs兩種種子細胞及BMMSCs的培養(yǎng)液分別制備凝膠，放入統(tǒng)一規(guī)格的牙周缺損模型處進行比較，Micro-CT分析結(jié)果表明，同等情況下，BMMSCs培養(yǎng)液比細胞更能促進和誘導(dǎo)缺失的頜骨再生。BMMSCs-CM組的統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果顯示，牙槽骨恢復(fù)情況已接近術(shù)前狀態(tài)。組織學(xué)分析結(jié)果提示，BMMSCs-CM組恢復(fù)了部分牙周膜結(jié)構(gòu)。

在頜骨微環(huán)境(micro-environment)中，多種細胞與細胞外基質(zhì)及體內(nèi)的各種細胞因子相互作用共同促成了組織發(fā)育的過程，在此過程中，各種信號分子通過微環(huán)境調(diào)控，導(dǎo)致了細胞的遷移，增殖和分化。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)軀干骨的BMSCs通過血管通道到達牙周組織參與修復(fù)[9]?？梢?，頜骨微環(huán)境十分復(fù)雜，且與牙周組織的再生密不可分。目前，已有多種生物活性分子已被證明具有較強的促進牙周組織修復(fù)的功能，包括TGF-β、IGF、BMP、PDGF、bFGF、EMD[10-12]等。

綜上所述，BMMSCs培養(yǎng)液在頜骨微環(huán)境中能更好地刺激原位細胞再生，這可能是由于BMMSCs培養(yǎng)液內(nèi)可能累積了大量可以刺激缺損周邊的旁分泌因素的細胞因子等。但并非所有實驗組大鼠都恢復(fù)了牙周膜結(jié)構(gòu)，這可能是因為： (1) 缺損模型制備時可能牙骨質(zhì)受到損傷，導(dǎo)致恢復(fù)時牙本質(zhì)與牙槽骨直接結(jié)合，從而未能有效形成牙骨質(zhì)及牙周膜結(jié)構(gòu)；(2) 所使用的大鼠BMMSCs并非來自頜骨，而是來自軀干骨，頜骨微環(huán)境相當復(fù)雜，非自體原位的細胞受到的不利影響較多；(3) 術(shù)后恢復(fù)過程中有炎癥的存在，導(dǎo)致牙周膜結(jié)構(gòu)無法正常形成。

結(jié)合本實驗結(jié)果，BMMSCs培養(yǎng)液在頜骨微環(huán)境中能更好的刺激各種信號分子，增強缺損周邊乃至軀干骨的相關(guān)細胞向缺損處遷徙，從而達到修復(fù)牙周組織的效果。這可能是由于BMMSCs培養(yǎng)液中積累了大量能刺激旁分泌因素的生長因子等。這為牙周組織再生提供了新的途徑，但培養(yǎng)液利用旁分泌因素的具體機制，仍需進一步探討。

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