金秋霞，白建洋，金麗華

(東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

枸杞子(LyciumbarbarumL.)為茄科植物，是馳名中外的名貴中藥材，具有增強(qiáng)免疫、降血脂、抗脂肪肝、抗腫瘤、抗衰老、抗應(yīng)激等多種生理功效[1-2]。

糖尿病是一組由遺傳和環(huán)境等多種病因引起的以慢性高血糖為特征的代謝性疾病群。截止2016年末，我國(guó)糖尿病患病率大于11.3%，患者達(dá)到1.14億，已成為糖尿病第一大國(guó)。糖尿病主要分為兩大類，Ⅰ型糖尿病和Ⅱ型糖尿病。Ⅰ型糖尿病的特征是缺乏胰島素分泌能力，需要注射胰島素進(jìn)行治療。Ⅱ型糖尿病是人體無法有效利用胰島素，需口服降糖藥物進(jìn)行干預(yù)治療，癥狀可能與Ⅰ型糖尿病相似[3]。糖尿病患者的典型癥狀是“三多一少”，即血糖增高、尿量增多、飲食增多、體重下降，并伴有多種并發(fā)癥。西醫(yī)治療糖尿病主要通過口服降糖藥物，注射胰島素以及控制飲食等方法。目前中藥對(duì)糖尿病的控制和治療已經(jīng)越來越廣泛[4]，通過中藥可以起到治本的作用，防止糖尿病綜合癥的發(fā)生。果蠅作為重要模式生物，具有生長(zhǎng)周期短、繁殖能力強(qiáng)、成本低、與人類高度相關(guān)等特點(diǎn)，尤其適用于成分復(fù)雜的中藥的活性評(píng)價(jià)與篩選[5-6]。本研究采用果蠅喂食高糖飲食誘導(dǎo)其形成胰島素抵抗模型，通過分析脂肪油滴大小、生長(zhǎng)速度、蛹?xì)っ娣e及體積、成體果蠅體重等，研究枸杞子提取物對(duì)該模型果蠅生長(zhǎng)發(fā)育的影響。本實(shí)驗(yàn)可以為利用果蠅快速篩選具有降糖作用的中藥，以及開發(fā)新的降糖藥物提供理論基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 藥材與試劑

枸杞子購(gòu)于哈爾濱人民同泰藥店；phalloidin和BODIPY493/503購(gòu)于ThermoFiser公司；Hochest購(gòu)于Sigma公司；其它試劑均為分析純。

1.2 果蠅

野生型w1118品系黑腹果蠅Drosophila melanogaster為本實(shí)驗(yàn)室保存，果蠅培養(yǎng)箱溫度為25℃、相對(duì)濕度60%。

1.3 儀器

ALC-210.4型電子分析天平，北京賽多利斯公司；Elix5去離子水系統(tǒng)，Millipore公司； Axioskop 2plus型熒光顯微鏡，Zeiss公司。

2 方法

2.1 枸杞子水提物的制備

稱取枸杞子20 g置于200 mL去離子水中浸泡12 h，小火煮沸3 h，用紗布濾過，再加入200 mL去離子水重復(fù)提取1次，將兩次提取液合并后煮沸濃縮至200 mL，4℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 培養(yǎng)基配制

正常培養(yǎng)基：培養(yǎng)基配置參見文獻(xiàn)方法[7]。

高糖培養(yǎng)基：玉米粉14.24 g,酵母粉3.36 g,黃豆粉1.92 g,瓊脂1.12 g,蔗糖60 g定容至100 mL，加熱攪拌后降溫至室溫加入丙酸0.94 mL制成60%高糖培養(yǎng)基，取10 g該培養(yǎng)基和10 mL去離子水稀釋至30%高糖培養(yǎng)基。

枸杞子高糖培養(yǎng)基：稱取60%高糖培養(yǎng)基10 g，加入5 mL去離子水和5 mL枸杞子提取液，配制成5%枸杞子高糖培養(yǎng)基；稱取60%高糖培養(yǎng)基10 g，加入10 mL枸杞子提取液，配制成10%枸杞子高糖培養(yǎng)基。

2.3 果蠅幼蟲脂肪油滴染色

普通培養(yǎng)基和高糖培養(yǎng)基中孵化的果蠅作為對(duì)照組，枸杞子高糖培養(yǎng)基中孵化的果蠅作為實(shí)驗(yàn)組。收集各組三齡幼蟲，提取其脂肪體，在4%多聚甲醛中固定30 min，用phalloidin染細(xì)胞膜30 min，1 mg/mL BODIPY493/503脂肪油滴染色30 min，Hochest細(xì)胞核染色10 min，每次換染料之前均用PBST (PBS+0.1% Tween20)洗3～4次，每次5～10 min。最后用Slow fade封片，在顯微鏡下觀察并照相，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次。

2.4 果蠅幼蟲的生長(zhǎng)速度測(cè)定

用接卵器將果蠅受精卵接于各組培養(yǎng)基內(nèi)，分別在120 h、144 h、168 h挑取幼蟲，液氮冷凍后將幼蟲整齊擺放在載玻片上，保證其形態(tài)整齊完整，于顯微鏡下進(jìn)行觀察并照相，測(cè)量并分析其相同培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)的相對(duì)大小，計(jì)算方法參見文獻(xiàn)[8]，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次。

2.5 果蠅個(gè)體大小的測(cè)定

分別收集各組羽化時(shí)間相同的雌雄果蠅，二氧化碳麻醉后照相并進(jìn)行個(gè)體大小比較；隨機(jī)收集各組已經(jīng)孵化出成蟲果蠅的蛹?xì)び谳d玻片上，在顯微鏡下觀察并照相，并對(duì)其面積及體積進(jìn)行分析統(tǒng)計(jì)。方法是用Image J軟件直接測(cè)量得出蛹?xì)っ娣e、長(zhǎng)度(L)和寬度(l)，根據(jù)公式4/3π(L/2)(l/2)2計(jì)算得出體積[8]，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次。

2.6 成蟲果蠅體重的測(cè)定

分別收集各組羽化3～5天的果蠅成蟲30只，裝入已稱好質(zhì)量的離心管中，進(jìn)行稱量并比較，實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次。

3 結(jié)果

3.1 對(duì)果蠅脂肪油滴大小的影響

為了分析脂肪油滴大小，提取三齡幼蟲脂肪體進(jìn)行染色。果蠅的脂肪體相當(dāng)于哺乳動(dòng)物肝臟和脂肪組織以及感光細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)感測(cè)組織[9]。分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，喂食高濃度蔗糖的果蠅脂肪體脂滴遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于喂食正常培養(yǎng)基的果蠅，但是，添加5%枸杞子提取物的實(shí)驗(yàn)組脂滴比只喂食高糖培養(yǎng)基的果蠅略有縮小，添加10%枸杞子提取物的果蠅脂肪體脂滴則明顯縮小。此結(jié)果說明枸杞子提取物明顯改善脂肪體油滴大小，且濃度為10%的實(shí)驗(yàn)組效果較5%的更明顯 (圖1)。

圖1 枸杞子提取物對(duì)喂食蔗糖果蠅幼蟲 脂肪油滴大小的影響

3.2 對(duì)果蠅生長(zhǎng)速度的影響

相同培養(yǎng)條件下，各組果蠅在不同培養(yǎng)基中生長(zhǎng)相同時(shí)間，分別收集生長(zhǎng)到120 h、144 h、168 h的果蠅幼蟲 (圖2A為不同時(shí)間段幼蟲)，放在載玻片上拍照。結(jié)果表明，培養(yǎng)相同時(shí)間后，喂食枸杞子提取物的實(shí)驗(yàn)組較僅喂食高糖的果蠅幼蟲生長(zhǎng)速度更快。培養(yǎng)120 h后，喂食5%和10%枸杞子分別比對(duì)照組快38.2%和23.5%；培養(yǎng)144 h后，喂食5%和10%枸杞子分別比對(duì)照組快59.7%和23.2%；培養(yǎng)168 h后，喂食5%和10%枸杞子分別比對(duì)照組快50.3%和3.0%，而且喂食5%枸杞子的果蠅生長(zhǎng)速度高于喂食10%枸杞子的幼蟲(圖2)。

3.3 對(duì)果蠅個(gè)體大小的影響

收集各組成蛹或羽化時(shí)間相同的果蠅，利用顯微鏡拍照并比較蛹期和成蟲大小。僅喂食高糖的果蠅蛹期面積及體積較正常的果蠅顯著變小，與僅喂食高糖組比較，添加5%枸杞子提取物的實(shí)驗(yàn)組蛹期面積和體積略有增大，喂食10%枸杞子提取物的實(shí)驗(yàn)組則顯著增大(圖3A)。另外，分析了從蛹孵化出的成蟲大小，僅喂食高糖的成體雌雄果蠅較正常培養(yǎng)基的果蠅明顯偏小，而喂食5%的枸杞子提取物的實(shí)驗(yàn)組果蠅略有增大，喂食10%的枸杞子提取物的不管是雌果蠅還是雄果蠅，大小均明顯增大。實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了枸杞子提取物明顯改善果蠅個(gè)體大小 (圖3B)。

圖3 枸杞子提取物對(duì)喂食蔗糖果蠅蛹 和成蟲大小的影響

3.4 對(duì)成體果蠅體質(zhì)量的影響

收集羽化3～5天成體果蠅，雌雄果蠅分開，30只為一組，利用分析天平稱重。結(jié)果表明，喂食高濃度蔗糖的雌雄果蠅體質(zhì)量與正常培養(yǎng)基的果蠅相比均顯著下降，而添加5%枸杞子提取物的果蠅體質(zhì)量較喂食高糖的雌雄果蠅略有增加；喂食10%枸杞子提取物雌性果蠅體質(zhì)量明顯增加，但是，雄性果蠅只是略有增加(圖4)。結(jié)果表明枸杞子提取物對(duì)雌果蠅體質(zhì)量具有明顯的改善作用。

圖4 枸杞子提取物對(duì)喂食蔗糖成體 果蠅體重的影響

4 討論

枸杞子為常用中藥之一，它在我國(guó)的傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中具有重要的地位。其化學(xué)成分含多糖(LBP)、類胡蘿卜素及類胡蘿卜素酯、維生素C、類黃酮等[10]?，F(xiàn)代臨床研究表明枸杞子具有降低血脂、血糖、保肝、抗腫瘤、抗衰老等藥理作用[11]。近年來，糖尿病患者人數(shù)與日俱增，這與長(zhǎng)期的不規(guī)律不健康的生活方式息息相關(guān)，長(zhǎng)期的高糖會(huì)造成胰島β細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，對(duì)胰島β細(xì)胞分泌胰島素的功能和細(xì)胞活力產(chǎn)生不同程度的損傷，導(dǎo)致其功能障礙和凋亡，進(jìn)而促使Ⅱ型糖尿病的發(fā)生[12]。

本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了高糖飲食誘導(dǎo)的胰島素抵抗果蠅模型，此模型的果蠅表現(xiàn)為生長(zhǎng)速度減慢，蛹?xì)ぜ俺上x顯著變小，脂肪油滴明顯變大等諸多胰島素抵抗病癥。為分析枸杞子提取物對(duì)胰島素抵抗果蠅模型的緩解作用，本實(shí)驗(yàn)通過喂食5%及10%枸杞子提取物來進(jìn)一步驗(yàn)證果蠅脂肪油滴和生長(zhǎng)狀態(tài)等。結(jié)果顯示，枸杞子提取物明顯改善脂肪油滴大小和生長(zhǎng)發(fā)育，對(duì)胰島素抵抗模型具有明顯緩解作用，而且濃度越高效果越明顯。中藥治療作為II型糖尿病的藥物療法之一被廣泛被應(yīng)用[13]，此結(jié)果為枸杞子及其他中藥在用于糖尿病治療的開發(fā)與利用提供了新思路。

[1] 王靜.枸杞子的藥理作用和臨床應(yīng)用價(jià)值分析[J].亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥,2014,10(7):50-51.

[2] 段文杰.枸杞子的藥理作用及價(jià)值[J].黑龍江醫(yī)藥,2013,26(1):127-128.

[3] 李艷君,路惠民,馮彥景.復(fù)方抗糖尿病藥物治療2型糖尿病臨床應(yīng)用進(jìn)展[J].實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志,2014,30(14):2330-2332.

[4] 張瑩瑩，關(guān)璐，周妍妍.御唐丸對(duì)2型糖尿病大鼠氧化應(yīng)激的影響[J].中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2016，44(5)：55-57.

[5] 周洋,劉宗琳,陳羽臣,等.瓜蔞、紅花、川芎和菊花提取物對(duì)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的果蠅腸道免疫的影響[J].中草藥,2014,45(15):2194-2200.

[6] 華永慶,朱悅,江帆,等.模式生物果蠅在中藥活性評(píng)價(jià)及其治療功效表征中的應(yīng)用與展望[J].中國(guó)中藥雜志,2016,41(18):3307-3313.

[7] 李文佳,劉強(qiáng),金麗華.刺五加提取物對(duì)果蠅免疫功能的影響[J].中草藥,2012,43(10):1997-2001.

[8] FedericaParisi,Sara Riccardo,Sheri Zola,et al.DMyc expression in the fat body affects DILP2 release and increases the expression of the fat desaturase Desat1 resulting in organismal growth[J].Developmental Biology,2013,379:64-75.

[9] Kohyama-Koganeya A,Kim YJ,Miura M,et al.A Drosophila orphan Gprotein-coupled receptor BOSS functions as a glucose-responding receptor: loss of boss causes abnormal energy metabolism[J].Proc Natl Acad Sci USA,2008,105(40):15328-15333.

[10] 滕俊,袁佳,葉莎莎.枸杞子化學(xué)成分及藥理作用相關(guān)性概述[J].海峽藥學(xué),2014,26(6):36-37.

[11] 周晶,李光華.枸杞子的化學(xué)成分與藥理作用研究綜述[J].遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2009,11(6):93-95.

[12] 饒建華,陳廷勝,禹騰波.糖尿病治療藥物-胰島素研究進(jìn)展[J].中國(guó)實(shí)用醫(yī)藥,2009,4(29):220-222.

[13] 馬立新.中藥治療2型糖尿病隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)的系統(tǒng)綜述及方法學(xué)評(píng)價(jià)研究[D].北京:北京中醫(yī)藥大學(xué),2012.