邢宇雙 ，吳宜艷* ，梁啟超 ，楊志，趙容杰，Young Seob Gwak

(1.牡丹江醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，黑龍江 牡丹江 157011；2.牡丹江醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院， 黑龍江 牡丹江 157011；3.大邱醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，韓國 大邱 706-828)

近年來，人們生活方式不斷改善，社會節(jié)奏加快，經(jīng)濟(jì)壓力和人際關(guān)系等問題日益突出，酗酒者人數(shù)也隨之增加，目前在世界范圍內(nèi)，酒精依賴不僅嚴(yán)重?fù)p害個人身心健康、也是家庭暴力和犯罪的重要根源。隨著我國生活水平的不斷改善，飲酒成癮者也逐年增多，數(shù)據(jù)表明，我國酒精的生產(chǎn)與消耗量呈逐年遞增的趨勢，而流行病學(xué)研究也顯示酒精濫用和依賴問題日益增多[1-2]。酒精戒斷焦慮癥是酒精戒斷情感障礙的主要表現(xiàn)，是導(dǎo)致酒精依賴者停用酒精后又重新強(qiáng)迫性覓酒的重要誘因之一[3]。酒精戒斷焦慮癥在酒精依賴的重要地位不僅表現(xiàn)在它是大多數(shù)酒精中毒患者的主要精神主訴，還通過目前主要用于治療酒精依賴的有效藥，苯二氮類是抗焦慮藥的事實(shí)所支持。因此，通過阻斷酒精戒斷焦慮癥而消除酒精依賴是非常有效而可行的治療手段[4-5]。

乙醇是一種中樞神經(jīng)抑制劑，它可同時影響很多中樞系統(tǒng)，酒精成癮是一個通過犒賞機(jī)制反復(fù)強(qiáng)化的過程，中腦邊緣多巴胺系統(tǒng)在這一過程中起到重要作用，另外內(nèi)源性阿片系統(tǒng)紊亂和中樞稿賞系統(tǒng)失衡是造成酒精成癮的重要原因[6]。機(jī)體內(nèi)源性阿片肽通過受體多種信號傳導(dǎo)系統(tǒng)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)各種代謝過程，從而維持生理穩(wěn)態(tài)。大量研究證實(shí)，焦慮癥與中樞神經(jīng)遞質(zhì)去甲腎上腺素(NE)和五羥色胺(5-HT)功能障礙有關(guān)[7]。其中NE廣泛作用于不同的腦區(qū)，調(diào)控覺醒和應(yīng)激反應(yīng)，其主要功能是通過對外界環(huán)境刺激作出反射，控制覺醒狀態(tài)。NE系統(tǒng)功能失調(diào)可導(dǎo)致焦慮的發(fā)生。有研究證實(shí)，NE濃度升高可引起焦慮不安，容易煩躁和激怒，還可引起睡眠障礙、食欲下降、眩暈、心悸等癥[8]。

覆盆子為薔薇科懸鉤子屬植物，具有補(bǔ)腎固精、助陽等功效。大量研究表明覆盆子果實(shí)中富含鞣花酸、多糖、花青素、超氧化物、多酚類、黃酮、超氧化物歧酶等[9-10]，具有抗衰老、治療泌尿道感染、減肥、抗癌防癌、保護(hù)心臟、抗氧化、降血脂、降血糖、防止心血管疾病等藥理作用[11-17]，但針對覆盆子的抗焦慮作用卻鮮有報道。本實(shí)驗(yàn)研究覆盆子提取物對酒精戒斷大鼠焦慮征的作用，并探討其作用機(jī)制，為覆盆子的功能開發(fā)提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

健康Sprague-Dawley(SD)大鼠(220～250 g)：由牡丹江醫(yī)學(xué)院動物室提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

覆盆子：購于牡丹江天利醫(yī)藥(經(jīng)生藥學(xué)鑒定為薔薇科懸鉤子屬植物華東覆盆子的果實(shí))；無水乙醇：哈爾濱市新達(dá)化工廠批號140720分析純；氯化鈉注射液(0.9%)：哈爾濱三聯(lián)藥業(yè)有限公司,批號140409F3；磷酸二氫鉀：天津博迪化工股份有限公司,批號140606分析純；去甲腎上腺素鹽酸鹽：上?；鶎?shí)藥業(yè)有限公司,批號20140513；甲醇：天津市永大化學(xué)試劑有限公司,批號20150104,色譜純；高氯酸：哈爾濱試劑化工廠,批號20141201,分析純。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

高效液相色譜儀LC2103：上海天美科學(xué)儀器有限公司Kromasil 100-5C18(250 mm×4.6 mm)；離心機(jī)：eppendorf centrifuge 5424；勻漿機(jī)：motor cordless749540-0000；高架十字迷宮：上海欣軟信息科技有限公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 覆盆子提取物的制備

取干燥的中藥覆盆子500 g磨成細(xì)粉，于乙醇中回流提取，過濾，減壓蒸發(fā)，凍干。提取物根據(jù)凍干粉的干重估計，產(chǎn)率為10.6%。

2.2 建立酒精成癮模型

選取健康SD(Sprague-Dawley)大鼠35只，體質(zhì)量220～250 g，隨機(jī)分為空白組(生理鹽水)，模型組(20%Eth)，覆盆子高劑量組(20%Eth+覆盆子提取物180 mg/kg)，覆盆子中劑量組(20%Eth+覆盆子提取物120 mg/kg)，覆盆子低劑量組(20%Eth+覆盆子提取物60 mg/kg)，陽性藥物組(DZP)。除空白組外，其余5組均每天腹腔內(nèi)注射20%(w/v)酒精(ethanol)1.5 mL/100 g，共28 d，制備酒精戒斷焦慮癥模型，覆盆子高、中、低劑量組灌胃覆盆子提取物(180，120，60 mg/kg)，陽性藥物組灌胃地西泮(5 mg/kg)，每天1次，共給3 d，最后一次給藥1 h后，所有大鼠單獨(dú)在高架十字迷宮(EPM)中進(jìn)行焦慮行為指標(biāo)測試。

2.3 行為學(xué)指標(biāo)測試

高空十字架是由2 個開放臂和2個閉合臂以及1個中心部分(10 cm×10 cm)組成。若大鼠在開放臂的時間探索增加，那么其焦慮程度較低，若大鼠在開放臂的探索時間減少，那么其焦慮程度較高。實(shí)驗(yàn)室內(nèi)光線昏暗并保持恒亮，室溫24℃，并保持安靜。將每只大鼠置于高空十字架(EPM)的正中央(頭面向開放臂)釋放，大鼠在迷宮中的行為被視頻跟蹤系統(tǒng)自動記錄，每只大鼠測試時間為5 min，實(shí)驗(yàn)人員在距離測試箱2 m處觀察并記錄下大鼠的活動狀況。每一只動物完成測試后，清理糞便，并對裝置用酒精進(jìn)行徹底清潔消毒。

測試指標(biāo)：進(jìn)入到開放臂次數(shù)(OEopen armentry)：即進(jìn)入到任一開放臂的次數(shù)，以大鼠 4 個爪均進(jìn)入到臂內(nèi)開始，中途有1個爪從該臂中完全撤出，那么該次進(jìn)入活動完成；進(jìn)入到開放臂的時間(OTopen arm time)：進(jìn)入到開放臂停留的時間，單位：秒(s)；進(jìn)入到閉合臂次數(shù)(CEclose arm entry)：即進(jìn)入到任一閉合臂的次數(shù)，以大鼠 4個爪均進(jìn)人到臂內(nèi)開始；進(jìn)人到閉合臂時間(CTclosearm time)，進(jìn)入到閉合臂停留的時間，單位：秒(s)。由以上指標(biāo)分別計算出：①進(jìn)入到開放臂和閉合臂的總次數(shù)(OE+CE)：表示小鼠的自發(fā)活動( locomotor activity)；②進(jìn)開放臂次數(shù)比例(OE%)=OE/(OE+CE)×100%；③開放臂停留時間比例(OT%)=OT/(OT+CT)×100%。

2.4 海馬中去甲腎上腺素(NE)的含量測定

所有大鼠都完成高架十字迷宮(EPM)測試后，立即將每只大鼠斷頭處死，剪開顱蓋和腦膜，剝離組織后，將大腦放在冰盤上，迅速取出左右兩側(cè)海馬，稱重后，立刻放入-80℃的液氮中保存，之后轉(zhuǎn)移到-80℃低溫冰箱里存放。

繪制線性回歸方程取去甲腎上腺素(NA)標(biāo)準(zhǔn)品約2.5 mg，精密稱定，用0.1 mol/L HClO4溶解并定容到50 mL作為對照品貯備液。精密吸取貯備液10、20、40、80、160 μL，分別稀釋成1.25、2.5、5、10、20 ng/μL，以濃度(c)為橫坐標(biāo)(X)，峰面積(A)為縱坐標(biāo)(Y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并進(jìn)行線性回歸，得出回歸方程。

海馬中去甲腎上腺素(NE)的含量測定在海馬樣品中加入-4℃保存的0.1 mol/L高氯酸處理液0.1 g/mL，置于冰水混合物中用勻漿機(jī)勻漿1 min。將上述物質(zhì)放入離心機(jī)中，以15 000 rpm離心20 min，吸取上清液。將上清液再次以15 000 rpm離心20 min，上清液以0.22 μm的微孔濾膜過濾。以50 μL微型注射器吸取20 μL進(jìn)樣，高效液相色譜系統(tǒng)檢測。

色譜條件色譜柱為Kromasi l00-5Cl8(4.6 mm×250 mm)，流動相為甲醇-磷酸二氫鉀(0.15 mol/L pH=5.5)=1:9等度洗脫，流速為1 ml/min，室溫，波長280 nm，樣品中各主要組分用外標(biāo)法進(jìn)行定量。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 覆盆子水提物對大鼠OE%和OT%的影響

表1 覆盆子對EPM大鼠進(jìn)入開放臂次數(shù)比(OE%)、 開放臂停留時間比(OT%)的影響

注：與空白組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01

結(jié)果顯示(表1)：在高架十字迷宮中，與空白對照組相比，酒精戒斷大鼠在開放臂的逗留次數(shù)、時間明顯減少(P<0.01)；與模型組相比，高劑量覆盆子提取物顯著地增加其次數(shù)、時間(P<0.05)，而中、低劑量覆盆子提取物作用效果不明顯(P>0.05)。

3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖1 去甲腎上腺素標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線

由圖1可以看出去甲腎上腺素的線性回歸方程為y=3434x+59283(R2=0.990 4)。

3.3 海馬中NA的含量

結(jié)果顯示(圖2)：與空白對照組相比，酒精成癮大鼠海馬中去甲腎上腺素的含量顯著升高(P<0.01)，與模型組相比，高劑量覆盆子可降低海馬中去甲腎上腺素含量(P<0.05)，中、低劑量覆盆子降低去甲腎上腺素含量的趨勢不明顯(P>0.05)。

圖2 覆盆子提取物對酒精戒斷大鼠海馬NE含量的影響 注：與空白組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01

4 討論

許多研究表明，在EPM測試中成癮的物質(zhì)包括尼古丁和乙醇，在戒斷期間可產(chǎn)生嚴(yán)重的焦慮樣行為。自發(fā)活動的增加就是一個重要的行為學(xué)指標(biāo)，暗示嚙齒類動物的焦慮樣行為[18]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，酒精戒斷大鼠可表現(xiàn)出焦慮，其在開放臂停留的時間與對照組相比較短，進(jìn)入開放臂次數(shù)也相對減少。EPM的測試結(jié)果對抗焦慮劑敏感，包括經(jīng)典的抗焦慮藥，例如安定、阿普唑侖，對EPM測試中嚙齒類動物的焦慮樣行為有抑制作用[19]。目前，藥物治療是抗焦慮的最直接治療方法[20]，然而，眾所周知的苯二氮類藥物具有很大的局限，近來中草藥在治療情緒障礙如抑郁癥和焦慮變得更受歡迎了[21]。據(jù)報道，在迷宮實(shí)驗(yàn)中酸棗仁可大大改善小鼠的焦慮行為[22]。在目前的研究中，180 mg/kg的覆盆子提取物可明顯改善酒精戒斷期間大鼠的焦慮行為，而中、低劑覆盆子提取物作用效果不太明顯，說明覆盆子提取物對焦慮樣行為的作用效果呈劑量依賴性。

與焦慮有密切關(guān)系的神經(jīng)遞質(zhì)主要是單胺類神經(jīng)遞質(zhì)，主要包括去甲腎上腺素(NA)、多巴胺(DA)、5-羥色胺(5-HT)以及它們的代謝產(chǎn)物。大腦去腎上腺素能神經(jīng)系統(tǒng)(Noradrenergic Brain Systems)與焦慮樣行為密切相關(guān)。大腦中去腎上腺素能神經(jīng)元大部分分布在藍(lán)斑(LC)，其纖維投射到大腦皮質(zhì)和多個皮質(zhì)下腦區(qū)，包括海馬、杏核體、下丘腦、背側(cè)丘腦等，該系統(tǒng)興奮過度會引起明顯的恐懼和焦慮樣行為。某些可以降低去甲腎上腺素能活動的藥物有減輕焦慮的作用[23]。根據(jù)一些動物實(shí)驗(yàn)觀察到，去甲腎上腺素可引起大鼠嗜睡，體溫下降，出現(xiàn)攝食行為。某些類型的焦慮可能與去甲腎上腺素神經(jīng)元的過度興奮相關(guān)。在焦慮患者的血液和腦脊液中發(fā)現(xiàn)去甲腎上腺素和它的主要代謝產(chǎn)物3-甲基-4-羥基苯乙二醇(MHPG)濃度升高，焦慮癥具有警覺程度增高和交感神經(jīng)活動增加的表現(xiàn)，顯示焦慮癥患者去甲腎上腺素能活動增加這種神經(jīng)解剖結(jié)構(gòu)布局有利于快速廣泛地對大腦功能實(shí)行調(diào)節(jié)，對應(yīng)激環(huán)境作出有效回應(yīng)。在正常情況下，去甲腎上腺素能神經(jīng)系統(tǒng)可使人體保持一定的警覺性水平，但在乳酸鈉、咖啡因、二氧化碳(CO2)等刺激下，該系統(tǒng)過度興奮則引起明顯的恐懼和焦慮樣行為。

本實(shí)驗(yàn)條件下觀察到地西泮和覆盆子均有降低大鼠海馬內(nèi)去甲腎上腺素含量的趨勢，提示降低海馬中NA的釋放，可能是覆盆子抗焦慮作用的重要環(huán)節(jié)之一。本研究結(jié)果顯示：與空白對照組比較，模型組大鼠海馬組織中去甲腎上腺素含量明顯升高，表明焦慮發(fā)作時腦內(nèi)去甲腎上腺素釋放增加，與模型組相比較，經(jīng)治療后陽性對照組(DZP)和覆盆子組大鼠海馬中去甲腎上腺素含量均降低，表明地西泮可減少大鼠焦慮時腦內(nèi)NE的含量，抗焦慮的作用與此有關(guān)，且提示覆盆子對大鼠海馬組織的單胺類神經(jīng)遞質(zhì)有降低作用，其抗焦慮癥的作用機(jī)制可能與降低腦內(nèi)海馬組織中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的釋放有關(guān)。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)探究覆盆子對酒精戒斷期間焦慮樣行為和海馬中NE水平的作用。覆盆子治療可緩解焦慮樣行為，改善由酒精戒斷引起的海馬中NE含量的增加。這些結(jié)果表明，覆盆子可通過使海馬中的去甲腎上腺素能神經(jīng)系統(tǒng)恢復(fù)正常來治療嚙齒類動物酒精戒斷期間的焦慮樣行為，進(jìn)一步為覆盆子治療酒精中毒提供了重要的依據(jù)，同時為研制治療焦慮癥的新藥奠定了基礎(chǔ)[24]。

[1] Tang YL,Xiang XJ,Wang XY,et al.Alcohol and alcohol-related harm in China: Policy Changes Needed[J].Bull World Health Organ,2013,91(4):270-276.

[2] Hao W,Chen H,Su Z.China: alcohol today[J]. Addiction,2005,100(6):737-741.

[3] Schulteis G,Liu J.Brain reward deficits accompany withdrawal(hangover)from acute ethanol in rats[J].Alcohol,2006,39:21-28.

[4] Kotlinska J,Bochenski M.The influence of various glutamate receptors antagonists on anxiety-like effect of ethanol withdrawal in a plus-maze test in rats[J].Eur J Pharmacol,2008,598:57-63.

[5] Lejoyeux M,Solomon J,Ades J.Benzodiazepine treatment for alcohol-dependent patients[J].Alcohol,1998,33:563-575.

[6] 陳鋒,Andrew J Lawrence,梁建輝.酒精濫用與成癮中樞神經(jīng)遞質(zhì)的研究進(jìn)展[J].中國藥物依賴性雜志,2007,16(l):5-11.

[7] 張飛燕,李晶晶,周瑩,等.安神類中藥及其有效成分對神經(jīng)遞質(zhì)鎮(zhèn)靜催眠機(jī)制的研究進(jìn)展[J].中國中藥雜志,2016,41(23):4320-4327.

[8] 鄭祖艷,朱崇霞.焦慮癥患者5-羥色胺及去甲腎上腺素水平的動態(tài)研究[J].福建中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報,2004,35(2):5-6.

[9] 陳林霖,潘娟,趙陸華,等.覆盆子藥材HPLC指紋圖譜的研究[J].中成藥,2006,28(7):937-940.

[10] 劉勁松,王剛,王國凱.覆盆子化學(xué)成分研究[J].中國中醫(yī)藥科技,2008,15(3):197-199.

[11] 洪振豐,王玉華,陳艷華.粗葉懸鉤子對實(shí)驗(yàn)性肝炎小鼠TNFα的影響[J].福建中醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2005,15(2):24-26.

[12] 葉蕻芝,洪振豐,王玉華,等.粗葉懸鉤子對實(shí)驗(yàn)性肝損傷的治療作用研究[J].中醫(yī)藥學(xué)刊,2005,23(5):829-831.

[13] Yu J B,Lu W Q,Peng H J,et al.Determination of the content of the linden tree glycosides in raspberry[J].China Pharm,2008,17(23):8-9.

[14] Guo Q L,Yang J S,Jian X L.Studies on chemical constituents in fruits of Rubus chingii[J].China Pharm J,2007,42(15):1141-1143.

[15] Coggins C R E,Sena E J,Langston T B,et al.A comprehensive evaluation of the toxicology of cigarette ingredients:Aromatic carbonyl compounds[J].Inhal Toxicol,2011,23(S1): 90-101.

[16] Tian T,Duan YF,Fuge N.Antioxidant effect of raspberry glycoprotein[J].Food Sci,2010, 31(21):357-360.

[17] Xiao F,Zhu J,Zhao L,et al.Involvement of proinflammatory and anti-inflammatory cytokines in the anti-inflammatory activity of Rubus idaeus L on LPS treated RAW 264.7 cells[J].J Chin Pharm Sci,2010(19):201-208.

[18] Lee B,Zhao RJ,Moon JY,et al.Differential involvement of GABA system in mediating behavioral and neurochemical effect of acupuncture in ethanol-withdrawn rats[J].Neurosci Lett,2008,443:13-217.

[19] Griebel G,Sanger D J,Perrault G.The use of the rat elevated plus-maze to discriminate between non-selective and BZ-1(omega 1)selective,benzodiazepine receptor ligands[J].Psychopharmacology(Berl),1996,124:245-254.

[20] Cloos JM.Ferreira V.Current use of benzodiazepines in anxiety disorders[J].Curr Opin Psychiatry,2009,22:90-95.

[21] 郭宏偉.中藥抗焦慮癥的藥理研究的現(xiàn)狀[J].中醫(yī)藥學(xué)報,2016,44(6):95-98.

[22] Rong CL,Dai YX,Cui Y.Effects of Semen Ziziphi Spinosae on the anxiety behavior of the yin deficiency mice[J].Chin Med Mat,2008,31:1703-1705.

[23] 江開達(dá).精神病學(xué)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2005:147.

[24] 溫蘋,劉明,范越.開心散合用代力新治療老年焦慮癥的臨床觀察[J].中醫(yī)藥學(xué)報，2015,43(1):111-112.