孫冠男，于雪峰，陳水林,徐軼爾，孫貴才*

(1.道外區(qū)人民醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150020;2.南昌大學(xué)第四附屬醫(yī)院，江西 南昌 330003; 3.哈藥集團藥物研究院，黑龍江 哈爾濱 150025)

豨薟草為常用中草藥，是一年生草本植物豨薟(SiegesbeckiaorientalisL)，腺梗豨薟(S.pubescensMak)或毛梗豨薟(S.glabrescensMak)的全草；又名豨薟、稀薟草、火薟、豬膏莓等。豨薟草味辛、苦、寒，具有祛風(fēng)濕、利關(guān)節(jié)和解毒之功效，主要用于治療風(fēng)濕痹癥，關(guān)節(jié)疼痛，筋骨無力，腰膝酸軟等[1]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)以豨薟草為主藥的復(fù)方豨薟草膠囊能夠明顯降低痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型大鼠血清中腫瘤壞死因子水平、明顯降低炎性因子的釋放，降低NF-κB的轉(zhuǎn)錄，明顯改善痛風(fēng)性關(guān)節(jié)癥狀[2-3]。

急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎發(fā)作是尿酸鈉(monosodium urate，MSU)微晶體在關(guān)節(jié)內(nèi)及關(guān)節(jié)周圍組織沉積引起的急性炎癥反應(yīng)，是出現(xiàn)痛風(fēng)的臨床癥狀的直接原因[4]。沉積的關(guān)節(jié)周圍的尿酸鈉微晶體在人體內(nèi)能夠與中性粒細胞、單核巨噬細胞、T淋巴細胞和關(guān)節(jié)滑膜細胞等發(fā)生反應(yīng)，釋放IL-1、IL-8和TNF-α等炎性因子，炎性因子之間相互作用進一步影響痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展[5-6]。研究發(fā)現(xiàn)最新研究發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激在急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎發(fā)生發(fā)展過程中也扮演著重要的作用[7]。大量氧自由基(ROS)和脂質(zhì)過氧化物的產(chǎn)生均能夠?qū)е玛P(guān)節(jié)的損傷，進而出現(xiàn)劇烈疼痛和功能障礙，丙二醛(MDA)是脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，含量的變化能過代表脂質(zhì)過氧化水平和對機體的損傷程度，超氧化物歧化酶(SOD)是一種超氧陰離子和氧自由基清除劑，具有明顯的抗炎癥、抗感染和抑制脂質(zhì)過氧化作用，在疾病和炎癥的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮著重要作用[8]。并且臨床研究發(fā)現(xiàn)痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎患者體內(nèi)存在SOD含量降低，是多方面因素共同影響的結(jié)果，說明SOD的表達失調(diào)參與了痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病過程[9]。

以往的研究發(fā)現(xiàn)尿酸鈉結(jié)晶沉積在關(guān)節(jié)后，能夠激活多種信號通路參與GA炎癥的發(fā)生發(fā)展，其中抗氧化能力動態(tài)失衡也是痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎發(fā)病因素之一。核轉(zhuǎn)錄因子E2相關(guān)因子2(NF-E2-relatedfactor2,Nrf2)作為重要的轉(zhuǎn)錄因子[10]，能夠與核內(nèi)ARE結(jié)合，進一步調(diào)控抗氧化基因 HO-1)表達，研究發(fā)現(xiàn)Nrf2-ARE是調(diào)節(jié)細胞內(nèi)抗氧化防御體系的重要信號通路，抵抗氧化應(yīng)激損傷方面發(fā)揮著重要的作用[11-12]。機體內(nèi)源性抗氧化信號通路最近被發(fā)現(xiàn)：Nrf2/HO-1 信號通路具有抵抗內(nèi)外界氧化和化學(xué)物質(zhì)刺激所產(chǎn)生的氧化應(yīng)激損傷，使生物體抵抗各種外來損傷中起著非常重要的作用，是生物體內(nèi)最重要的內(nèi)源性抗氧化信號通路，是現(xiàn)今氧化應(yīng)激研究領(lǐng)域的熱點內(nèi)容[13]。因此，本實驗以Nrf2/HO-1信號通路為基礎(chǔ)，探討痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展與Nrf2/HO-1信號通路之間的關(guān)系及中藥豨薟草干預(yù)機制影響。

1 材料與方法

1.1 實驗試藥與動物

豨薟草購于哈爾濱市同仁堂大藥房；青霉素和鏈霉素、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清和胰酶購于Hyclone公司， 尿酸鈉( Uric acid sodium salt，U2875-5G) 購自美國Sigma 公司；大鼠白細胞介素IL-1、白細胞介素IL-8和腫瘤壞死因子TNF-α酶聯(lián)免疫試劑盒購于美國R&D公司；ROS、SOD和MDA試劑盒購于DECO；PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成；實驗動物由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供。

1.2 滑膜細胞的分離和培養(yǎng)

將SD大鼠脫臼處死，置于75%的乙醇中浸泡15 min，沿膝關(guān)節(jié)正中縱向切開，剝離肌肉和膝蓋骨，可見平滑光亮的滑膜組織，分離滑膜組織并去除脂肪組織，用含青霉素200 kU/L和鏈霉素200 mg/L的D-Hank’s液漂洗3次，將滑膜組織用眼科剪刀剪碎1 500 r/min,離心10 min，離心洗滌2次，去除上清液，加入100 μL的FBS混勻，將混勻的滑膜組織平鋪培養(yǎng)瓶中，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)15 min，使之自然貼壁，在加入3 mL含20%FBS的DMEM培養(yǎng)液，37℃，5% CO2培養(yǎng)5～7 d，更換培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，傳代培養(yǎng)第三代用于本實驗的研究，倒置顯微鏡下觀察細胞生長狀況。

1.3 豨薟草提取物及含藥血清制備

將豨薟草藥材40℃烘干，粉碎成干粉，然后加入10倍水于80℃提取2次，每次提取30 min。過濾，棄去濾渣，合并濾液，過濾，將溶液濃縮至100 mL，離心2 000 r/min ，10 min，取上清液，將濃度調(diào)整為250 mg/mL備用。取24只SD健康大鼠，隨機分為4組，每組6只。依據(jù)《藥理實驗方法學(xué)》[14]中不同物種間給藥劑量換算公式，大鼠灌胃給予豨薟草低、中、高劑量分別為1 g/kg，2 g/kg，4 g/kg，對照組灌胃給予同體積的生理鹽水;每日分2次，連續(xù)給藥14 d。各組均于末次給藥后1 h采集靜脈血漿，室溫靜置2 h，離心，取上清，將同一組的血漿混合后56℃水浴30 min滅活補體，0.22 μm無菌濾器過濾除菌、分裝，制備高、中、低的劑量豨薟草含藥血清及大鼠空白血清。以上血清均-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 滑膜細胞中ROS、SOD和MDA測定

將第三代滑膜細胞平鋪于24孔培養(yǎng)板，待細胞融合至80%左右，加入相應(yīng)濃度的豨薟草。對照組、模型組、豨薟草高劑量組(4 g/kg)、豨薟草中劑量組(2 g/kg)和豨薟草低劑量組(1 g/kg)除對照組外各實驗組中加入尿酸鈉(0.1 mg/mL)繼續(xù)培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)結(jié)束后，棄上清液，按照DECO試劑盒說明書要求對滑膜細胞進行處理，測定滑膜細胞中ROS、SOD和MDA含量。

1.5 實時PCR檢測滑膜細胞中Nrf2、HO-1mRNA表達

將第三代滑膜細胞平鋪于24孔培養(yǎng)板，待細胞融合至80%左右，加入相應(yīng)濃度豨薟草。對照組、模型組、豨薟草高劑量組(4 g/kg)、豨薟草中劑量組(2 g/kg)和豨薟草低劑量組(1 g/kg)的滑膜細胞，除對照組外各實驗組中加入尿酸鈉(0.1 mg/mL)繼續(xù)培養(yǎng)24 h，棄上清液，PBS洗兩次，收集不同組別的滑膜細胞加入Trizol裂解液，提取總RNA，并按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明將提取的總mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，并應(yīng)用cDNA用于實時定量PCR檢測，引物序列有上海生工生物工程有限公司合成，引物序列：HO-1上游引物：5′-AGCCCCACCAAGTTCAAACA-3′，下游引物：5′-TGCCAACAGGA AGCTGA GAG-3′，Nrf2上游引物:5′-CCATTCCCAGTTACAGTGTCTT-3′, 下游引物:5′-GATCGATGAGTAAAAATGGTA′, β-actin上游引物:5′-GAGACCTTCAACAC CCCAGC-3′,下游引物:5′-CCACAGGATTCCATACCCAA-3′。

1.6 統(tǒng)計分析

采用SPSS19.0進行統(tǒng)計學(xué)分析，所有數(shù)據(jù)用χ2表示，P<0.05表示具有顯著性差異，P<0.01具有極顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 滑膜細胞形態(tài)

滑膜細胞貼壁5～7 d，在光學(xué)顯微鏡下觀察，可見組織塊周圍有少量細胞生長，細胞形態(tài)不規(guī)則，但都以長梭形為主；9～11 d，可見大量細胞生長，以長梭形細胞為主，但仍有少量圓形和多角形的細胞存在；繼續(xù)培養(yǎng)至90%細胞融合時，用胰酶消化，傳代繼續(xù)培養(yǎng)，傳至第三代可見成纖維細胞樣細胞，呈長梭形均勻分布，見圖1。

圖1 光鏡下滑膜細胞形態(tài)注：A表示培養(yǎng)5～7 d的滑膜細胞；B表示培養(yǎng)9～11 d的滑膜細胞；C表示傳至第三代的滑膜細胞

2.2 滑膜細胞中ROS、SOD和MDA含量變化

如表1所示，與對照組比較，尿酸鈉處理滑膜細胞中ROS和MDA含量明顯增加，豨薟草高、中、低組都能夠明顯降低ROS和MDA含量，且豨薟草高、中、低組均可以使SOD含量明顯升高，且呈劑量依賴性，表明豨薟草能夠抑制滑膜細胞發(fā)生氧化應(yīng)激從而起到保護滑膜細胞正常生理功能的作用。

表1 豨薟草對尿酸鈉處理滑膜細胞氧化應(yīng)激損傷影響

注:與空白組比較，#P<0.05；與模型組比較，*P<0.05

2.3 滑膜細胞中Nrf2和HO-1mRNA表達結(jié)果

如表2所示，與對照組比較，不同濃度豨薟草處理的滑膜細胞中Nrf2和HO-1 mRNA的表達明顯增加(P<0.05)，且隨著豨薟草濃度的增加Nrf2和HO-1表達也逐漸增加。

表2 豨薟草對尿酸鈉處理滑膜細胞中Nrf2 和HO-1表達影響

注：與空白組比較，#P<0.05；與模型組比較，*P<0.05

3 討論

痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎是一種以劇烈疼痛為特點的無菌性炎癥反應(yīng)，發(fā)病率逐年升高，給社會和患者帶來了嚴重的經(jīng)濟負擔，痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機制十分復(fù)雜，關(guān)節(jié)腔內(nèi)尿酸鈉析出，觸發(fā)機體固有免疫反應(yīng)，導(dǎo)致關(guān)節(jié)及周圍組織的急性反應(yīng)，但具體的發(fā)病機制還不清楚。

生理狀態(tài)下機體組織內(nèi)自由基的產(chǎn)生與消除維持在動態(tài)平衡，有效的抗氧化防御系統(tǒng)能夠使自由基的濃度控制在一定范圍內(nèi)，當機體組織過度產(chǎn)生自由基或抗氧化系統(tǒng)功能受損，機體發(fā)生氧化應(yīng)激[15]。氧化應(yīng)激損傷主要由活性氧物質(zhì)(ROS)所致，有害的活性氧自由基可通過脂質(zhì)過氧化誘導(dǎo)細胞損傷。超氧化物歧化酶(SOD)含量變化間接反映機體清除氧自由基的能力，丙二醛(MDA)是脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物，MDA含量可以表明脂質(zhì)過氧化水平，本研究發(fā)現(xiàn)不同濃度的尿酸鈉處理滑膜細胞后ROS和MDA的含量明顯增加，SOD的含量明顯降低，表明尿酸鈉誘導(dǎo)滑膜細胞發(fā)生氧化應(yīng)激。正常生理狀態(tài)下，生物體內(nèi)產(chǎn)生和消除活性氧自由基的能力處于動態(tài)平衡狀態(tài)，病理狀態(tài)下，生物體內(nèi)生成過量的活性氧自由基由此抑制抗氧化防御系統(tǒng)，繼而激發(fā)活性氧自由基的生成和消除的動態(tài)平衡受到破壞，繼而產(chǎn)生大量的活性氧，發(fā)生脂質(zhì)過氧化，改變生物大分子的結(jié)構(gòu)和功能，引起氧化應(yīng)激損傷。

當機體受到氧化應(yīng)激刺激時能夠激活Keap1-Nrf2/ARE 信號，激活下游靶蛋白表達[16]。靶蛋白被激活后調(diào)節(jié)生物體內(nèi)抗氧化能力，使體內(nèi)從氧化應(yīng)激狀態(tài)恢復(fù)到正常的生理狀態(tài)。核因子E2相關(guān)因子 2調(diào)控的目的蛋白主要有血紅素加氧酶-1(heme oxygenase-1，HO-1)、超氧化物歧化酶(superoxidedismutase，SOD)。今年研究發(fā)現(xiàn)外源性有毒的物質(zhì)和ROS能促進核因子E2相關(guān)因子 2入核。SOD是生物體中最重要的酶之一，是機體內(nèi)氧自由基的頭號殺手， SOD 與疾病的發(fā)生發(fā)展都有著密切聯(lián)系，具有抗炎、抗病毒及抗衰老等作用[17]。實驗研究表明激活的核因子E2相關(guān)因子 2能夠促進SOD的表達，從而可降低體內(nèi)的氧化應(yīng)激損傷，表明促進核因子E2相關(guān)因子2下游的抗氧化蛋白的表達，對滑膜細胞具有一定的保護作用。研究發(fā)現(xiàn)Nrf2誘導(dǎo)激活HO-1表達被認為是抗氧化應(yīng)激最重要機制之一[18]與本實驗結(jié)果相符。

本實驗研究發(fā)現(xiàn)：模型組滑膜細胞中ROS和MDA含量明顯增加，SOD含量明顯降低，豨薟草高、中、低組都能夠明顯降低ROS和MDA含量，SOD含量明顯升高； 表明豨薟草具有抗氧化作用，且可以通過調(diào)節(jié)Nrf2/HO-1通路促進下游抗氧化基因 HO-1 的表達起到抗氧化作用，從而減少氧化應(yīng)急對滑膜細胞損傷，使生物體內(nèi)產(chǎn)生和消除活性氧自由基的能力處于動態(tài)平衡狀態(tài)進而維持正?；ぜ毎砉δ堋?/p>

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