郭瀅,張艷,韓鳳娟*

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040； 2. 黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150010)

卵巢癌是女性死亡率極高的女性生殖器惡性腫瘤，嚴重的影響女性的生活，現(xiàn)在對卵巢癌的標準治療是手術(shù)加化療，但是存活率仍不樂觀，越來越多的人們開始關(guān)注靶向治療以及基因方面治療，本課題就理沖生髓飲對卵巢癌裸鼠的實驗研究其基因?qū)用妫诨蛐酒Y(jié)果分析中藥復方理沖生髓飲對卵巢癌血管生成影響及抑制腫瘤血管生成的作用機制。目前基因芯片具有信息量大、可比性強、標準化等特點，并且采用基因芯片方法篩選中藥復方有效組分作用生物學基礎(chǔ)，為臨床應(yīng)用及后續(xù)研究提供科學依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料來源

1.1.1 實驗動物

Balb/c裸鼠，雌性，40只，體質(zhì)量(15±2)g，無特定病原體級實驗動物，鼠齡4～6周，購自北京維通利華生物技術(shù)有限公司，飼養(yǎng)于黑龍江中醫(yī)藥大學藥物安全性評價中心(屬于清潔級動物實驗室隔離屏障系統(tǒng))，并且嚴格控制的裸鼠飼養(yǎng)環(huán)境。

1.1.2 細胞株

人卵巢癌SKOV3 細胞株，來自于齊氏生物科技。

1.1.3 實驗藥物以及藥物試劑

中藥復方理沖生髓飲的組成：人參30 g，仙靈脾50 g，三棱10 g，莪術(shù)10 g，鹿茸10 g，黃芪50 g，水蛭10 g，浙貝母20 g。由黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院中藥局提供。

PRMI-1640(HyClone)、胎牛血清(HyClone)、0.25%胰蛋白酶(HyClone)、二甲基亞楓(二甲基亞楓)、貝伐單抗(瑞士羅氏制藥公司)、實時定量PCR試劑盒購自Thermo;STAT3兔抗人多克隆抗體、CD34兔抗人多克隆抗體和beta-actin兔抗人多克隆抗體Vegf兔抗人多克隆抗體均購自武漢三鷹公司、JAK2兔抗人多克隆抗體購自于Abcam;辣根酶標記山羊抗兔IgG(H+L)來自美國 中杉金橋(Zb-2301);免疫組化檢測試劑盒購自北京中山生物技術(shù)有限公司。

1.1.4 主要儀器

掃描儀、雜交爐、程序降溫儀、研究級倒置顯微鏡、2100振蕩器、PCR儀、離心機、電熱恒溫培養(yǎng)箱、CO2細胞恒溫培養(yǎng)箱、-70℃低溫冰箱、SDS電泳儀、紅外微定量分析、生物組織包埋機、轉(zhuǎn)輪式組織切片機。

1.2 實驗方法

1.2.1 有效組分的提取

理沖生髓飲有效組分由黑龍江中醫(yī)藥大學藥學院藥理研究室人員提取供給。提取方法[1]：稱取一定處方量中藥復方，分別進行超臨界萃取獲得組分Ⅰ，組分Ⅱ是用藥渣經(jīng)過75%乙醇浸泡，加熱回流提取液，將其蒸干；組分Ⅲ由濾渣繼續(xù)經(jīng)蒸餾水加熱回流獲得濾液，經(jīng)95%乙醇達到醇沉，上清蒸干獲得；最后收集沉淀，干燥后獲得組分Ⅳ。

保存方法是將提取組分Ⅰ密封在-20℃保存，有效組分Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ密封在干燥室溫保存待用。中藥復方理沖生髓飲提取有效組分由：9.9 g組分Ⅰ、33.69 g組分Ⅱ、4.05 g組分Ⅲ以及12.5 g組分Ⅳ組成，混合在一起應(yīng)用于動物實驗研究。各組劑量為，中藥高劑量組：11.28 g/(kg·d)，中藥中劑量組：7.52 g/(kg·d)，中藥低劑量組:3.76 g(/kg·d)。

1.2.2 卵巢癌細胞株SKOV3的培養(yǎng)

細胞懸浮培養(yǎng)于含10%胎牛血清、青霉素和鏈霉素各100 U/mL 的RPMI-1640培養(yǎng)液中，置于37 ℃、飽和濕度5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔2～3 d傳代。取對數(shù)生長期細胞進行造模。

1.2.3 卵巢癌裸鼠模型建立及評估

建立裸鼠應(yīng)用1 mL的無菌注射液，皮下肌注造模方法，將SKOV-3單細胞懸液0.1 mL注射于裸鼠左上肢以及右上肢腋下疏松部位。

待造模成功，對裸鼠每日的食量以及飲水情況進行觀察，需要記錄小鼠的腫瘤標本體積，隔日一測。計算方法為：V=(a×b2)/2(a為長徑，b為短徑)。

模型評估：皮下腫瘤長至直徑3 mm時即為造模成功；分離2只裸鼠皮下腫瘤，進行病理分析評估造模是否成功。

1.2.4 分組及給藥

將裸鼠隨機分為模型組(生理鹽水)和中藥中劑量組，每組8只。以中劑量7.52 g/(kg·d)劑量灌胃給藥，連續(xù)給藥21 d，觀察裸鼠的變化。

1.2.5 實驗取材及觀察指標

斷頸處死，分離皮下卵巢癌腫瘤組織，凍存管分裝，快速置于液氮中保存，并且留取部分組織固定在中性福爾馬林液中。

1.2.6 基因芯片檢測中藥治療后差異表達基因

在空白對照組與中藥中劑量組中隨機選取4個腫瘤組織標本，應(yīng)用人4×180KAffymetrix OElncRNA芯片技術(shù)的方法，對組織樣本進行檢測和分析。

1.2.7 數(shù)據(jù)采集和標準化

雜交芯片掃描得到原始圖像。再利用AGCC軟件技術(shù)。將原始數(shù)據(jù)導入Expression Console軟件，應(yīng)用RMA算法可以進行標準化分析。

1.2.8 統(tǒng)計方法

基因表達分析使用Genespring軟件。差異基因進行GO和KEGG富集分析，利用T檢驗進行篩選。

2 實驗結(jié)果

2.1 理沖生髓飲有效組分用藥后差異基因篩選

芯片雜交后的原始圖像采用Affymetrix GeneChip Command Console軟件處理，將原始數(shù)據(jù)，用Expression Console軟件其芯片進行了gene level的標準化。再采用Genespring軟件進行基因表達分析。講差異基因通過T檢驗的P值和倍數(shù)變化值進行篩選，篩選出以標準為上調(diào)或者下調(diào)倍數(shù)變化值≥2.0且P值≤0.05。

MicroRNA芯片初步篩選差異基因的結(jié)果提示上調(diào)基因3個，下調(diào)9個，共有12個表達差異的基因(見表1)。

2.2 聚類分析結(jié)果

將差異microRNA應(yīng)用非監(jiān)督層次聚類。計算多個樣品兩者之間的距離，用挑選的差異microRNA的表達情況計算樣品的相關(guān)性，并且用Heatmap展示結(jié)果如圖1顯示。

圖1 兩組間的差異基因非監(jiān)督層次聚類

圖2 GO分析

從差異基因中篩進行兩組間的非監(jiān)督層次聚類，計算差異基因中兩兩之間的距離，將其構(gòu)成距離矩陣，合并距離最近的兩類為一新類，并且計算出新類和當前各類的距離，再進行合并和計算，以此方法直到只有一類為止，再用Heatmap展示，可以見到兩組間有明顯不同的表達譜。

結(jié)果顯示：與模型組比較，顯示中藥復方理沖生髓飲組差異表達基因上調(diào)的13個，下調(diào)的47個。

2.3 GO分析

將差異基因進一步進行GO分析，是描述基因主要影響的生物學功能，并用統(tǒng)計檢驗的進行計算，觀察靶基因富集性。結(jié)果見圖2。

2.4 Pathway分析

通過靶基因Pathway進行分析，得到富集靶基因Pathway 條目，再應(yīng)用KEGG數(shù)據(jù)庫對進行pathway的分析，統(tǒng)計pathway條目的差異基因顯著性的差異(用P值代表)，結(jié)果見圖3。

圖3 Pathway分析

從實驗結(jié)果上對用中藥復方理沖生髓飲作用后的基因差異表達顯示可能涉及的信號通路有27條信號通路，但是再進一步GO分析和pathway分析結(jié)合的結(jié)果可以看出最終影響卵巢癌的差異基因主要的存在的生物學途徑集中在JAK-STAT信號通路，HIF-1信號通路，NF-κB信號通路；TNF信號通路；t細胞受體信號通路；BAG信號通路；干擾素調(diào)節(jié)因子以及一些趨化因子上，并且相關(guān)的差異通路具體作用如下見表2。

3 討論

基因芯片又被稱為DNA微陣列或DNA芯片, 應(yīng)用已知核酸序列與互補的靶序列雜交,根據(jù)雜交信號進行定性與定量分析，專門用于核酸檢測的生物芯片,目前的研究中主要是將“疾病-正?！钡牟町惢虻谋磉_進行分析和比較，而中藥往往是由于所含有效成分復雜及作用機制多靶點、多途徑的雙重復雜性的特點,目前研究中重點是將中藥復方的成分理清，將中藥復方組成的分子配體與靶點(疾病)間存在的復雜關(guān)系(如“一對多、多對一”)理清，這是目前研究中藥作用機制的關(guān)鍵，并且這種復雜關(guān)系制約了中藥復方的國際化發(fā)展。故本課題團隊在中藥復方研究中,采用了以基因芯片技術(shù)為基礎(chǔ)的基因表達差異比較,在理沖生髓飲有效組分的提取下，我們又將中藥復方的有效組分與基因表達差異相結(jié)合，觀察理沖生髓飲是否能改變基因的某個差異表達，甚或者是對通路的某位點或趨化因子有改變，對基因表達進行研究,為中藥復方作用機制提供有效依據(jù)[2-3]。

表2 差異信號通路的主要作用

我們篩查的結(jié)果上可以看出，中藥復方理沖生髓飲在作用靶點上可以通過以上幾個通路，并且有8條差異信號通路與卵巢癌的血管生成有密切關(guān)系，對血管生成，細胞活化，以及參與細胞侵襲和轉(zhuǎn)移上均有一定的作用，在對中藥分子配體與靶點間的“一對多、多對一”的復雜關(guān)系網(wǎng)絡(luò)研究體系下，我們可以看出，中藥復方理沖生髓飲能夠改變應(yīng)用后卵巢癌組織的相關(guān)通路，這正是目前我們研究中藥復方理沖生髓飲的作用機制研究的關(guān)鍵。鑒于基因表達譜芯片主要用于研究轉(zhuǎn)錄水平上基因的變化，可以證實理沖生髓飲參與卵巢癌的細胞再生以及轉(zhuǎn)移通路，并且是對JAK-STAT信號通路下調(diào)的作用，NF-κB轉(zhuǎn)錄因子的負向調(diào)節(jié)作用，利用基因芯片的技術(shù)來闡明中藥復方理沖生髓飲有效組分在疾病以及藥物或者其它因素的干擾下，其基因的表達差異情況，應(yīng)用生物信息學技術(shù)分析差異基因，進一步明確致病基因或藥物的作用靶點[8]，為我們在今后的實驗過程中，可以更加有說服依據(jù)，在這些差異基因的表達下進行更進一步研究，找到理沖生髓飲作用于卵巢癌的機，為臨床提供更有利的生物學基礎(chǔ)。

[1] 王艷宏,尚冬雪,李洋,等.HPLC-DAD法同時測定理沖生髓飲中7種親脂性成分[J].中成藥,2015,37(8):1713-1717.

[2] Kortylewski M，Yu H．Role of Stat3 in suppressing antitumor immunity[J]．Curr Opin Immunol，2008(20)228-233．

[3] Yu H，Pardoll D，Jove R．STATs in cancer inflammation and immunity: a leading role for STAT3[J]．Nat Rev Cancer，2009(9):798-809.

[4] Laskov R, Berger N, Scharff MD, et al. Tumor necrosis factor-alpha and CD40L modulate cell surface morphology and induce aggregation in Ramos Burkitt’s lymphoma cells[J].Leuk Lymphoma,2006,47(3):507-519.

[5] 陳明紅,李美欣,劉寶琴,等.BAG3蛋白Ser187位點磷酸化誘導人甲狀腺癌FRO細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[J].中國生物化學與分子生物學報,2015,31(11):1213-1219.

[6] 孫銀華,張瑞,裴善良.基因表達差異比較在中藥研究中的應(yīng)用[J].中國實用醫(yī)藥,2009,4(30):218-220.

[7] 楊義強,王春艷.基因芯片技術(shù)在藥學研究中的應(yīng)用[J].齊魯藥事,2009,28(5):293-295.

[8] 劉慶山,陳小玉,莊述娟.基因表達譜芯片技術(shù)進展及其在中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學研究中的應(yīng)用[J].時珍國醫(yī)國藥,2014,25(2):502-504.